氯化汞对草地贪夜蛾Sf9细胞及核型多角体病毒的遗传毒理研究

 【目的】试验以草地贪夜蛾细胞sf9作为受体，检测氯化汞对其生长发育的影响。【方法】采用台盼兰染料排斥法测定细胞活力，苏木素-伊红染色法检测细胞中的微核，对经氯化汞处理诱变的病毒AcMNPV 的DNA进行PCR扩增，产物经测序后进行分子突变分析。【结果】sf9细胞在4 ?g·ml-1的氯化汞浓度作用下，其细胞表面变得粗糙，分裂生长减慢，当剂量增大到7 ?g·ml-1时，便可观察到一些细胞的细胞膜破裂，在9 ?g·ml-1时，某些细胞的完整性受到破坏。用苏木素-伊红染色法检测细胞中的微核现象时，9 ?g·ml-1氯化汞处理区的微核率高达6.8%，有些细胞出现三核甚至多核的核裂现象，反映部分细胞的完整性受到一定程度的损伤。AcMNPV病毒经氯化汞短时间处理后接种于sf9细胞，多角体在sf9细胞中的形成数目较对照区少，异常多角体的比例增加，抽提经氯化汞处理的AcMNPV 的DNA，采取PCR技术进行扩增反应，对获得的扩增产物进行测序分析，发现DNA序列上的碱基有2处G→C、T→C的转换和碱基缺失的现象。【结论】一定剂量的氯化汞将会引起草地贪夜蛾sf9细胞及核型多角体病毒的损伤与致突变。     

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒对草地贪夜蛾幼虫的杀虫活性及生防效果

为明确苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus, AcMNPV)对草地贪夜蛾幼虫的防治效果,采用室内生物活性测定、田间药效试验等方法,研究和分析AcMNPV对草地贪夜蛾幼虫的杀虫活性和生防效果,结果显示,AcMNPV对草地贪夜蛾2龄幼虫的LC_(50)=2.9×10~(7 ) PIB/mL;在田间,AcMNPV+Bt复配制剂1千万苜核·苏云菌悬浮剂(1 500 mL/hm~2)药后第10天的平均虫口防效为68.99%,而药后第15天的平均防效亦有66.87%,均对草地贪夜蛾幼虫表现出较好的防治效果。应用DNAMAN 6.0软件对试验后死虫样进行DNA同源比对鉴定,结果显示polh、lef-8和lef-9基因序列同源性均达到100%。以上结果表明AcMNPV对草地贪夜蛾幼虫有较好的控制作用。建议在草地贪夜蛾低龄幼虫发生高峰期施用1千万苜核·苏云菌悬浮剂,最好选择在晴天16:00-17:00使用,避开高温和光照等不利环境条件的影响,以使病毒制剂能更好地发挥作用,提高其防治效果。     

甜菜夜蛾核多角体病毒VP39蛋白在苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒中的功能研究

【目的】构建表达甜菜夜蛾核多角体病毒（Spodoptera exigua multiple nucleopolyhedrovirus,SeMNPV） VP39蛋白的vp39假型苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica MNPV,AcMNPV）,明确SeMNPV VP39是否能取代AcMNPV VP39在AcMNPV中行使功能,为深入探究杆状病毒的核衣壳装配机理打下理论基础。【方法】利用Bac-to-Bac杆状病毒表达载体系统在AcMNPV vp39缺失型重组bacmid （bAcvp39KO）的基础上构建携带SeMNPV vp39基因、绿色荧光蛋白基因（Enhanced green fluorescence protein,egfp）和多角体蛋白基因（Polyhedrin,polh）的重组病毒（vAcSevp39:FLAG）。利用Western blotting检测分析SeMNPV vp39在vAcSevp39:FLAG转染的草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda） IPLB-Sf21-AE clonal isolate 9（Sf9）细胞中的表达情况,通过荧光显微镜观察vAcSevp39:FLAG在Sf9中的感染和扩散情况,采用病毒滴度测定并绘制病毒生长曲线检测vAcSevp39:FLAG的感染性芽生型病毒粒子产量,并以电子显微镜观察vAcSevp39:FLAG转染的Sf9细胞中的形态发生情况。【结果】Western blotting检测结果表明,SeMNPV VP39能在v AcSevp39:FLAG转染的Sf9细胞中获得表达;荧光显微镜观察和病毒生长曲线测定结果表明,在vAcSevp39:FLAG转染的Sf9细胞中无感染性的芽生型病毒粒子产生,与AcMNPV vp39缺失型重组病毒（v Acvp39KO）的现象一致;电子显微镜观察发现,与vAcvp39KO不同的是,在vAcSevp39:FLAG转染的细胞中虽然未产生核衣壳,但在感染细胞的核中存在大量空的透明长管状衣壳结构,表明SeMNPV VP39能挽救vAcvp39KO的衣壳结构装配,但在AcMNPV中不具备装配核衣壳的能力。【结论】SeMNPV VP39在AcMNPV中虽能形成衣壳结构,但不能有效装配核衣壳,导致无芽生型病毒粒子和包埋型病毒粒子产生。     

