水曲柳结构域重新甲基化酶DRM基因片段的克隆及同源性分析

[目的]克隆并分析水曲柳结构域重新甲基化酶（DRM）基因片段.[方法]根据GenBank上已发表的DRM氨基酸序列,采取CODEHOP方法设计合成1对简并引物,采用RT-PCR技术对水曲柳DRM基因进行扩增,将PCR产物与pMD 18-T连接后转化至E.coli JM109感受态细胞,检测阳性克隆,测序并进行序列分析.[结果]克隆得到的DRM基因cDNA序列长802 bp,由267个氨基酸残基组成,命名为FmadrmA.序列比对表明FmadrmA与参考的12个物种的DRM在氨基酸水平上表现出较高的同源性,其与山葡萄、番茄、黄瓜、野草莓、大豆、苜蓿、玉米、烟草、拟南芥、毛果杨、水稻和乌拉尔图小麦的DRM同源性分别为61％、54％、51％、50％、60％、48％、43％、44％、37％、42％、42％和39％.系统进化树分析表明同源的DRM蛋白可大致聚为3类,而水曲柳与其他植物的亲缘关系较远.[结论]该试验成功获得了水曲柳FmadrmA基因片段,并对其进行了同源性分析,为进一步研究结构域重新甲基化酶基因及分析其表达特性奠定了基础.     

水曲柳节律相关GIGANTEA基因的克隆及同源性比对分析

[目的]对水曲柳节律相关GIGANTEA基因的克隆及同源性进行比对分析。[方法]根据GenBank中GI基因保守结构域设计简并引物,进行PCR分析,并与其他物种的氨基酸序列进行同源性比对分析。[结果]获得了编码区780 bp的部分序列,可以编码260个氨基酸,获得的GI基因命名为FmGI,与多个物种GI基因有着较高的同源性,其中与葡萄、大豆、苜蓿、毛果杨、蓖麻、黄瓜、菊花、大麦、玉米、小麦、拟南芥、黑麦草、洋葱和云杉等多个物种具有较高一致性。系统发育树分析结果表明,GI基因按照单子叶植物、双子叶植物和裸子植物的进化关系聚为3类,明确了水曲柳GI基因的系统进化关系。[结论]该方法对水曲柳生物节律钟GI基因编码区进行了克隆,并对获得的部分GI蛋白序列进行了同源性比对分析,建立了系统进化树,为进一步获得水曲柳GI基因全长及研究其功能起到一定参考作用。     

小麦-黑麦1BL/1RS易位系99/2439中蛋白激酶基因的克隆

[目的]克隆和分析小麦受体蛋白激酶基因片段。[方法]对经白粉菌诱导24 h的小麦-黑麦1BL/1RS易位系99/2439叶片中cDNA进行5′-RACE,获得小麦受体蛋白激酶基因的部分片段,并分析其蛋白质序列同源性。[结果]通过RACE获得了长度为1 708bp的小麦受体蛋白激酶基因片段。该片段的氨基酸序列(S1125)与基因Lrk19在641个氨基酸跨度内有86%相同,91%相似。S1125与小麦抗锈病基因Lrk10在636个氨基酸跨度内有84%相同,88%相似。S1125可能为丝氨酸-苏氨酸激酶。[结论]所克隆的小麦蛋白激酶基因片段与Lrk19基因和小麦抗锈病基因Lrk10具有较高的同源性。     

地黄肌动蛋白基因片段的克隆与序列分析

[目的]克隆与分析地黄肌动蛋白基因片段。[方法]根据与地黄相近物种肌动蛋白基因序列的保守区设计兼并引物,通过RT-PCR方法扩增地黄编码区肌动蛋白基因。[结果]扩增片段全长为724 bp,对应编码240个氨基酸。序列比对分析发现其与其他高等植物肌动蛋白基因核苷酸序列同源性在80%以上,氨基酸序列在90%以上。[结论]系统进化分析表明,扩增到的地黄肌动蛋白基因与烟草actin7基因有较近的亲缘关系。     

