家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP141的表达特征及对饥饿的响应

【目的】分析家蚕(Bombyx mori)丝氨酸蛋白酶基因BmSP141序列信息,明确其时空表达模式,结合饥饿与重新喂食处理对其表达的影响,探究该基因在家蚕中的功能。【方法】对家蚕丝氨酸蛋白酶基因BmSP141进行T-A克隆,得到其编码区核苷酸序列;应用生物信息学在线网站对该基因编码区推导的氨基酸序列、分子量、结构域等信息进行分析;利用ClustalX1.8和MEGA5.02软件对BmSP141与其他物种的丝氨酸蛋白酶进行多序列比对和系统发生树分析;构建原核表达载体p28-BmSP141,并转化到Rosetta（DE3）菌株中诱导表达,利用镍柱亲和层析纯化重组蛋白。利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR方法对其组织和时期表达特征进行分析;采用蛋白质免疫印迹（Western blot）技术,分别分析BmSP141蛋白在家蚕5龄第3天各组织的表达情况和5龄幼虫中肠的表达变化;通过免疫荧光定位分析BmSP141蛋白在4龄幼虫中肠的分布情况;利用实时荧光定量PCR和Western blot方法对饥饿处理和再喂食后BmSP141的表达情况进行分析。【结果】BmSP141编码含有292个氨基酸的蛋白,其中第1-17位氨基酸为信号肽,其成熟体蛋白预测分子量为25.9 kD,等电点为7.8。同源序列比对表明,BmSP141与烟芽夜蛾丝氨酸蛋白酶和蓓带夜蛾丝氨酸蛋白酶序列同源性较高,分别达到62%和63%。这些同源序列具有保守的催化三联体,与活性相关的基序也很保守,但与胰凝乳蛋白酶保守的底物特异性位点相比,BmSP141的底物特异性位点发生改变。在16和37℃条件下诱导后,重组蛋白均以包涵体形式表达,经镍柱亲和层析纯化后得到了较纯的重组蛋白,并用该蛋白制备了效价较高的多克隆抗体。组织和时期表达特征分析表明,该基因主要在家蚕幼虫的中肠组织特异性表达, 且在幼虫起蚕到食桑期表达逐渐增加,但眠期表达下降,蛹期和成虫期表达水平较低。Western blot分析也表明,BmSP141蛋白仅在家蚕中肠组织表达,且从5龄起蚕到上蔟表达量先增加后降低。免疫荧光定位结果表明,BmSP141定位于中肠上皮细胞的细胞质中,进一步证实BmSP141在中肠特异表达。在转录和翻译水平,BmSP141饥饿处理后表达量显著下调,而重新喂食后其表达量上调,表明BmSP141的表达受到消化道食物的诱导。【结论】家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP141在中肠组织表达,在幼虫期食桑期高表达,蛹期和成虫期表达水平较低,受消化道食物的诱导而上调表达,推测该基因可能参与家蚕中肠的消化过程。     

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂BmSPI37的克隆、 表达及微生物诱导分析

【目的】鉴定新的家蚕蛋白酶抑制剂,探讨其在抵御病原微生物入侵方面的功能。【方法】对家蚕蛋白酶抑制剂BmSPI37进行T-A克隆、多序列比对、系统发育树构建、原核表达、RT-PCR时空表达特征及微生物诱导分析。【结果】克隆、表达了1个新的丝氨酸蛋白酶抑制剂,命名为BmSPI37。时空表达特征分析表明,BmSPI37在家蚕5龄幼虫后期表达量很高,而且在中部丝腺中高量表达;在蛹向蛾的变态发育时期,BmSPI37在雌蚕中的表达量显著高于雄蚕。微生物诱导试验表明,BmSPI37在大肠杆菌、黑胸败血菌、球孢白僵菌感染后,强烈上调表达。【结论】推测BmSPI37与防御病原微生物入侵有关。     