从野桑蚕体内分离的NPV与BmNPV、AcMNPV间的RAPD分析

将野外收集的野桑蚕核型多角体病毒进行空斑筛选，纯化后的病毒通过碱裂解法抽提基因组DNA，用家蚕核型多角体病毒(BmNPV)和苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)的基因组DNA作对照，用随机引物进行PCR扩增。结果表明，野桑蚕分离的NPV与BmNPV、AcMNPV存在较大的差异性，通过版本为1．3b的Treecomw软件分析，表明野桑蚕体内的NPV与BmNPV的同源关系较近，而与AcMNPV的同源关系较远。     

斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型分离株同源重复区hr1的结构功能分析

斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型(Spodoptera litura nucleopolyhedrovirusⅡ,SpltNPVⅡ)基因组DNA同源重复区hr1大小为1 746 bp,含有6个64 bp不完全回文序列、4个正向重复序列以及7个与病毒基因组DNA复制相关的基序。瞬时表达分析结果表明,SpltNPVⅡhr1在感染野生型家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)和苜蓿丫纹夜蛾多粒包埋型核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)的BmN和Sf21细胞中均具有增强早期基因ie1启动子活性的功能,增强效率分别为30、350倍;实时荧光定量PCR结果显示,hr1在BmN和Sf21细胞中具有基因组DNA复制起始原点的功能,拷贝数分别为(8.46×10~4±6.13×10~3)、(5.92×10~6±2.95×10~5)copies/μg DNA。研究证明,SpltNPVⅡhr1在异源细胞BmN和Sf21中具有复制起始原点和增强子的双功能作用。     

RBSDV P7-2基因重组AcMNPV的构建及其对sf9细胞的致死作用

[目的]为克服杆状病毒杀虫速度慢等固有缺点,首次尝试将异源病毒细胞凋亡诱导基因重组到昆虫杆状病毒中,以期为遗传修饰杆状病毒、提高杀虫效果提供新思路。[方法]将带有SV40终止子的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)多角体基因ph、AcMNPV ie-1启动子、在C端融合Flag标签的水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)的P7-2基因依次插入到供体质粒p Fast Bac-HTB的多克隆位点。使用供体质粒p Fast Bac-HTB自身的启动子及ie-1启动子分别启动ph和P7-2基因的表达。通过转座的方法将ph、P7-2基因及启动子插入到bacmid b MON14272的多角体位置,获得重组bacmid Ac-P7-2,并通过Western blot检测P7-2基因的表达。转染sf9细胞后通过光学显微镜观察重组病毒多角体的形成并统计不同时间细胞死亡数量。通过TCID50的方法绘制病毒生长曲线。[结果]成功构建了P7-2基因重组AcMNPV bacmid Ac-P7-2,Western blot检测到P7-2蛋白可以正确表达。在转染sf9细胞48、72、96和120 h后,重组病毒v Ac-P7-2细胞死亡数量显著高于野生型病毒v Ac-WT,并发现重组病毒v Ac-P7-2多角体形成并释放的速度也快于野生型病毒v Ac-WT。病毒的生长曲线显示,在转染sf9细胞48、72、96和120 h后,v Ac-P7-2的增殖速度显著快于v Ac-WT。[结论]成功构建了多角体形成迅速的重组病毒v Ac-P7-2,与野生型病毒v Ac-WT相比其具有较快的增殖速度,对寄主细胞有较强致死作用。     