何首乌查尔酮合成酶基因的克隆及序列分析

[目的]克隆何首乌查尔酮合成酶基因并作序列分析。[方法]以cDNA序列的保守区域设计引物,以何首乌 （ Polygonum multiflorum Thunb.）为材料,根据其他植物查尔酮合成酶（Chaleone synthase,CHS）基因eDNA序列的保守区域设计引物,利用RT-PCR和3＇-RACE进行克隆。[结果]从何首乌叶cDNA中克隆出了长度为1258bp的基因片段。序列分析表明,该片段具有典型的CHS基因家族的结构域,为何首乌的CHS基因片段,命名为PmCHS。将得到的序列提交GenBank,序列号为FJ601685。对获得的PmCHS的氨基酸序列进行比较分析,发现PmCHS含有Phe215,推测其能够催化聚酮的合成反应。何首乌CHS与其他植物CHS的氨基酸序列的进化分析表明,其与同为蓼科的虎杖和掌叶大黄的同源性较近。[结论]何首乌查尔酮合成酶基因的成功克隆为蓼科植物中蒽醌的基因工程等研究打下了良好的基础。     

Sus scrofa interferon epsilon-1基因的克隆与序列分析

[目的]克隆分析Sus scrofa interferon epsilon-1基因,以期为其生物学功能研究奠定基础。[方法]利用Homo sapiens interferon epsi-lon 1(IFNE1)序列(NM_176891.3)对猪HTG库进行搜索,通过对获得的2个片断(CU074336、AC127471)的序列分析,在5'-UTR和3'-UTR设计1对克隆引物,对7日龄仔猪的胃组织进行RT-PCR,将PCR产物克隆、测序,并进行相关分析。[结果]同源性分析结果表明,猪SIFNE1与人、小鼠interferon epsilon-1基因cDNA编码区(CDS)的同源性分别为83.6%和69.2%;蛋白序列同源性分别为76.2%和55.2%。推测其氨基酸序列信号肽为第1～21位氨基酸,IFabd结构域为第59～176位氨基酸,结构特征与人、小鼠的interferon epsi-lon-1相一致。[结论]该研究克隆了Sus scrofa interferon epsilon-1基因,为进一步研究SIFNE1基因的生物学功能奠定了基础。     

柑橘类植物SOD基因片段的克隆和SNP分析

[目的]对柑橘类植物遗传多样性进行精确分析研究。[方法]根据已报道的各种植物Mn/Fe-SOD基因的氨基酸序列上前后2个保守区设计1对简并引物,采用RT-PCR技术,分别从岭南沙田柚、柠檬等6种柑橘类植物中克隆得到长426bp的Mn/Fe-SOD基因片段,并对所得序列进行了SNP分析。[结果]柑橘类植物核苷酸同源性高达97.2%,与其他植物Mn/Fe-SOD基因核苷酸序列的同源性都在77.7%以上;经过氨基酸序列推导,每个基因片段分别编码142个氨基酸,6个基因片段的氨基酸同源性为97.9%,与其他植物Mn/Fe-SOD基因的氨基酸序列同源性在79.0%以上。在Mn/Fe-SOD基因片段中有18个核苷酸位点存在SNPs,导致3个氨基酸位点发生变异,多态性频率为1SNP/23.7bp,核苷酸变异度为4.23%,氨基酸变异度为2.38%。[结论]该研究为丰富构建柑橘类植物基因图谱标记和抗逆性状的遗传标记奠定了基础。     

水稻不育系系谱抗稻瘟病基因同源序列的克隆与序列分析

根据已知NBS-LRR类抗病基因结构中氨基酸的保守区域设计简并引物,对水稻不育系系谱NBS-LRR类抗病基因同源序列进行克隆、测序和聚类。同源序列克隆与分析表明,7个水稻不育系系谱亲本中共获得14个阳性克隆,其中11个含有NBS-LRR类抗病基因所特有的保守氨基酸结构域KinaseⅠ、KinaseⅡ、KinaseⅢ及跨膜区域。这些片段间同源性最高达98.3%,最低仅为29.7%;11个氨基酸片段与抗病基因Xal(AB002266)的同源性较高,42%-45%的氨基酸序列相同,59%-64%的氨基酸序列相似,且与水稻其他NBS-LRR类抗性蛋白相似性很高。通过聚类分析,可以将其分为3类,分别记为G1、G2、G3,并发现抗源谷农13所含有的G3类基因,通过天谷、福伊传给后代谷丰、全丰。     

