1个新的牛干扰素-τ基因的克隆与分析

[目的]克隆和分析沈阳地区黄牛中1个新的IFN-τ基因。[方法]根据NCBI上发表的的牛IFN-τ基因序列(AY665673),设计并合成1对特异性引物。从黄牛的肾脏组织中提取基因组DNA作为模板,进行PCR扩增。将扩增产物回收后,与pUCm-T载体连接并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞。通过PCR和双酶切对获得的质粒进行鉴定后,进行测序和序列分析。[结果]经PCR扩增,获得1条约600 bp的特异性条带。牛IFN-τ基因成功重组到载体中,获得阳性克隆。序列分析结果表明,该克隆片段大小为586 bp,其在376 bp处出现了终止密码子,导致翻译终止。该片段与AY665673基因序列的核苷酸同源性为93.3%,氨基酸同源性为88.1%。[结论]该克隆片段可能为1个新的牛IFN-τ基因。     

吉林株犬新孢子虫SAG1基因片段的克隆及蛋白抗原性预测

[目的]对犬新孢子虫SAG1基因进行克隆与序列分析。[方法]从细胞培养的吉林株虫体中提取犬新孢子虫DNA,根据已发表的犬新孢子虫鲥G1基因的核苷酸序列,设计并合成1对特异性引物,采用PCR技术,扩增大新孢子虫SAG1基因片段,并成功克隆到pMD18-T simple载体上,对经PCR、酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列分析。[结果]对犬新孢子虫SAG1基因进行克隆后,获得阳性重组质粒。克隆的SAG1基因片段长780bp,编码260个氨基酸,与已发表的美国株犬新孢子虫SAG1基因核苷酸序列（AF132217）的同源性为99．0％,氨基酸序列同源性为98．8％。通过分子生物学软件对翻译水平进行预测,发现吉林株核苷酸序列并不影响氨基酸翻译与蛋白质的表达。[结论]该试验成功克隆重组质粒,为建立犬新孢子虫的高效表达系统奠定了基础。     

狸猫α-干扰素全基因的克隆及生物信息学分析

根据猫α-干扰素基因核苷酸序列,设计并合成了1对引物,PCR扩增狸猫α-干扰素全基因,并克隆、测序。用DNAStar软件及在线分析方法对克隆的IFN-α基因核苷酸及其推导氨基酸序列进行分析,并与人和其他种动物的IFN-α基因进行同源性和进化分析。结果表明,获得了狸猫α-干扰素全基因序列,其大小为631 bp,编码194个氨基酸的多肽,推导氨基酸序列有1个潜在的N-糖基化位点和7个潜在的O-糖基化位点。IFN-α基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高。狸猫IFN-α基因的成功克隆为进一步研究猫IFN-α基因表达、生物学活性和应用奠定基础。     

豆豉纤溶酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

[目的]为豆豉纤溶酶的进一步研究与应用奠定基础。[方法]以从芽孢杆菌中提取的总DNA为模板,根据GenBank的豆豉纤溶酶基因(AY720895.2)DNA序列设计1对引物,克隆豆豉纤溶酶基因并进行序列测定。构建毕赤酵母表达载体pL3,在毕赤酵母中表达豆豉纤溶酶基因。[结果]经PCR扩增可获得约1.1 kb的DNA片段。序列分析表明所克隆DNA片段包含1个1089 bp的开放阅读框,编码363个氨基酸。该克隆基因与所发表的豆豉纤溶酶基因序列的核苷酸序列同源性为98%,而氨基酸序列同源性达100%。[结论]所克隆的豆豉溶纤酶基因在毕赤酵母中成功表达,且表达产物具有正常的生物学活性。     

