桃果实生长素结合蛋白ABP1的克隆及表达分析

ABP1是一种能够快速响应生长素信号的结合蛋白,参与细胞伸长、质膜极化、网格蛋白内吞及果实发育等生理过程。以‘24号’桃果实为试验材料,应用荧光实时定量PCR分析PpABP1在桃果实发育过程中的表达量变化,以及外施NAA对桃果实PpABP1表达量的影响。结果表明:PpABP1在桃果实中果皮和种子不同发育时期均有表达,花后52dPpABP1表达量均达到最大值;外施NAA对桃果实发育过程中PpABP1表达量的影响与发育时期相关,在桃果实硬核期,外施NAA会降低PpABP1在中果皮的表达。本试验初步证实桃果实发育过程中存在由ABP1介导的信号转导途径,PpABP1在桃果实中的表达存在发育特异性。     

桃果实生长素结合蛋白ABP1的组织定位及蛋白表达分析

【目的】生长素几乎参与调控植物发育的各个方面。生长素信号转导存在由ABP1（auxin binding protein 1）介导的途径,ABP1作为一种生长素快速响应蛋白参与调控果实发育等生理过程,其主要存在于正在发育的胚及胚的周围组织中。本文旨在研究ABP1是否参与桃果实发育过程,探讨其分布与表达特点,为进一步研究桃果实发育机制奠定理论基础。【方法】以‘24号’桃果实为研究对象,测定其生长曲线以确定果实发育的3个典型时期。分离不同发育时期的中果皮、内果皮和种子,切块后,一部分样品放入EDAC溶液抽真空后进行戊二醛和多聚甲醛固定,固定后的样品经脱水和浸蜡处理后用于石蜡切片;另一部分样品液氮速冻后-80℃保存提取蛋白。制备效价较高的ABP1兔源多克隆抗体,应用免疫组织化学定位技术对自然发育状态下不同发育时期桃果实种子和中果皮中ABP1进行定位分析;应用Western blot技术分析桃果实中果皮、内果皮和种子中ABP1的表达情况。【结果】根据桃果实生长曲线,将发育时期分为3个时期,即第一次快速生长期、硬核期和第二次快速生长期。免疫组织化学定位结果表明,同一发育时期ABP1在种子的不同部位都有分布,且分布信号差异不明显。在种子发育的各时期,ABP1在种子的不同部位都有分布,主要分布在种子的内外种皮细胞以及种皮内维管组织周围的细胞中,且在观测的发育时期内,ABP1的信号强弱没有明显变化。在种子内、外种皮之间的细胞层中会出现零散的、呈带状分布的ABP1信号。而在中果皮发育的整个时期,ABP1只在硬核期维管组织周围的细胞中有明显分布。Western blot结果表明,中果皮中ABP1的表达在果实第一次快速生长期开始（盛花后41 d）及第二次快速生长期开始（盛花后76 d）时的表达量最高,在盛花后39 d的表达量最低。种子中ABP1的表达量要高于中果皮与内果皮。【结论】ABP1在果实内的分布与表达水平存在组织和发育时期的差异性,ABP1因子参与了生长素对桃果实发育的调控过程。     

叶面喷施钾肥对霞脆桃果实品质及KUP基因表达的影响

以霞脆桃为材料,研究了叶面喷施钾肥对果实品质的影响及果实发育中K~+动态平衡与KUP家族基因表达水平之间的联系。结果表明:喷施钾肥显著增加了霞脆桃的鲜质量和体积大小,改善了果皮着色指标,提高了果实可溶性固形物和可溶性糖含量,有效提升了桃果实品质,并有效增强了果实发育不同时期果肉的钾素营养状况;桃KT/HAK/KUP家族基因在桃果实发育不同时期的表达水平存在差异,PpeKUP1基因在霞脆桃整个果实发育期的表达水平最高,其次是PpeKUP5和PpeKUP3,而PpeKUP14～PpeKUP16在果实发育不同时期均没有检测到表达量; PpeKUP1、PpeKUP2和PpeKUP7在转录水平上对喷施钾肥处理最为敏感,其表达水平与对照相比,在第2次果实膨大期(75 DAFB)至达到商业成熟度时(95 DAFB)均显著增强。     