家蚕hsp24.3基因的克隆及功能研究

 【目的】对家蚕 hsp24.3基因（Bmhsp24.3）的功能进行研究,为选育抗逆境家蚕品种提供基础材料和理论依据。【方法】在对家蚕基因组进行生物信息学分析的基础上,对家蚕低分子量热激蛋白基因 Bmhsp24.3进行克隆,然后利用家蚕的芯片数据对 Bmhsp24.3基因在5龄第3天幼虫不同组织中的表达模式进行分析,并利用半定量 RT-PCR技术,分别对 Bmhsp24.3基因在正常情况下和热刺激条件下家蚕5龄幼虫不同发育时期（1～6 d）后部丝腺中的表达状况以及10个不同家蚕品种5龄第3天幼虫丝腺中的表达情况进行了检测;最后将 Bmhsp24.3基因进行原核表达,获得重组蛋白 rBmHSP24.3,并进一步对该重组蛋白的功能进行了体外验证。【结果】Bmhsp24.3基因的编码区（CDS）长度为633 bp,编码210个氨基酸,为单外显子基因;RT-PCR检测发现该基因在家蚕的体壁、脂肪体以及丝腺组织中有较高水平表达,在其它组织中的表达不明显;同对照相比,不同家蚕品种以及不同发育时期的5龄幼虫在热刺激后,其后部丝腺中的Bmhsp24.3基因的表达显著升高。经 Native-PAGE和 SDS-PAGE分析表明,在高温条件下,表达获得的重组蛋白rBmHSP24.3能与硫氰酸酶形成稳定的复合物,使底物蛋白免受热刺激胁迫而变性,从而起着分子伴侣的作用。【结论】重组蛋白 rBmHSP24.3在体外具有分子伴侣的功能,推测该蛋白在家蚕体内同样具有分子伴侣的功能,在家蚕的抗逆境适应过程中起重要作用。     

“荧光”蚕品种雌雄荧光色素来源及代谢差异

对“荧光”蚕品种雌雄荧光色素来源及代谢差异的研究结果表明:茧层的荧光色素来源于中部绢丝腺,存在于丝胶中。中部绢丝腺的荧光色素直接来源于血液,绢丝腺对荧光色素无选择吸收和透过功能。血液、绢丝腺和茧层的荧光色具有良好的一致性,形成雌雄荧光色素的种类,血液、绢丝腺为4种,茧层为5种,无差异。造成雌雄荧光色不同的原因是各色素的含量不同。茧层中一种Rf值为0.77的紫荧光色素,在血液和中部绢丝腺中均未检出。5龄雌雄蚕4日龄后,随日龄的增加,雄性血液的荧光黄色随之加深,而雌性中肠的荧光黄色不再加深。     

家蚕幼虫总蛋白酶和胰蛋白酶活性的测定

为了调查家蚕幼虫总蛋白酶和胰蛋白酶活性,并探讨与丝氨酸蛋白酶基因表达之间的关系。对家蚕不同组织、不同时期、不同品种来源的样品进行了总蛋白酶和胰蛋白酶活性的检测。在Ysh品种中肠中的总蛋白酶和胰蛋白酶活性都高于丝腺,性别差异不显著,品种中Dazao和Ysh显著高于Y-1和C108;Ysh品种5龄3日中肠中的胰蛋白酶活性显著高于5龄7日,高浓度蜕皮激素(20E)处理后24 h中肠中胰蛋白酶活性下降幅度比较大,保幼激素处理后变化不显著。胰蛋白酶活性测定结果与SPs家族基因特异性的在中肠表达,5龄中期表达高于5龄末期,20 E处理后24 h出现下调表达的结果是一致的;不同品种酶活性的差异可能与生命力差异有关。为家蚕丝物质形成和积累提供了分子调控的参考依据。     

家蚕Bm595的表达、组织分布及亚细胞定位

 【目的】从家蚕蛹期cDNA文库中获得一条新基因Bm595,分析Bm595在家蚕体内的表达和定位情况。【方法】利用生物信息学分析Bm595序列,并构建重组表达质粒在大肠杆菌中诱导表达,以纯化的融合蛋白抗原,制备多克隆抗体。用荧光定量PCR和Western blot方法分析Bm595基因在家蚕各组织中的分布。用免疫细胞化学的方法研究Bm595蛋白的定位情况。【结果】Bm595在五龄幼虫的转录水平最高,卵中最低。Bm595在家蚕五龄幼虫各组织中的转录水平由高到低依次为：睾丸、丝腺、肠、头、卵巢、脂肪体、表皮、气管。在表达水平方面,睾丸的表达量最高,其次是丝腺和头,脂肪体有较明显的表达。以家蚕Bm5细胞进行免疫细胞化学试验,Bm595主要分布于细胞核内。【结论】在mRNA、蛋白质表达和细胞水平对Bm595进行初步表达分析和定位分析,为进一步研究该蛋白在家蚕中的功能提供重要依据。     