宁乡猪生长激素基因的克隆及其原核表达载体的构建

[目的]研究了宁乡猪生长激素基因(nxGH)的克隆及其原核表达载体的构建。[方法]根据已报道的猪生长激素基因序列设计了1对特异性引物,应用RT"PCR技术从宁乡猪脑垂体中克隆了nxGH编码区序列。[结果]扩增片段全长651 bp,共编码216个氨基酸。该序列与已报道的三元和五指山猪生长激素cDNA基因核苷酸序列同源性为99.85%。将nxGH cDNA序列定向插入pET"32a原核表达载体中,成功构建重组原核表达质粒pET"GH。[结论]为下一步制备宁乡猪生长激素抗体奠定了基础。     

绵羊激活素受体 IIB（ActRIIB）基因的克隆、序列分析及原核表达

[目的]旨在克隆绵羊激活素受体 IIB （ActRIIB）基因,并构建原核表达载体进行体外表达,为进一步验证功能奠定基础。[方法]以绵羊肝脏组织为材料,以提取总 RNA反转录得到的 cDNA为模板,利用同源序列克隆技术,对绵羊 ActRIIB基因的 cDNA全长进行克隆,并对其进行生物信息学分析。再根据克隆序列设计引物,将其与原核表达载体 pET41a连接,构建重组表达质粒 pET41a-ActRIIB,经IPTG诱导后进行表达鉴定。[结果]扩增获得绵羊ActRIIB基因cDNA全长1564 bp（ Genbank登陆号为：JX422071.1）,最大开放阅读框为1539 bp,共编码512个氨基酸;其氨基酸序列与牛的同源性最高（99.6%）,ActRIIB的 C末端区域高度同源且属于 TGFβ家族。原核诱导表达获得符合预期大小（约92 kD）并带有组氨酸标签序列的 ActRIIB重组蛋白。[结论]绵羊 ActRIIB基因的克隆和表达为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

绵羊激活素受体IIB(ActRIIB)基因的克隆、序列分析及原核表达

[目的]旨在克隆绵羊激活素受体IIB(ActRIIB)基因,并构建原核表达载体进行体外表达,为进一步验证功能奠定基础。[方法]以绵羊肝脏组织为材料,以提取总RNA反转录得到的cDNA为模板,利用同源序列克隆技术,对绵羊ActRIIB基因的cDNA全长进行克隆,并对其进行生物信息学分析。再根据克隆序列设计引物,将其与原核表达载体pET41a连接,构建重组表达质粒pET41a-ActRIIB,经IPTG诱导后进行表达鉴定。[结果]扩增获得绵羊ActRIIB基因cDNA全长1 564 bp(Genbank登陆号为:JX422071.1),最大开放阅读框为1 539 bp,共编码512个氨基酸;其氨基酸序列与牛的同源性最高(99.6%),ActRIIB的C末端区域高度同源且属于TGFβ家族。原核诱导表达获得符合预期大小(约92 kD)并带有组氨酸标签序列的ActRIIB重组蛋白。[结论]绵羊ActRIIB基因的克隆和表达为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

编码L-苏氨酸-O-3-磷酸盐脱羧酶基因的克隆和解析

[目的]为探索维生素B12生物合成的限速步骤奠定基础。[方法]提取费氏丙酸杆菌染色体DNA,利用Cassette和Cassette Primer的LA PCR技术克隆cobD的上游基因。将扩增的目的基因片段克隆至pGEM-T Easy Vector上,经PstⅠ酶切鉴定后对阳性克隆质粒进行测序,并应用Blast对所得碱基序列进行解析。[结果]经LA PCR扩增获得全长为1 085 bp的目的基因。经PstⅠ酶切鉴定,cobD基因成功克隆到pGEM-T Easy Vector上。测序结果表明,所得的基因为编码L-苏氨酸-O-3-磷酸盐脱羧酶的基因,与GenBank中cobD基因编码的氨基酸序列同源性为100%。[结论]在厌氧条件下,费氏丙酸杆菌具有与鼠伤寒沙门氏菌相似的合成途径。     

