侧金盏花CBF转录激活因子基因片段的克隆

[目的]探索CBF转录激活因子基因在侧金盏花中是否存在。[方法]以侧金盏花基因组DNA为模板,根据拟南芥CBF基因序列的保守区设计1对特异性引物,通过PCR扩增获得1个DNA片段,将其克隆到pUCm-T载体中,转化大肠杆菌TG1,筛选阳性克隆并对其进行测序鉴定。[结果]测序结果显示通过PCR扩增获得的基因片段长448 bp。在GenBank中检索,该序列与从拟南芥和其他作物中克隆的CBF同源基因序列同源性较低,说明是一个新的基因片段,初步认定该片段是侧金盏花CBF基因片段。[结论]该研究为进一步克隆侧金盏花CBF转录激活因子基因全长序列、鉴定其生物学意义奠定了基础。     

亚洲猫β-干扰素基因的克隆与分析

[目的]为猫干扰素类生物制品的研究奠定基础。[方法]根据NCBI上的猫IFN-β基因序列,设计1对特异引物。以从病死猫肝脏组织中提取的基因组DNA为模板,进行PCR扩增。将扩增产物回收后,与pUCm-T载体连接,并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞。通过PCR和双酶切对获得的质粒DNA进行鉴定后,进行序列分析和核苷酸、氨基酸序列同源性的比较。[结果]经PCR扩增,可获得一条561 bp的特异性条带。猫IFN-β基因已成功重组到载体中,获得阳性克隆。序列分析结果表明,亚洲猫IFN-β基因长561 bp,编码186个氨基酸,与已报道的猫IFN-β基因同源性达99.82%,而氨基酸序列未改变。[结论]该研究成功克隆了猫IFN-β基因,为进一步利用基因工程技术生产重组猫IFN-β基因及其生物学功能的研究奠定了基础。     

绵羊甘露聚糖结合凝集素的研究

[目的]为了研究绵羊甘露聚糖结合凝集素(MBL)基因。[方法]以陶塞特羊全血基因组DNA为模板,参考GenBank上牛与人的MBL基因序列合成一对特异性引物,进行PCR扩增,并经回收重组到pBS-T载体,筛选阳性克隆。用DNAMAN软件将部分测序结果同已发表的牛和人MBL序列进行同源性比较,并通过Primer Premier5进行蛋白质氨基酸序列预测。[结果]经PCR扩增获得了549bp的特异性片段。部分测序结果同牛和人MBL序列的同源性分别高达97%和86%,且该DNA序列与牛MBL部分序列编码的氨基酸仅一个之差,证实该序列为绵羊MBL基因的部分序列。[结论]绵羊MBL基因序列的获得,不仅为绵羊MBL基因全序列的获得提供了依据,还有助于进一步揭示MBL的生理和病理功能,对绵羊优良品种的选育具有深远意义。     

牛分枝杆菌MPB64基因的克隆及序列分析

以牛分枝杆菌ValleeⅢ染色体DNA为模板,以MPB64成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增,获得了642 bp的DNA片段。通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM-T载体。经鉴定证实,成功地构建了pGEM-T-64克隆载体。序列分析结果表明:该基因序列与Mycobacterium bovis BCG Tokyo的MPB64成熟蛋白基因序列同源性为100%。     

牛SRY基因的克隆与测序

以牛基因组DNA为模板,在一对特异性引物的引导下,利用PCR技术成功地扩增了牛SRY基因。纯化回收目的片段,克隆到pMD 18-T载体上,筛选阳性克隆测序,得到SRY基因两端的序列(5′端641 bp,3′端786bp)。与网上公布的牛SRY基因序列进行同源性比较,结果显示,牛SRY基因长度为2 713 bp,克隆的5′和3′端2个片段与网上公布的牛SRY基因序列对应片断的同源性分别为98.7%和98.1%。     

豆豉纤溶酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

[目的]为豆豉纤溶酶的进一步研究与应用奠定基础。[方法]以从芽孢杆菌中提取的总DNA为模板,根据GenBank的豆豉纤溶酶基因(AY720895.2)DNA序列设计1对引物,克隆豆豉纤溶酶基因并进行序列测定。构建毕赤酵母表达载体pL3,在毕赤酵母中表达豆豉纤溶酶基因。[结果]经PCR扩增可获得约1.1 kb的DNA片段。序列分析表明所克隆DNA片段包含1个1089 bp的开放阅读框,编码363个氨基酸。该克隆基因与所发表的豆豉纤溶酶基因序列的核苷酸序列同源性为98%,而氨基酸序列同源性达100%。[结论]所克隆的豆豉溶纤酶基因在毕赤酵母中成功表达,且表达产物具有正常的生物学活性。     