草莓几丁质酶基因FaChi1-FaChi4的转录特性及其对干旱胁迫、外施脱落酸及灰霉菌的响应

为研究草莓中几丁质酶基因的转录特性及其在果实中对生物及非生物胁迫的响应,以"阿尔比"草莓为试验材料,运用实时荧光定量PCR技术对4个几丁质酶基因FaChi1-FaChi4在果实发育过程及不同器官中的表达情况及其对生物及非生物胁迫的响应情况进行研究。结果表明:1)FaChi4主要在果实中表达,在转色期和红熟期有2个表达峰,它在果实发育与成熟过程中的表达水平显著地高于FaChi1-FaChi3。此外,FaChi1主要在营养器官中表达,其中在叶中的表达量最高;FaChi2主要在叶中表达;FaChi3在各个器官中的表达量均相对较低。2)干旱胁迫及灰霉菌处理后,果实中FaChi1-FaChi4的表达均被诱导。外施脱落酸处理可诱导FaChi2与FaChi4的表达。以上结果说明:FaChi1-FaChi4在草莓果实发育过程中有不同的表达模式且具有器官特异性,其中FaChi4是在果实中表达的主要基因;FaChi1-FaChi4在果实对生物及非生物胁迫的响应中有一定的调节作用。     

黄瓜异戊烯基转移酶基因(CsIPT2)的克隆及特征分析

为了分析黄瓜异戊烯基转移酶基因(CsIPT2)在果实发育不同模式中的转录变化以及对不同激素的转录应答情况,对CsIPT2基因进行了克隆和序列分析,再利用荧光定量PCR技术分析该基因在黄瓜单性结实自交系EC1和非单性结实自交系8419s-1果实发育过程中的表达情况,并分析了CsIPT2对不同激素的应答反应。结果表明:CsIPT2基因全长843 bp,共编码280个氨基酸,蛋白空间结构模型与蛇麻IPT蛋白极其相似。该基因不仅在授粉后的黄瓜果实发育中表达量上调,而且在黄瓜天然单性结实前期和人工诱导的单性结实后期表达量均有增加,推测该基因在促进黄瓜果实发育过程中发挥着重要作用,同时也可能参与了黄瓜单性结实的调控过程。GA、ET、6-BA、ABA和NAA 5种激素都能够诱导该基因的上调表达。其中GA处理后3 h基因表达量最高,ET、6-BA、ABA和NAA诱导的表达峰值出现在处理后6 h。随着NAA处理浓度的增加基因的表达量上调幅度增大。     

生长素结合蛋白ABP1基因在棉纤维伸长中的功能

以‘湘杂棉14’为材料,采用RT–PCR方法克隆了棉花ABP1基因全长cDNA序列。序列全长792 bp,与GenBank中陆地棉ABP1基因序列的同源性为99%。半定量分析表明,该基因在棉花叶、花及纤维中都有表达,其中叶中的表达量最高,花和纤维中的表达量稍低。ABP1基因在纤维快速伸长期表达水平较高,纤维发育的其他时期的表达水平较低。将ABP1基因cDNA构建成棉花ABP1过表达载体,并以NPT II作为选择标记,经农杆菌介导转化棉花,获得了6株Kan抗性植株,其中3株ABP1表达水平提高。ABP1过表达植株生长发育正常,但纤维长度变化不显著,说明ABP1棉纤维细胞中提高表达水平对其细胞伸长没有显著作用。     

黄肉桃果实八氢番茄红素脱氢酶基因的克隆及表达分析

利用基因克隆技术获得桃果实八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)的全长核苷酸序列,命名为PpPDS。PpPDS全长2 056bp,编码区长度1 722bp,共编码573个氨基酸。进化树分析发现PpPDS与杏果实PaPDS、草莓FaPDS亲缘性较高。蛋白质序列分析表明PpPDS含有二核苷酸[NAD(H)/NADP(H)或FAD(H)]结合基元,其处于NAD(P)-binding Rossmann-like保守结构域内。实时荧光定量PCR结果显示,PpPDS基因在黄肉品种‘金丽’桃果实发育过程中均有表达,且在果肉中的表达普遍高于果皮。果实处于硬核期的PpPDS基因在果实中的表达显著高于软核果时期,随后其表达处于较高水平并呈平缓趋势。本研究对桃果实PpPDS基因的克隆及表达分析为研究桃果实类胡萝卜素生物合成分子机理奠定了良好的基础。     