侧金盏花CBF转录激活因子基因片段的克隆

[目的]探索CBF转录激活因子基因在侧金盏花中是否存在。[方法]以侧金盏花基因组DNA为模板,根据拟南芥CBF基因序列的保守区设计1对特异性引物,通过PCR扩增获得1个DNA片段,将其克隆到pUCm-T载体中,转化大肠杆菌TG1,筛选阳性克隆并对其进行测序鉴定。[结果]测序结果显示通过PCR扩增获得的基因片段长448 bp。在GenBank中检索,该序列与从拟南芥和其他作物中克隆的CBF同源基因序列同源性较低,说明是一个新的基因片段,初步认定该片段是侧金盏花CBF基因片段。[结论]该研究为进一步克隆侧金盏花CBF转录激活因子基因全长序列、鉴定其生物学意义奠定了基础。     

绵羊甘露聚糖结合凝集素的研究

[目的]为了研究绵羊甘露聚糖结合凝集素(MBL)基因。[方法]以陶塞特羊全血基因组DNA为模板,参考GenBank上牛与人的MBL基因序列合成一对特异性引物,进行PCR扩增,并经回收重组到pBS-T载体,筛选阳性克隆。用DNAMAN软件将部分测序结果同已发表的牛和人MBL序列进行同源性比较,并通过Primer Premier5进行蛋白质氨基酸序列预测。[结果]经PCR扩增获得了549bp的特异性片段。部分测序结果同牛和人MBL序列的同源性分别高达97%和86%,且该DNA序列与牛MBL部分序列编码的氨基酸仅一个之差,证实该序列为绵羊MBL基因的部分序列。[结论]绵羊MBL基因序列的获得,不仅为绵羊MBL基因全序列的获得提供了依据,还有助于进一步揭示MBL的生理和病理功能,对绵羊优良品种的选育具有深远意义。     

牛脂联素cDNA全基因序列的克隆

[目的]体外克隆牛脂联素基因的编码全序列。[方法]以成牛尾部脂肪的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得牛脂联素基因cDNA的全序列,将其克隆到原核表达载体PMD18-T中,筛选出阳性克隆,提取重组质粒,通过限制性内切酶酶切鉴定和重组质粒PCR鉴定后对其进行测序。[结果]从牛尾部脂肪组织总RNA中扩增得到671bp的目的条带,该cDNA序列与GenBank中牛脂联素基因序列同源性为100％,其氨基酸同源性也达到100％,确定为目的基因。[结论]该研究为进一步研究牛脂联素基因的功能和研究牛脂联素基因的表达与育肥牛的脂肪代谢的关系提供了试验基础。     

藏獒犬α-干扰素全基因的克隆与序列分析

根据GenBank发表的犬α-干扰素(IFN-α)基因核酸序列(AB102731),设计并合成1对引物,利用PCR技术从藏獒犬肝脏基因组DNA中扩增犬α-干扰素全基因,并进行克隆和测序.结果表明,获得了犬IFN-α全基因序列,其大小为564 bp,包含1个完整阅读框,编码187个氨基酸残基.序列比较分析发现,克隆的藏獒犬IFN-α基因序列与GenBank中5条犬IFN-α基因序列核苷酸同源性在96.8%～99.3%之间,氨基酸同源性在94.7%～98.9%之间,并无插入和缺失变异,但是存在氨基酸点变异.藏獒犬与人和其他8种动物的IFN-α基因序列分析和系统进化分析表明,IFN-α基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高.犬IFN-α基因的成功克隆为进一步研究藏獒犬IFN-α基因表达、生物学活性和应用奠定基础.     

猫β干扰素基因的克隆及表达

根据GeneBank上的猫IFN-β基因序列.设计了1对特异性引物,对猫肝组织中提取的DNA进行PCR扩增,然后将扩增产物插入pUCm-T克隆载体进行了克隆.测序分析表明,克隆的IFN-β基因序列与GeneBank中的基因(NM_001009297)存在一个碱基差异,第446位碱基由T变为C,二者同源性高达99.82%,同时这个碱基的差异没有引起氨基酸的改变.将其双酶切后插入原核表达载体pGEX-KG,构建成功重组表达载体pGEX-IFNB,将其转化BL21(DE3)后成功进行了诱导表达.SDS-PAGE和Western-Blot分析表明,在35KDa处出现蛋白表达条带,表达量占菌体蛋白的12%.在Western-Blot中其能和GST抗体发生特异性反应,说明为GST-IFN-β融合蛋白.     