番茄γ-生育酚甲基转移酶基因的克隆与分析

[目的]为进一步研究γ-生育酚甲基转移酶(TMT)基因的功能奠定基础。[方法]以拟南芥γ-TMT cDNA为信息探针,在GenBankdbEST数据库中搜索与其高度同源的番茄EST序列,通过人工序列拼接得到番茄γ-TMT的cDNA序列。据此拼接序列设计1对特异引物,以番茄叶片cDNA第1链产物为模板进行RT-PCR,回收目的片段,转化到大肠杆菌DH5α进行TA克隆。最后对获得的阳性克隆进行测序,分析测序结果与其他物种中该基因之间的同源性,进行氨基酸序列比对及系统进化分析。[结果]经RT-PCR扩增出1300bp左右的片段,成功克隆了番茄γ-TMT基因。克隆片段全长1354bp,包含1个1089bp的完整开放读码框,与拼接序列完全一致。番茄γ-TMT基因编码的氨基酸序列与马铃薯、小麦、玉米和拟南芥的γ-TMT基因的同源性分别达89%、75%、75%和70%。系统进化分析表明,番茄与马铃薯的γ-TMT基因有较近的亲缘关系。[结论]该试验中克隆的番茄γ-TMT基因编码的蛋白质分子量为39.8kD,等电点为8.28。     

薄壳山核桃MADS-box基因保守片段的克隆与序列分析

[目的]克隆薄壳山核桃MADS-box基因的保守片段,进行系统发育分析,为研究薄壳山核桃花发育相关MADS-box家族基因及其发育的分子机理奠定基础.[方法]以薄壳山核桃品种‘马罕’雄花花序为材料,提取总RNA反转录cDNA,采用RT-PCR克隆MADS-box基因的保守片段,并将其推导氨基酸序列与已知拟南芥的MADS-box家族基因进行系统发育分析.[结果]分离获得28条MADS-box基因的cDNA片段,片段长度均为137 bp,包含基因起始密码子,核苷酸序列同源性为65.7%~98.5%,其推导氨基酸序列中有11个存在差异.系统发育树分析结果表明,这些基因片段分别归入拟南芥MADS-box基因不同亚家族中,包含ABCDE模型中的各类基因.[结论]薄壳山核桃中存在多种MADS-box家族基因,克隆的片段包含ABCDE模型中的各类花发育基因.     

塞内加尔鳎Survivin基因的电子克隆与生物信息学分析

[目的]克隆分析塞内加尔鳎的Survivin基因。[方法]利用生物信息学手段克隆塞内加尔鳎Sunvivin基因的全长cDNA序列,并对其序列进行分析。[结果]结果表明,该cDNA序列包含444bp的开放阅读框,编码147个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,塞内加尔鳎Survivin氨基酸序列与半滑舌鳎、斑马鱼、非洲爪蟾、鸡、小鼠和人Surivin氨基酸序列具有较高的同源性。[结论]该研究结果为进一步研究塞内加尔鳎的Survivin基因提供基础。     

青蒿鲨烯合酶cDNA的克隆与序列分析

[目的]对青蒿鲨烯合酶进行cDNA克隆,并进行序列分析。[方法]根据GenBank上已发表的鲨烯合酶cDNA基因序列设计1对特异性引物,提取青蒿细胞总RNA,运用RT-PCR扩增出鲨烯合酶基因。将其与pMD19-T载体连接,并对克隆片段序列进行分析。[结果]SS基因全长1257bp,编码418个氨基酸;同源性分析表明,青蒿SS基因序列与人参、积雪草、金铁锁、大豆、辣椒、百脉根、远志、玉米、褐家鼠、小鼠以及人相应序列的同源性分别为77.21%、76.11%、75.66%、74.62%、73.83%、74.46%、73.03%、64.39%、52.22%、50.51%和50.12%;氨基酸同源性分别为79.43%、79.00%、75.84%、79.43%、77.27%、77.27%、77.03%、66.03%、40.65%、40.19%和40.09%。[结论]青蒿鲨烯合酶cDNA的成功克隆,为进一步研究SS基因结构、基因表达与调控提供了重要依据。     