牛脂联素cDNA全基因序列的克隆

[目的]体外克隆牛脂联素基因的编码全序列。[方法]以成牛尾部脂肪的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得牛脂联素基因cDNA的全序列,将其克隆到原核表达载体PMD18-T中,筛选出阳性克隆,提取重组质粒,通过限制性内切酶酶切鉴定和重组质粒PCR鉴定后对其进行测序。[结果]从牛尾部脂肪组织总RNA中扩增得到671bp的目的条带,该cDNA序列与GenBank中牛脂联素基因序列同源性为100％,其氨基酸同源性也达到100％,确定为目的基因。[结论]该研究为进一步研究牛脂联素基因的功能和研究牛脂联素基因的表达与育肥牛的脂肪代谢的关系提供了试验基础。     

宁乡猪生长激素基因的克隆及其原核表达载体的构建

[目的]研究了宁乡猪生长激素基因(nxGH)的克隆及其原核表达载体的构建。[方法]根据已报道的猪生长激素基因序列设计了1对特异性引物,应用RT"PCR技术从宁乡猪脑垂体中克隆了nxGH编码区序列。[结果]扩增片段全长651 bp,共编码216个氨基酸。该序列与已报道的三元和五指山猪生长激素cDNA基因核苷酸序列同源性为99.85%。将nxGH cDNA序列定向插入pET"32a原核表达载体中,成功构建重组原核表达质粒pET"GH。[结论]为下一步制备宁乡猪生长激素抗体奠定了基础。     

橡胶树乳管表达HbHMGR1基因双元表达载体构建与鉴定

[目的]克隆橡胶树乳管特异性强启动子HEV2.1(PHEV2.1),构建天然橡胶生物合成途径关键限速酶基因(HbHMGR1)的乳管特异性植物表达载体,为橡胶树遗传转化奠定基础.[方法]根据已报道的HEV2.1序列(GenBank登录号AY247789.1)设计1对特异引物,采用PCR从橡胶树热研7-33-97基因组DNA中克隆PHEV2.1,与HbHMGR1基因融合构建橡胶树乳管特异性植物表达载体,并以PCR和限制性内切酶酶切进行鉴定.[结果]用特异引物可从热研7-33-97基因组DNA中扩增获得1852bp的PHEV2.1片段,其与AY247789.1启动子序列的同源性为98.6%.将PHEV2.1与HbHMGR1基因融合构建乳管特异性植物表达载体pCAMBIA230 1-PHEV2.1-HbHMGR1,经PCR和限制性内切酶酶切鉴定证明植物表达载体构建成功.[结论]将PHEV2.1和HbHMGR1基因先构建到pCAMBIA3301载体上再克隆至pCAMBIA2301载体上,能有效解决直接克隆至pCAMBIA2301载体上出现PstⅠ突变、阻碍载体构建的难题,成功构建获得乳管特异性植物表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR.     

黑曲霉中国株(3.758)葡萄糖氧化酶(GOD)基因的克隆与结构分析

[目的]为充分开发黑曲霉在轻工业中的用途。[方法]以黑曲霉中国株(3.758)基因组DNA为模板,用LATaqDNA聚合酶对葡萄糖氧化酶(GOD)基因进行PCR扩增,扩增片段纯化后与pUCm-T载体连接后,转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,经琼脂糖凝胶电泳法、酶切和PCR鉴定获得阳性克隆。对获得含GOD基因的克隆进行测序,分析其蛋白质氨基酸序列及限制性内切酶的图谱。[结果]经PCR扩增获得约1.8kb的片段。获得的GOD基因编码序列共1818bp,与报道的黑曲霉(ATCC9029)GOD基因序列仅有3个碱基之差。该基因序列具有多个限制性内切酶位点。黑曲霉不同菌株与中国株(3.758)GOD基因的同源性比较表明,不同黑曲霉菌株中GOD基因不同,而菌株ATCC9029与菌株NRRL-3是同一菌株。[结论]该研究获得了GOD基因的全长序列,为GOD的生物工程生产和相关植物基因工程奠定了基础。     