家蚕幼虫各发育时期酚氧化酶原基因的转录活性分析

[目的]为进一步了解家蚕酚氧化酶原基因的功能奠定基础。[方法]根据GenBank上登录的家蚕酚氧化酶原基因(PPO1和PPO2)的cDNA序列设计2对特异引物,通过半定量RT-PCR技术检测家蚕幼虫各发育时期(蚁蚕到5龄起蚕)酚氧化酶原基因的转录活性。[结果]PPO1和PPO2基因在家蚕幼虫各发育时期的转录活性存在较大差异。PPO1基因在2龄眠蚕、4龄眠中的表达量最高,其次是2龄起蚕、3龄眠蚕3、龄起蚕和1龄眠蚕,在3龄眠中、4龄起蚕的表达量较低,在4龄眠蚕有弱表达,在其他发育时期几乎无表达。PPO2基因除了在蚁蚕1、龄眠中、2龄眠蚕无表达外,在其他时期的表达量均较高。[结论]酚氧化酶原基因在家蚕幼虫各发育时期的转录表达均具有明显的时空特异性。     

细胞周期蛋白家族基因在家蚕幼虫蜕皮过程中的表达

细胞周期蛋白(cyclin)是调控真核生物细胞有丝分裂的重要蛋白。以家蚕1~5龄幼虫的眠蚕和起蚕为材料,采用实时荧光定量PCR方法对家蚕cyclin家族基因(CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE)在不同龄期幼虫蜕皮过程中的表达进行研究。结果显示,1龄幼虫在眠期、起蚕期几乎均检测不到CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE基因的表达,表明此时幼虫器官发育基本完成,细胞分裂迟缓。在起蚕期,CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表达量均随着幼虫的发育进程逐渐增加,表明细胞分裂过程加剧,促进家蚕个体的不断生长;眠期则没有规律性变化。在2~5龄幼虫中,CyclinA、CyclinB、CyclinE基因表达量均为起蚕期高于眠期,眠期最重要的生理过程是细胞凋亡,因此眠期细胞周期蛋白家族基因表达水平较低,而CyclinB3基因在整个幼虫时期几乎不表达。本试验结果为细胞周期蛋白在家蚕蜕皮变态发育过程中的调控机制研究提供了参考。     

家蚕cbp基因的表达与幼虫体内类胡萝卜素的水平相关

[目的]调查家蚕幼虫期类胡萝卜素水平的变化及cbp基因的mRNA表达特征。[方法]选取黄茧和绿茧品种家蚕3、4和5龄期幼虫的丝腺,参照Takara Trizol plus试剂说明提取总RNA,根据文献提供的cbp基因序列设计特异引物,采用RT-PCR方法调查不同茧色品种家蚕幼虫不同龄期丝腺中cbp基因mRNA的表达特征和主要组织中类胡萝卜素的水平变化。[结果]cbp基因的mRNA表达,在3和5龄期各品种家蚕均维持一定水平,但在4龄期表达量很低或不表达。同一组织的紫外可见光谱扫描结果显示,4龄期家蚕丝腺类胡萝卜素的含量极低,不同茧色品种cbp基因的mRNA表达也存在差异,绿茧品种仅表达1个缺失第2外显子的转录本,而所有黄色茧品种还可表达1个序列完整的转录本。[结论]家蚕体内类胡萝卜素的水平与cbp基因mRNA表达相关。     

家蚕保幼激素甲基转移酶基因的克隆与表达分析

根据家蚕表达序列标签(ESTs),克隆了一个家蚕保幼激素甲基转移酶基因(JHAMT2)的全长cDNA序列。序列分析表明,该基因全长1007 bp,序列分析有4个外显子,定位于家蚕第12号染色体的nscaf 2 993上,推导的编码蛋白序列长度为266AA,有一个甲基转移酶超家族功能位点,与烟草天蛾(Manduca sexta)JHAMT同源性达到38%。JHAMT2基因在家蚕丝腺、特别是中部丝腺组织特异表达,发育时期表现为4龄期有比较高的表达量,5龄期只在5龄第3日有表达,性别差异表现为雄性体内持续表达时间比雌性中长。JHAMT2基因表达受到外源激素MH的负调控和JHA的正调控,雌性对外源昆虫激素的感受更敏感。     

家蚕细胞周期蛋白家族基因在5龄幼虫组织中的表达谱分析

【目的】研究家蚕细胞周期蛋白家族基因(CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinE、CyclinL1)在丝腺及其他组织中的表达情况,为探讨细胞周期蛋白家族基因在细胞周期中的作用提供参考。【方法】取家蚕5龄3d幼虫的脑、脂肪体、中肠、丝腺、马氏管、精巢、卵巢及血液等组织,用Trizol提取各组织的总RNA并反转录合成cDNA。以Actin3为内参基因,合成的cDNA为模板,利用每个基因的特异性引物进行实时荧光定量PCR,检测细胞周期蛋白家族基因在转录水平上的表达情况。【结果】在丝腺中,CyclinE基因的表达量最高,CyclinA、CyclinL1基因表达较弱,而CyclinB、CyclinB3基因没有表达;在其他组织中,CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinL1基因均在精巢中高表达,而CyclinE基因在脂肪体中表达较高。【结论】CyclinE基因在家蚕丝腺细胞G1/S期起重要作用,CyclinB、CyclinB3基因在G2/M期起作用;CyclinA基因可能参与丝腺染色体的后期复制;CyclinA、CyclinB、CyclinB3、CyclinL1基因在家蚕精巢中的精母细胞发育形成精子进行分裂时起着重要作用。     