高邮麻鸭白细胞介素-2基因的克隆与序列分析

[目的]对高邮麻鸭白细胞介素-2（CIL-2）基因进行克隆和序列分析。[方法]以高邮麻鸭外周血淋巴细胞提取的总RNA为模板,根据已发表的鸭IL-2基因cDNA序列设计并合成1对引物,应用两步RT-PCR技术扩增出IL-2基因的特异性片段。将扩增片段插入pGEM-T-easy载体,并进行测序分析和结果验证。[结果]阳性克隆所含插入片段的DNA序列全长为433bp,与预期大小一致,含有1个423bp大小的开放性阅读框,共编码141个氨基酸的前体蛋白,N端21个氨基酸形成信号肽,成熟蛋白为120个氨基酸,分子量约为13.66kD,含1个糖基化位点。该序列与绿头鸭、绍兴鸭、固始鸭相应序列的同源性均为99.8%,与广州白鸭的同源性为99.3%,存在少量核苷酸差异。[结论]高邮麻鸭IL-2编码区基因相对高度保守,为其用于临床疾病治疗提供了一定参考。     

牙鲆Toll样受体1基因全长cDNA的克隆及特征分析(英文)

[目的]克隆牙鲆TLR1(Toll like receptors)全长基因,并对其结构特征和表达规律进行分析。[方法]采用同源克隆和快速扩增cDNA末端技术,从牙鲆头肾组织中克隆出TLR1基因cDNA全长序列,并对该基因进行生物信息学和表达模式分析。[结果]牙鲆TLR1基因cDNA全长2947bp,开放阅读框(ORF)2418bp,编码805个氨基酸,包括26个氨基酸组成的信号肽、2个跨膜区、6个富含亮氨酸重复结构域(LRR)和一个TIR结构域(Toll/interleukin(IL)-1receptor)。该蛋白的分子量为91.15kDa,等电点为6.49。氨基酸序列同源性分析显示,牙鲆TLR1基因与其他脊椎动物的TLR1基因序列全长同源性达到69%~35%,TIR序列的同源性达到84%~62%。在系统发生树上牙鲆的TLR1基因首先与斜带石斑鱼聚类。通过荧光定量qRT-PCR检测,结果显示牙鲆TLR1基因的mRNA主要表达于肝脏、心脏和脾脏等组织。[结论]该研究结果为进一步研究TLR1基因的功能和开发牙鲆免疫增强剂奠定了基础。     

葱蝇ADH基因的克隆及序列分析

[目的]对葱蝇(Delia antiqua)ADH基因进行克隆,并对其进行序列分析。[方法]通过RACE的方法克隆葱蝇ADH基因的cDNA序列,同时对该序列进行同源性分析、氨基酸序列比对和系统发育分析。[结果]试验获得的cDNA全长1 088 bp,其中ORF 771 bp,编码256个氨基酸,推测其相对分子质量为30.80 kDa,等电点为8.22;通过该基因推导的氨基酸序列与其他物种的ADH进行相似性比较和系统发育分析,发现葱蝇与刺舌蝇(Glossina morsitans)氨基酸序列的同源性最高。[结论]该研究为ADH基因的进一步研究提供了基础。     

牙鲆Toll样受体1基因全长cDNA的克隆及特征分析

[目的]克隆牙鲆TLR1(Toll like receptors)全长基因,并对其结构特征和表达规律进行分析。[方法]采用同源克隆和快速扩增cDNA末端技术,从牙鲆头肾组织中克隆出TLR1基因cDNA全长序列,并对该基因进行生物信息学和表达模式分析。[结果]牙鲆TLR1基因cDNA全长2 947 bp,开放阅读框(ORF)2 418 bp,编码805个氨基酸,包括26个氨基酸组成的信号肽、2个跨膜区、6个富含亮氨酸重复结构域(LRR)和一个TIR结构域(Toll/interleukin(IL)-1 receptor)。该蛋白的分子量为91.15 kDa,等电点为6.49。氨基酸序列同源性分析显示,牙鲆TLR1基因与其他脊椎动物的TLR1基因序列全长同源性达到69%～35%,TIR序列的同源性达到84%～62%。在系统发生树上牙鲆的TLR1基因首先与斜带石斑鱼聚类。通过荧光定量qRT-PCR检测,结果显示牙鲆TLR1基因的mRNA主要表达于肝脏、心脏和脾脏等组织。[结论]该研究结果为进一步研究TLR1基因的功能和开发牙鲆免疫增强剂奠定了基础。     