桃果实PpARF1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】为了探讨转录因子ARF1(Auxin Response Factor)对桃果实发育调控的机制。【方法】以‘24号’桃果实为试验材料,构建桃ARF1基因的原核表达载体pET32a-PpARF1,转化到BL21(DE3)中诱导表达菌体蛋白,筛选出重组蛋白的最适表达条件,按照最适条件大量摇菌诱导表达蛋白,并进行重组蛋白的纯化,最后用纯化诱导后的重组蛋白制备多克隆抗体及WB检测。【结果】SDS-PAGE电泳检测得到pET32a-PpARF1重组蛋白的位置大约在95.0kD,在37℃,转速250r/min,IPTG 0.10mmol/L,诱导4h,诱导出的蛋白表达量最大。免疫印迹试验显示所得抗血清能很好检测到目的蛋白。【结论】ARF转录因子参与生长素调控桃果实发育成熟的过程。     

枣果实糖组分含量动态变化与相关基因表达分析

以新疆3个主栽枣品种(骏枣、灰枣及冬枣)在不同发育时期的果实为试验材料,采用高效液相色谱法测定了在果实发育过程中糖组分含量的变化,并应用实时荧光定量PCR法对12个糖代谢关键基因的表达量进行了分析。试验结果表明:3个品种在果实发育过程中糖组分含量的变化规律大致相同,主要糖组分均为果糖、葡萄糖和蔗糖,前期以果糖和葡萄糖积累为主,蔗糖在后期占据主导地位;不同品种中各基因表达量的变化趋势存在一定差异。相关性分析结果显示:基因ZjSPS1对枣果实中蔗糖和还原糖的积累都具有一定的调控作用,与还原糖的积累相关性更强;ZjSS3和ZjSUC2的表达促进了枣果实中还原糖的积累;ZjHK3的表达在还原糖的积累中起抑制作用;ZjvINV1、ZjvINV2和ZjSUC3的低表达在一定程度上促进了蔗糖的积累。     

枣果实糖组分含量动态变化与相关基因表达分析

以新疆3个主栽枣品种(骏枣、灰枣及冬枣)在不同发育时期的果实为试验材料,采用高效液相色谱法测定了在果实发育过程中糖组分含量的变化,并应用实时荧光定量PCR法对12个糖代谢关键基因的表达量进行了分析.试验结果表明:3个品种在果实发育过程中糖组分含量的变化规律大致相同,主要糖组分均为果糖、葡萄糖和蔗糖,前期以果糖和葡萄糖积累为主,蔗糖在后期占据主导地位;不同品种中各基因表达量的变化趋势存在一定差异.相关性分析结果显示:基因ZjSPS1对枣果实中蔗糖和还原糖的积累都具有一定的调控作用,与还原糖的积累相关性更强;ZjSS3和ZjSUC2的表达促进了枣果实中还原糖的积累;ZjHK3的表达在还原糖的积累中起抑制作用;ZjvINV1、ZjvINV2和ZjSUC3的低表达在一定程度上促进了蔗糖的积累.     

番木瓜果实中芥子酶基因组织差异表达和酶活性研究

检测了番木瓜果实3个发育时期（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）的果皮（外果皮）、果肉（内果皮）及种子中芥子酶的活性,并通过RT-PCR分析CpTGG1、CpTGG2和CpTGG3三个番木瓜芥子酶基因在番木瓜果实各组织的差异性表达情况。结果表明,番木瓜果皮及种子中均有明显的芥子酶活性,但在果肉中无法检测出芥子酶活性;成熟后（Ⅲ期）番木瓜果皮的芥子酶活性相比未成熟前提高了6.6倍,而不同发育时期种子中的芥子酶并不表现出显著差异性。RT-PCR分析结果表明,番木瓜芥子酶基因在番木瓜果实中的表达存在显著时空差异性。其中,CpTGG1在番木瓜果皮及种子中均有表达,且表达量无明显差异,在果肉中完全无表达;CpTGG2在番木瓜果实的各个组织中均无表达;CpTGG3在果皮及种子中也均有表达,成熟果皮（Ⅲ期）和Ⅰ期种子中表达量比较强,并随着果实的发育成熟而呈现梯度变化。     