苦荞中查尔酮合成酶全长基因的克隆及序列分析(英文)

[目的]该研究旨在克隆苦荞中查尔酮合成酶全长基因。[方法]选用乌克兰伊琳娜苦荞为试验材料,以从叶片中提取的RNA为模板,应用RACE技术结合CODEHOP引物设计方法克隆苦荞中查尔酮合成酶cDNA序列,通过电子合并获得其全长。设计基因全长特异性引物,以DNA为模板进行PCR扩增出基因序列。应用Clustalxl.81和MEGA4软件进行序列分析和进化树的建立;核酸和蛋白质序列同源性分析应用NCBI的Blastn和Blastp完成。[结果]生物信息学分析表明,该基因全长1906bp,具有一个463bp的内含子序列,编码区长度为1188bp,编码395个氨基酸。Blastn序列比对发现该试验所获得的CHS基因序列与相近物种Rheum palmatum(登录号:DQ205352.1)的CHS基因同源性达86%。[结论]该研究为阐明苦荞生物类黄酮合成的分子基础,探索提高苦荞生物类黄酮含量的有效途径奠定基础。     

玉米高光效基因ppdk的克隆及其生物信息学分析

[目的]获得玉米(Zea mays)的丙酮酸磷酸双激酶基因(以下简称ppdk),并对其进行生物信息学分析.[方法]使用Trizol提取玉米SC704的总RNA,并用特异引物对其进行RT-PCR扩增,将得到的cDNA片段连接到pGEM-T载体后转化大肠杆菌DH5α,然后对阳性克隆进行测序,并对序列进行生物信息学分析.[结果]获得的玉米PPDK基因CDS全长2781bp,与玉米z561ppdk基因同源性为99;;其编码的多肽链包含926个氨基酸,与玉米PPDK同源性为97;.[结论]克隆了玉米C4型丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)基因,它所编码的氨基酸序列具备PPDK蛋白的保守序列和催化活性中心区域.该基因的成功克隆为今后利用其改造C3植物的光合效率以提高粮食单产奠定了良好的基础.     

红麻查尔酮合成酶及其异构酶基因的克隆与表达分析

[目的]克隆红麻查尔酮合成酶(CHS)及其异构酶(CHI)基因并构建CH基因的植物表达载体,为进一步研究其在红麻育性及抗逆性中的作用奠定基础.[方法]提取红麻不育系(P3A)、保持系(P3B)花药RNA和DNA,以红麻花药转录组高通量测序数据为基础,利用同源克隆技术获得CHS和CHI基因,并利用载体重组技术构建CHS基因植物表达载体.[结果]红麻CHS基因cDNA全长序列为1236 bp,包含一个1170bp开放阅读框,编码389个氨基酸;其DNA序列全长为1329bp,包含2个外显子和1个内含子.CHI基因cDNA序列为724 bp,最大开放阅读框为630bp,编码209个氨基酸;其DNA序列全长为1087 bp,包含4个外显子和3个内含子.[结论]成功克隆获得红麻CHS和CHI基因的序列,构建的CHS基因植物表达载体pBI121-CHS可用于该基因功能的研究.     