南瓜基因CmNAC的克隆与序列分析(英文)

[目的]克隆南瓜基因CmNAC并进行序列分析。[方法]以南瓜叶片为材料,根据甘蓝型油菜NAC1、番茄NAC和辣椒NAC保守结构域设计一对简并引物,采用RT-PCR方法扩增得出长度约为440bp大小的DNA片段,将其克隆至pMDl9-T载体上,对重组克隆进行测序,用BLAST和DNAMAN软件对核酸及氨基酸序列进行分析。[结果]所获得的南瓜NAC基因片段由442个碱基组成,编码147个氨基酸,命名为CmNAC;该基因片段具有其它植物NAC基因中存在的保守区,并且属于NAC家族中ATAF1/2亚家族。[结论]实验拟在南瓜中获得和抗逆性相关的NAC基因,为进一步研究该基因的生物学功能和植物基因工程奠定理论基础。     

1个新的牛干扰素-τ基因的克隆与分析

[目的]克隆和分析沈阳地区黄牛中1个新的IFN-τ基因。[方法]根据NCBI上发表的的牛IFN-τ基因序列(AY665673),设计并合成1对特异性引物。从黄牛的肾脏组织中提取基因组DNA作为模板,进行PCR扩增。将扩增产物回收后,与pUCm-T载体连接并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞。通过PCR和双酶切对获得的质粒进行鉴定后,进行测序和序列分析。[结果]经PCR扩增,获得1条约600 bp的特异性条带。牛IFN-τ基因成功重组到载体中,获得阳性克隆。序列分析结果表明,该克隆片段大小为586 bp,其在376 bp处出现了终止密码子,导致翻译终止。该片段与AY665673基因序列的核苷酸同源性为93.3%,氨基酸同源性为88.1%。[结论]该克隆片段可能为1个新的牛IFN-τ基因。     

元宝枫CHS基因片段的克隆及序列分析（英文）

[目的]对元宝枫叶片查尔酮合成酶(CHS)基因片段进行克隆及序列分析。[方法]以元宝枫的红叶新品系1~6号为试材,采用CTAB法提取其夏季与秋季叶片总RNA,搜索Gen Bank数据库中已报道的CHS基因序列,BLAST比对,然后用DNAMAN、Primerpremier5软件设计兼并引物来扩增其目的片段,采用RT-PCR方法扩增CHS基因片段并连接到p MD18-T载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。[结果]得到一段1 365 bp的序列,序列分析表明,该片段编码365个氨基酸,与鸡爪槭、毛果槭的查尔酮合成酶(CHS)基因核苷酸序列同源性在90%以上。[结论]该研究首次从元宝枫中克隆出了CHS基因,为有效利用该基因奠定了基础。     

吉林株犬新孢子虫SAG1基因片段的克隆及蛋白抗原性预测

[目的]对犬新孢子虫SAG1基因进行克隆与序列分析。[方法]从细胞培养的吉林株虫体中提取犬新孢子虫DNA,根据已发表的犬新孢子虫鲥G1基因的核苷酸序列,设计并合成1对特异性引物,采用PCR技术,扩增大新孢子虫SAG1基因片段,并成功克隆到pMD18-T simple载体上,对经PCR、酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列分析。[结果]对犬新孢子虫SAG1基因进行克隆后,获得阳性重组质粒。克隆的SAG1基因片段长780bp,编码260个氨基酸,与已发表的美国株犬新孢子虫SAG1基因核苷酸序列（AF132217）的同源性为99．0％,氨基酸序列同源性为98．8％。通过分子生物学软件对翻译水平进行预测,发现吉林株核苷酸序列并不影响氨基酸翻译与蛋白质的表达。[结论]该试验成功克隆重组质粒,为建立犬新孢子虫的高效表达系统奠定了基础。