元宝枫CHS基因片段的克隆及序列分析

[目的]对元宝枫叶片查尔酮合成酶(CHS)基因片段进行克隆及序列分析.[方法]以元宝枫的红叶新品系1～6号为试材,采用CTAB法提取其夏季与秋季叶片总RNA,搜索GenBank数据库中已报道的CHS基因序列,BLAST比对,然后用DNAMAN、Primerpremier5软件设计兼并引物来扩增其目的片段,采用RT-PCR方法扩增CHS基因片段并连接到pMD18-T载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序.[结果]得到一段1 365 bp的序列,序列分析表明,该片段编码365个氨基酸,与鸡爪槭、毛果槭的查尔酮合成酶(CHS)基因核苷酸序列同源性在90％以上.[结论]该研究首次从元宝枫中克隆出了CHS基因,为有效利用该基因奠定了基础.     

3种食用菌漆酶活性比较及其基因的克隆与序列分析

[目的]研究食用菌漆酶基因的差异以及漆酶的活性。[方法]利用编码杏鲍菇漆酶基因序列（GenbankNo．AY686700）设计特异性引物,采用PCR方法获得3种典型木腐食用菌（杏鲍菇、平菇、白灵菇）漆酶的基因序列。[结果]扩增得到的片段长度均为2606bp,通过对基因序列的内含子／外显子分析,获得漆酶编码区的cDNA,该基因的开放阅读框由1596个核苷酸组成,编码一个由531个氨基酸组成的多肽。3种食用茵漆酶基因的核苷酸序列、氨基酸序列同源性均为99．81％,说明漆酶的一级结构序列具有很高的保守性。[结论]序列的差异性、氨基酸跨膜区的不同及蛋白质的构象不同可能导致漆酶活性的高低。     

吉林株犬新孢子虫SAG1基因片段的克隆及蛋白抗原性预测

[目的]对犬新孢子虫SAG1基因进行克隆与序列分析。[方法]从细胞培养的吉林株虫体中提取犬新孢子虫DNA,根据已发表的犬新孢子虫鲥G1基因的核苷酸序列,设计并合成1对特异性引物,采用PCR技术,扩增大新孢子虫SAG1基因片段,并成功克隆到pMD18-T simple载体上,对经PCR、酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列分析。[结果]对犬新孢子虫SAG1基因进行克隆后,获得阳性重组质粒。克隆的SAG1基因片段长780bp,编码260个氨基酸,与已发表的美国株犬新孢子虫SAG1基因核苷酸序列（AF132217）的同源性为99．0％,氨基酸序列同源性为98．8％。通过分子生物学软件对翻译水平进行预测,发现吉林株核苷酸序列并不影响氨基酸翻译与蛋白质的表达。[结论]该试验成功克隆重组质粒,为建立犬新孢子虫的高效表达系统奠定了基础。     

延边黄牛白细胞介素2的基因克隆和序列分析

为建立延边黄牛白细胞介素2（IL-2）的基因克隆和序列分析的合理方法体系进行该研究．采集1月龄犊牛静脉血,用密度梯度离心法获取白细胞层,对白细胞进行总RNA的提取,并构建cDNA文库,根据Genbank牛IL-2基因序列（登录号：M12791．1）设计1对特异性引物,用反转录PCR（RT-PCR）技术扩增出目的基因片段,与克隆载体PMD18-T连接,并进行PCR和酶切鉴定,酶切结果为阳性的进行序列分析．结果表明：PCR扩增出大小为261bp的部分IL-2基因片断,与预期的片段大小一致;此序列与Genbank上牛IL-2从141～401bp片段的同源性为100％．     

番茄脯氨酸脱氢酶基因的克隆与RNAi植物表达载体的构建

[目的]克隆了脯氨酸脱氢酶ProDH基因的全长cDNA,构建了ProDH基因的RNA干扰植物表达载体,并转化到农杆菌.[方法]以“耐运2000番茄”幼苗为试材,根据GenBan中公布的番茄脯氨酸脱氢酶ProDH基因的序列信息设计了一对特异性引物,克隆了该基因的全长cDNA,分析基因序列选择正反向片段并扩增,并通过酶切、连接的方法构建了ProDH基因的RNA干扰植物表达载体PBI121-PDHi利用冻融法将表达载体转化到农杆菌EHA105中.[结果]所克隆到的ProDH基因片段长2 001 bp,其中CDS为1 491 bp,编码380个氨基酸.测序结果与公布序列同源性100％,因此可以用来构建干扰载体;通过酶切与测序鉴定,证明表达载体构建成功.[结论]经特异性引物扩增检测,证明表达载体已转入农杆菌,为进一步的研究该基因奠定了基础.     