黑曲霉中国株(3.758)葡萄糖氧化酶(GOD)基因的克隆与结构分析

[目的]为充分开发黑曲霉在轻工业中的用途。[方法]以黑曲霉中国株(3.758)基因组DNA为模板,用LATaqDNA聚合酶对葡萄糖氧化酶(GOD)基因进行PCR扩增,扩增片段纯化后与pUCm-T载体连接后,转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞,经琼脂糖凝胶电泳法、酶切和PCR鉴定获得阳性克隆。对获得含GOD基因的克隆进行测序,分析其蛋白质氨基酸序列及限制性内切酶的图谱。[结果]经PCR扩增获得约1.8kb的片段。获得的GOD基因编码序列共1818bp,与报道的黑曲霉(ATCC9029)GOD基因序列仅有3个碱基之差。该基因序列具有多个限制性内切酶位点。黑曲霉不同菌株与中国株(3.758)GOD基因的同源性比较表明,不同黑曲霉菌株中GOD基因不同,而菌株ATCC9029与菌株NRRL-3是同一菌株。[结论]该研究获得了GOD基因的全长序列,为GOD的生物工程生产和相关植物基因工程奠定了基础。     

牧羊犬IFN-β基因的克隆和序列分析

为对犬干扰素-β(IFN-β)进行研究,用PCR技术从犬血细胞基因组DNA中扩增了牧羊犬IFN-β基因,并克隆到pGEM-T载体,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,阳性克隆经PCR和酶切鉴定后进行测序。结果表明:牧羊犬IFN-β基因含561bp,编码186个氨基酸,前21个为信号肽。成熟蛋白理论分子量为20kD,等电点为5.737,有2个潜在磷酸化位点、5个N糖基化位点和4个半胱氨酸残基,大部分为亲水区。二、三级结构预测显示,蛋白主要由5段α螺旋组成。犬IFN-β基因与赤狐的完全相同,与貉、雪貂和猫的同源性很高(85%～98.4%),在进化树中处于同一分支,而与禽类和鱼类的同源性仅为2.9%～8.6%。     

甘蔗DⅢ家族蔗糖磷酸合成酶基因SofSPSDⅢ克隆及其hpRNA载体构建

[目的]克隆甘蔗DⅢ家族SofSPSDⅢ基因并构建其hpRNA表达载体,为研究该基因生物学功能奠定基础.[方法]通过同源克隆获得甘蔗SofSPSDⅢ基因部分序列,利用RACE技术获得其全长cDNA.扩增SofSPSDⅢ目的基因约500 bp序列,利用中间载体pHANNIBAL构建该片段的hpRNA结构,然后用NotⅠ将整个hpRNA结构切下,克隆到双元植物表达载体pART27上,构建该基因的hpRNA表达载体.[结果]通过同源克隆和RACE技术获得SofSPSDⅢ基因全长cDNA序列,该基因全长3252 bp,5 ＇端UTR长度59 bp,3 ＇端UTR长度292 bp,开放阅读框（ORF）长度2895 bp,带有真核生物典型的poly（A）尾巴（GenBank登录号：HQ117935）.该基因编码蛋白含有964个氨基酸,理论分子量108.03kDa,等电点pI=6.66;SofSPSDⅢ与SoSPS2、SbSPS和TaSPS9的氨基酸序列同源性分别为99.0％、98.9％和90.0％.构建获得SofSPSDⅢ基因的hpRNA载体pART-DⅢ-Ri.[结论]成功克隆甘蔗DⅢ家族SofSPSDⅢ基因并构建基hpRNA载体,可为下一步沉默该基因、进而解析该基因的生物学功能奠定基础.     

盐生植物盐穗木HcPS_H基因大肠杆菌表达载体的构建

[目的]构建盐穗木HcPS_H基因的大肠杆菌表达载体。[方法]以质粒pGEM-T-HcPS_H为模板,HcPS_H-pET28a-F、HcPS_H-pET28a-R为引物进行PCR扩增,获得两端含酶切位点的HcPS_H基因目的片段。将该目的片段与大肠杆菌表达载体pET-28a通过T4DNA连接酶连接,并转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,得到重组子克隆,抽质粒进行测序鉴定。[结果]扩增出HcPS_H基因片段长度为441 bp,将其连接到大肠杆菌表达载体pET-28a上后,得到重组子质粒,经PCR检测、双酶切验证及测序鉴定,表明成功构建原核表达载体。[结论]该研究成功构建了盐穗木HcPS_H基因的大肠杆菌表达载体,为进一步进行该基因功能的研究奠定了基础。