蟠桃与圆桃果实4种内源激素含量差异分析

以龙1-2-3、龙1-2-4、龙1-2-6、北京晚蟠桃、96-2-51、96-2-43各3份蟠桃和圆桃为试验材料,利用间接酶联免疫法(ELISA)测定果实顶部和中部中果皮生长素(IAA)、细胞分裂素(ZR)、赤霉素(GA_3、GA_4)4种植物内源激素的含量;以中蟠桃10号和中桃红玉为试验材料,研究果实发育过程中内源激素的含量变化。结果表明,多数圆桃果实IAA、GA_4含量显著高于蟠桃,且3份圆桃种质果实顶部的GA_4含量明显高于中部;同一时期,圆桃、蟠桃果实的ZR、GA_3含量基本无差异;较其他激素而言,在整个发育期果实IAA含量相对较高。IAA、GA_4对蟠桃、圆桃果实发育及果形形成具有非常重要的影响。     

‘西拉’葡萄果实发育过程中糖代谢相关基因的表达分析

为了分析‘西拉’(Syrah)葡萄果实转色期至成熟期的发育过程中可溶性糖的积累与糖代谢相关基因表达量的关系,以山西临汾地区‘西拉’葡萄5个发育时期的果实为试材,测定葡萄果实发育过程中还原糖、总酸以及葡萄果皮酚类物质的质量分数,并利用实时荧光定量RT-PCR的方法,分析果实发育过程中蔗糖转运蛋白、单糖转运蛋白以及糖代谢相关酶(蔗糖合酶、蔗糖磷酸合酶和转化酶)等15个基因的表达量以及可溶性糖(葡萄糖和果糖)质量分数的变化趋势。结果表明:葡萄糖、果糖质量分数随着果实发育逐渐增加,己糖转运蛋白合成基因 VvHT1表达量呈逐渐下降的趋势,在果实发育的后期下降较快; VvHT2和 VvHT5表达量呈逐渐上升的趋势; VvHT3和VvMSA的表达量呈"降-升-降"的趋势,两者的表达量均在花后71 d最高。蔗糖运输蛋白(VvSUC11,VvSUC12,VvSUC27)合成基因的表达模式在发育过程中存在差异,VvSUC11和VvSUC12表达水平上调,VvSUC27呈下调的表达趋势。蔗糖转运蛋白、转化酶和单糖转运蛋白等的协同表达促进‘西拉’葡萄果实中可溶性糖的积累,在‘西拉’葡萄果实发育过程中发挥着重要的作用。     

甜樱桃MYB转录因子基因的克隆与表达分析

本研究利用转录组测序结果,通过RT-PCR从甜樱桃品种‘美早’果实中克隆出1个MYB转录因子基因,将其命名为PaMYB10,Gen Bank登录号为ALH21137.1。该基因编码的氨基酸序列具有R2和R3保守结构域,属于R2R3-MYB家族基因,与蔷薇科的桃、欧李、梅等作物亲缘关系较近。qRT-PCR结果表明,PaMYB10在红色品种‘美早’的茎、叶、花和果实中均有表达,但表达量存在差异,在成熟果实中表达量最高。‘美早’中花青苷含量随着果实的发育逐渐升高,PaMYB10的表达显著上调;‘13-33’中花青苷含量随着果实的发育变化不明显,基因表达量变化也不明显。在果实发育后期,‘美早’果实中花青苷含量和PaMYB10的表达量均显著高于‘13-33’。推测PaMYB10的高水平表达可能与红色甜樱桃果实花青苷积累有关。     