元宝枫CHS基因片段的克隆及序列分析（英文）

[目的]对元宝枫叶片查尔酮合成酶(CHS)基因片段进行克隆及序列分析。[方法]以元宝枫的红叶新品系1~6号为试材,采用CTAB法提取其夏季与秋季叶片总RNA,搜索Gen Bank数据库中已报道的CHS基因序列,BLAST比对,然后用DNAMAN、Primerpremier5软件设计兼并引物来扩增其目的片段,采用RT-PCR方法扩增CHS基因片段并连接到p MD18-T载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。[结果]得到一段1 365 bp的序列,序列分析表明,该片段编码365个氨基酸,与鸡爪槭、毛果槭的查尔酮合成酶(CHS)基因核苷酸序列同源性在90%以上。[结论]该研究首次从元宝枫中克隆出了CHS基因,为有效利用该基因奠定了基础。     

鹅细小病毒野毒的分离及VP3基因的克隆及序列分析

试验对吉林省农安县某鹅场发现的疑似鹅细小病毒病进行了野毒的分离与鉴定,并以鹅细小病毒标准毒B株染色体DNA为模板,对VP3成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增,获得了1603bp的DNA片段。通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pMD18-T克隆载体。经鉴定证实,成功地构建了pMD18-T-VP3克隆载体。序列分析结果表明,该基因序列与鹅细小病毒标准毒B株的VP3成熟蛋白基因序列同源性为98%。     

山核桃FLOWERING LOCUST同源基因的克隆与序列分析

根据不同植物FLOWERING LOCUST（FT）同源基因序列的保守区,设计合成1对长度为18bp的PCR简并引物,以山核桃基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出长度为152bp的DNA片段,克隆到pMD19-T载体上。测序及序列分析结果表明,扩增所获得的片段序列为FT基因第四外显子部分序列,不含内含子,推测共编码50个氨基酸;其序列在GenBank中注册号为FJ858260．1,同源性比对结果表明,其氨基酸序列与其他植物FT基因的同源性高达88％～96％。     

PRRSV Hn-1/06株GP5蛋白基因的克隆及表达载体的构建

[目的]克隆PRRSVHn-1/06株GP5蛋白基因并构建其原核表达载体。[方法]根据PRRSV美洲株ATCC-VR2332的ORF5基因序列设计特异性引物,用RT-PCR方法从Hn-1/06株中扩增得到GP5蛋白基因的片段,与PTG19-T载体连接获得其阳性克隆PTG19-T-ORF5。以该基因片段为模板分别设计ORF5完整序列和删除信号肽的ORF5序列两条引物,进行PCR扩增,将目的片段与原核表达载体pET32a连接,并对其进行酶切鉴定。[结果]扩增得到GP5蛋白基因全长序列603 bp,编码200个氨基酸残基;具有3个潜在的N-糖基化位点和9个半胱氨酸;分子量为22.4 kD,等电点为8.550;双酶切pET32a-ORF5鉴定,结果与预期一致,证实重组质粒构建成功。[结论]成功构建了PRRSVHn-1/06株GP5蛋白基因的表达载体,为深入研究GP5蛋白的本质与功能及其致病性奠定基础。     

牛BRY基因的分子克隆及序列分析

以荷斯坦奶牛、西门塔尔牛和甘南牦牛为观测对象,利用Y染色体上特异性序列BRY基因进行性别预测,并对其进行PCR扩增、分子克隆及序列分析;最后以牛基因组DNA为模板,利用牛BRY基因作为雄性特异性基因,ZFX/ZFY作为内标基因进行双重PCR.结果表明:公牛可获得长度约为300 bp和445 bp两条扩增带的PCR产物,母牛则仅获得1条长度约为445 bp的PCR产物,与实际性别完全相符,说明该基因可用于牛的性别预测.对BRY-PCR产物克隆测序,得到300 bp的BRY基因部分核苷酸序列,与GenBank上登录的牛和绵羊的同源性序列进行比对发现,同源性都高于87.0%,表明哺乳动物的BRY基因具有高度保守性,种间差异很小.