家蚕人工性别控制与应用

自然界绝大多数生物雌性个体和雄性个体的数量大体保持着平衡，一般情况下家蚕的雌雄性比为1：1。但家蚕雌雄性别间的经济价值具有较大差异，每条雌蚕要产生300-800粒蚕卵，需将相当大的一部分营养用于制造蚕卵，因此雄蚕的蚕茧出丝率和担桑产丝量比雌蚕高15％-20％，且雄蚕体质强健、出丝量高、茧丝质量好，因而在丝茧育中人们希望专养雄蚕。另一方面，在蚕种繁育中又希望多养雌蚕，生产更多的蚕种。可见，生产目的不同，对蚕的性别要求也不同，     

荧光茧色判性家蚕黄酮合酶I(BmFNS I)基因在家蚕组织内的表达差异

采用荧光定量PCR分别检测不同品种荧光判性家蚕雌、雄家蚕的中肠、丝腺和脂肪体中的黄酮合酶I(BmFNS I)基因的表达。结果表明,家蚕BmFNS I基因在各品种荧光判性家蚕中肠中的相对表达量最高,其次是脂肪体,在丝腺中的表达量较低,说明BmFNSI基因在对家蚕食物桑叶内的黄酮类化合物的合成代谢中起重要作用;但是在各品种荧光判性家蚕的雌、雄中肠中的表达并无明显差异,说明荧光判性家蚕雌、雄蚕在对桑叶内的黄酮类化合物的合成代谢途径上不存在差异,至少在FNS I基因所调节的黄酮类化合物的合成代谢上不存在差异。     

荧光茧色判性家蚕黄酮合酶Ⅰ（BmFNS Ⅰ）基因在家蚕组织内的表达差异

采用荧光定量PCR分别检测不同品种荧光判性家蚕雌、雄家蚕的中肠、丝腺和脂肪体中的黄酮合酶Ⅰ（BmFNS Ⅰ）基因的表达。结果表明,家蚕BmFNSI基因在各品种荧光判性家蚕中肠中的相对表达量最高,其次是脂肪体,在丝腺中的表达量比较低,说明BmFNSI基因在对家蚕食物桑叶内的黄酮类化合物的合成代谢中起重要作用;但是在各品种荧光判性家蚕的雌、雄中肠中的表达并无明显差异,说明荧光判性家蚕雌、雄蚕在对桑叶内的黄酮类化合物的合成代谢途径上不存在差异,至少在FNSI基因所调节的黄酮类化合物的合成代谢上不存在差异。     

荧光茧色判性家蚕黄酮合酶Ⅰ（BmFNS Ⅰ）基因在家蚕组织内的表达差异

采用荧光定量PCR分别检测不同品种荧光判性家蚕雌、雄家蚕的中肠、丝腺和脂肪体中的黄酮合酶I（BmFNS I）基因的表达。结果表明,家蚕BmFNS I基因在各品种荧光判性家蚕中肠中的相对表达量最高,其次是脂肪体,在丝腺中的表达量较低,说明BmFNSI基因在对家蚕食物桑叶内的黄酮类化合物的合成代谢中起重要作用;但是在各品种荧光判性家蚕的雌、雄中肠中的表达并无明显差异,说明荧光判性家蚕雌、雄蚕在对桑叶内的黄酮类化合物的合成代谢途径上不存在差异,至少在FNS I基因所调节的黄酮类化合物的合成代谢上不存在差异。     

限量给桑对家蚕丝腺成长规律的影响

对不同指数限制给桑条件下家蚕五龄期丝腺成长规律、营养物质向蚕体组织和丝腺的分配比率、后部丝腺细胞核酸含量及茧质性状等作了比较研究．结果表明：限制给桑家蚕丝腺的成长规律与饱食区相仿，只因限制给桑使营养物质向丝腺的供给量减少，从而使丝物质的合成量较饱食区为少；而对蚕体重增加影响较小．后部丝腺细胞核酸含量的测定结果表明，限制给桑对ＤＮＡ的增加量影响较小，而对ＲＮＡ的增加量影响较大．限制给桑使得五龄经过延长，全茧量、茧层量减少，而茧层生产效率提高．ＲＮＡ合成茧丝蛋白的效率两处理区无明显差异     