ABP1参与BY2细胞生长素响应的Ca2+信号转导过程

将Ca2+响应实时荧光报告系统引入雌二醇诱导生长素结合蛋白(ABP1)调控表达的BY2细胞中,获得了 ABP1过表达(ABP1-ox)、抑制表达(ABP1-anti)同时对Ca2+标记的几个BY2细胞株.对这些细胞株进行雌二醇诱导调控其ABP1过表达或抑制表达后,分析ABP1的表达量,并通过在细胞外添加IAA处理,实时观察ABP1调控表达后细胞的Ca2+信号变化.结果表明:ABP1-ox细胞在雌二醇诱导后细胞内ABP1表达量显著提高,细胞经IAA处理后,细胞膜内、核膜周围均有迅速而强烈的荧光信号,说明ABP1过表达后细胞能快速响应胞外的IAA作用,将信号转导到细胞内,使细胞质内Ca2+信号迅速增强;而ABP1-anti细胞经雌二醇诱导后,细胞内ABP1表达显著下调,细胞经IAA处理后,相对于对照,细胞内的荧光信号微弱且呈点状,细胞核附近的荧光不明显,说明细胞内Ca2+信号的转导受到抑制.这证明BY2细胞中ABP1参与生长素信号与细胞内Ca2+响应的信号转导过程.     

NAA和TDZ对黑莓果实发育和主要活性成分的影响

用2 mmol/L NAA和0.1 mmol/L TDZ处理黑莓品种"Chester"青果期果实,比较其对果实成熟进程中生长发育及主要活性成分的影响.结果表明,果实经NAA和TDZ处理21 d后均开始转色成熟,较对照果实延迟3 d,至24 d时均完全成熟.与对照果实相比,NAA处理后果实横径、纵径增大,单果质量增加,而花色苷、可溶性固形物和总多酚含量均低于对照.TDZ处理果实与对照相比表现为成熟果实横径、纵径减小,单果质量降低,花色苷含量降低,总多酚含量变化不显著.因此,外施NAA和TDZ均可使"Chester"果实成熟延迟,果实花色苷含量下降,而NAA可使成熟果实增大,果实活性成分积累减少;TDZ处理抑制了果实发育,对果实活性成分积累无明显影响.     

一个苹果山梨醇转运子基因家族新成员的克隆及其表达分析

【目的】克隆一个苹果山梨醇转运子基因(命名为ST)的全长cDNA,为进一步研究该基因的功能奠定基础。【方法】利用RT-PCR法从苹果叶片中克隆ST基因,应用相关软件对其进行生物信息学分析;并采用实时荧光定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)法,分析ST在苹果不同组织中以及在果实发育过程中的表达情况。【结果】获得了1个包含全长开放阅读框的ST基因,该基因cDNA全长1 767 bp,包含长达1 617 bp的完整开放阅读框,该基因所编码的蛋白与GenBank中已登录的其他植物山梨醇转运子的同源性均在72%以上,其中与苹果山梨醇转运子MdSOT5的同源性较高,为81%。Real-time RT-PCR结果表明,在不同组织中,ST在韧皮部的相对表达量最高,其次在衰老叶、成熟叶、叶柄中较高,在库器官花、幼叶、果实、果柄、根中表达较低;在果实不同发育时期,ST基因表达量在果实发育早期很低,花后30 d快速升高并达到峰值,在发育中期保持一个较高的表达水平,在果实发育后期相对表达量又降低,之后略呈递增趋势。【结论】从苹果叶片中克隆了ST基因,生物信息学分析可知ST具有糖转运功能;ST在韧皮部的表达量最高,说明其负责长距离运输;ST在果实发育过程中的表达量与山梨醇的含量变化相一致。     

桃果实ζ-胡萝卜素脱氢酶基因克隆及表达分析

[目的]克隆桃果实ζ-胡萝卜素脱氢酶基因(PpZDS)的全长序列,并对其进行生物信息学及表达分析,为研究桃果实类胡萝卜素生物合成的分子机理提供参考.[方法]从黄肉品种桃果实中克隆PpZDS基因,对其进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其在桃果实不同成熟期的表达情况.[结果]克隆获得的PpZDS基因全长2014 bp,具有完整的编码区,长度为1716 bp,编码571个氨基酸.PpZDS蛋白含有ZDS特征序列(KVAIIGA-GLAGMSTAVELLDQGHEVDIYESR),属于NAD_binding_8超级家族保守结构域.PpZDS蛋白与同为蔷薇目的苹果(gi|33313474)和草莓(gi|256041892)的ZDS蛋白亲缘关系较近,物种间分化程度较小.整个桃果实成熟期PpZDS基因在果肉和果皮中均有表达,从软核期至硬熟期均呈逐渐升高趋势,硬熟期达最高,完熟期降低;不同桃果实发育期果肉中的PpZDS基因表达量均大于果皮中表达量,其中硬核期、硬熟期和完熟期的桃果实中PpZDS基因在果肉中的表达量显著高于果皮中的表达量(P<0.05).[结论]PpZDS基因表达对桃果实类胡萝卜素生物合成及呈色发挥正向调控作用.     

超表达生长素合成基因YUCCA1对草莓果实成熟的影响

为分析超表达生长素(IAA)合成基因YUCCA1对草莓果实成熟进程的影响。以‘甜查理’草莓(Fragaria×ananassa Duch.)果实为试验材料,通过外源喷施IAA,分析IAA对草莓果实发育成熟的影响,利用qPCR测定了果实发育过程中YUCCA1表达量,克隆了草莓YUCCA1,获得了其超表达的草莓果实,测定了YUCCA1超表达后果实的生理及分子指标。随着草莓果实成熟IAA含量下降,外源喷施IAA能延迟果实的成熟,并影响了果实着色、软化和香气代谢等生理和分子指标,而IAA运输抑制剂三碘苯甲酸(TIBA)则能促进果实成熟。草莓IAA合成基因YUCCA1在果实发育前期表达量高,后期表达量急剧下降,在成熟期几乎检测不到。在草莓果实中超表达YUCCA1延迟了果实的成熟进程,增加了果实内源IAA、叶绿素含量和果实硬度,但是降低了花色素和脱落酸(ABA)含量,而IAA运输抑制剂TIBA能解除超表达YUCCA1对果实发育的抑制作用。IAA参与了草莓果实的发育成熟调控,负调控了果实成熟进程,可延缓果实衰老。     

不同肉质型桃果实成熟过程中乙烯生物合成相关基因的表达差异

[目的]本文旨在研究不同肉质型桃果实在成熟过程中乙烯生物合成相关基因的表达及品质差异,为深入揭示果实软化机制及成熟度的准确判断提供理论依据。[方法]以软溶质型桃‘雨花露’‘霞晖5号’和‘奉化玉露’,硬溶质型桃‘霞晖6号’‘湖景蜜露’和‘霞晖8号’,Stonyhard型桃‘霞脆’‘华玉’和‘秦王’,不溶质型桃‘弗雷德里克’‘金童8号’和‘金童9号’的果实为材料,比较研究3个成熟度(七、八、九成熟)果实的乙烯释放规律,并利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术分析与乙烯生物合成相关的基因表达水平的差异。[结果]桃果实硬度随着成熟度的增加逐渐降低,七、八、九成熟果实呼吸速率始终保持在较高的水平,且九成熟果实呼吸速率均高于七、八成熟果实。RT-qPCR结果表明,随着成熟度的增加,溶质型桃果实的PpACS1基因表达与果实乙烯释放速率保持高度一致,且乙烯释放量较高的九成熟果实中PpACS1基因均具有较高表达丰度,而Stonyhard型桃PpaACS1基因表达水平极低;PpACS4基因在不同肉质型桃果实中随成熟度递增表达上调,且溶质型桃果实基因表达量显著高于Stonyhard型桃;PpACO1基因在不同肉质型桃果实中均有表达,其表达水平随果实成熟度递增有所差异,且果实基因的表达丰度主要集中在八成熟果实中;PpACS2、PpACS3、PpACS5基因在桃果实成熟过程中几乎不表达。[结论]溶质型(软溶质、硬溶质和不溶质)桃果实在成熟过程中主要通过调节与乙烯生物合成相关的PpACS1、PpACS4、PpACO1基因的表达水平,进而控制桃果实的成熟软化;Stonyhard型桃果实由于基因表达水平受抑制,果实在成熟过程中一直维持较高的硬度。