家蚕Bmβ-COP基因结构及功能

采用克隆测序、生物信息学分析及表达谱检测等方法,分析了家蚕Bmβ-COP基因的结构和功能特征,探索其与丝蛋白合成的关系。结果表明,Bmβ-COP基因在家蚕基因组中为单一拷贝,也没有选择性剪接异构体存在;在不同产丝能力的家蚕品种及其不同组织间没有表达差异;Bmβ-COP基因与不同家蚕品种间丝物质生产能力差异没有直接关联,但破坏它会影响丝腺的发育和功能,对家蚕丝蛋白合成、分泌产生不利影响。     

Polycomb家族基因BmSu（z）12在家蚕幼虫中的表达研究

[目的]研究家蚕Polycomb蛋白家族基因BmSu（z）12在家蚕幼虫中的表达情况.[方法]根据家蚕基因组预测的BmSu（z）12基因序列,设计特异引物,利用qRT-PCR对该基因在家蚕不同龄期幼虫中的表达进行研究.[结果]BmSu（z）12基因在5龄幼虫蜕皮后2d和变态前2d有较高表达,而在1～5龄取食中期表达量较低,表达特征具有一定的规律性.[结论]BmSu（z）12基因在家蚕幼虫生长发育中具有重要作用,该研究为进一步研究家蚕SU（Z）12蛋白的功能奠定基础.     

家蚕空泡型ATP酶（V-ATPase）基因的基本信息及表达特征

【目的】鉴定家蚕（Bombyx mori）中的空泡型ATP酶（vacuolar-type ATPase, V-ATP酶）A、B亚基的编码基因,并调查其在家蚕幼虫5龄第3天不同组织和上蔟时期丝腺不同区段的表达特征。【方法】利用生物信息学的方法鉴定家蚕的V-ATP酶A、B亚基的编码基因并在线预测V-ATP酶两个亚基所具有的结构域,采用软件将其分别与其他物种中V-ATP酶A、B亚基的氨基酸序列进行同源序列比对和进化树的构建,通过荧光定量PCR技术分析家蚕V-ATP酶A、B亚基的编码基因在5龄第3天家蚕各组织的表达情况。进一步利用向家蚕幼虫上蔟时期的气孔注射pH值指示剂溴酚蓝,对丝腺进行染色,通过颜色变化对丝腺不同区段的pH值进行调查。最后,采用荧光定量PCR对家蚕上蔟时期丝腺不同区段V-ATP酶A、B亚基编码基因的表达情况进行分析。【结果】获得了家蚕V-ATP酶A、B亚基的编码基因BGIBMGA008295(GenBank登录号NM_001098359.1)和BGIBMGA002241(GenBank登录号NM_001098358.1)。结构域预测发现这两个亚基均具有3个非常保守的结构域,分别为位于N端的β筒结构域、序列中部的核苷酸结合结构域和C端结构域。将这两个基因编码的V-ATP酶A、B亚基的氨基酸序列与其他物种V-ATP酶A、B亚基的氨基酸序列进行同源性比对和进化树的构建,同源比对结果发现不同物种中V-ATP酶A、B亚基的氨基酸相似度为90%,保守结构域间相似度高达95%以上,说明不同物种间V-ATP酶A、B亚基高度保守。进化树显示家蚕V-ATP酶A、B亚基与同属于鳞翅目的其他昆虫的V-ATP酶A、B亚基亲缘关系较近。5龄第3天家蚕各组织中V-ATP酶A、B亚基编码基因的荧光定量PCR结果显示,这两个基因主要在中肠、脂肪体、生殖腺和丝腺中表达。使用溴酚蓝染色的方法分析上蔟期丝腺不同区段的pH情况,结果显示家蚕后部丝腺、中部丝腺后区和中区为中性或碱性环境,中部丝腺前区pH急剧下降到酸性环境,前部丝腺也为酸性环境。进一步对V-ATP酶A、B亚基编码基因在上蔟期丝腺不同区段进行表达情况分析,发现V-ATP酶A、B亚基基因在前部丝腺和中部丝腺前区高量表达,推测V-ATP酶可能与这两个区域低pH环境的产生和维持相关。【结论】明确了V-ATP酶在家蚕各组织的表达情况,V-ATP酶可能与中部丝腺前区和前部丝腺腺腔的酸化相关,这为进一步研究V-ATP酶的生理功能提供了理论依据。