杆状病毒ac30基因的序列分析及其功能

通过生物信息学初步分析苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)基因组第30开放阅读框(ac30)及其同源基因的特征,并在此基础上利用ET-重组技术构建ac30缺失突变体,探讨其在AcMNPV感染Sf-9细胞时的功能。结果表明:ac30的开放阅读框(ORF)全长为1 392bp,GC含量为43%,编码氨基酸463个,预计分子质量为54.7ku。从转染或感染的病毒生长曲线变化趋势来看,ac30的缺失对病毒产生有感染力的BV粒子没有影响,说明ac30基因是AcMNPV病毒在Sf-9细胞复制中的非必需基因。     

杆状病毒AcMNPV中Ac109蛋白的抗虫功能分析

为研究苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)中病毒增殖因子Ac109对鳞翅目害虫甜菜夜蛾幼虫的抗虫效应,采用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统构建了重组病毒AcMNPV-Ac109-EGFP。免疫印迹和荧光显微镜观察结果证实,重组病毒AcMNPV-Ac109-EGFP侵染昆虫Sf9细胞后Ac109的表达量和细胞的荧光强度随着侵染时间延长而显著增加。抗虫试验表明,与AcMNPV处理组、PBS对照组相比,AcMNPV-Ac109-EGFP病毒处理组的幼虫体质量增长缓慢,有较高的致死率和低的蛹化率及羽化率;AcMNPV与AcMNPV-Ac109-EGFP病毒处理组的最终死亡率分别为58.33%和73.33%;蛹化率分别为41.667%和25.000%;羽化率分别为20.00%和11.67%,说明Ac109可提高病毒对甜菜夜蛾幼虫的抗虫性。以上结果构建了1株高抗虫活性的重组病毒,并为这个重组病毒潜在的应用价值提供了试验依据。     

FOXO基因对印楝素诱导sf9细胞凋亡的影响

【目的】探讨印楝素（azadirachtin, AZA）通过转录因子FOXO诱导草地贪夜蛾卵巢细胞sf9凋亡的分子机制。【方法】将体外培养的草地贪夜蛾卵巢细胞分为AZA处理组和未处理组,采用CCK-8法检测AZA 对sf9 细胞增殖的影响;透射电镜观察sf9细胞的超微结构变化;流式细胞术分选Annexin V-FITC/PI染色的凋亡细胞;Western blot 检测p-FOXO及凋亡相关蛋白的表达情况; RNAi FOXO后,检测FOXO基因表达量与Caspase-3的酶活性变化。【结果】CCK-8检测发现AZA可显著抑制sf9细胞增殖,并呈时间和浓度依赖性;通过透射电镜检测到5 mmol/L AZA可破坏sf9细胞的微观结构,导致细胞核收缩,染色质聚集,细胞质空泡状;流式细胞术分选Annexin V-FITC/PI染色的凋亡细胞,发现AZA诱导sf9细胞凋亡与时间呈正相关;进一步通过Western blot检测凋亡相关蛋白,发现AZA可诱导凋亡相关蛋白 Bim和 Cleaved Caspase-3的表达水平显著增加,而P-FOXO蛋白表达量降低,FOXO总蛋白表达无明显差异;利用qRT-PCR进一步检测发现,FOXO基因表达量与AZA处理时间呈正相关,在此基础上通过RNAi技术沉默FOXO后,经AZA处理发现Caspase-3的酶活性显著降低。【结论】AZA可通过上调FOXO基因抑制草地贪夜蛾卵巢细胞sf9的增殖并诱导其凋亡。     

苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒对东方粘虫痘病毒的增效作用

苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrosisvirus,AcMNPV)能够增强粘虫痘病毒(Pseudaletia separata entomopoxvirus,PsEPV)的侵染力。将两种病毒的混合悬液滴于50mg的饲料上,接入3龄末东方粘虫(Mythimna separata)的幼虫进行生物测定。当每头幼虫接入1.0×10~4 OBs的AcMNPV和1.0×10~7 OBs的PsEPV的混合液时,幼虫的死亡率为95.00%,而单独用1.0×10~7 OBs·虫~(-1)AcMNPV处理时,则幼虫不感染;单独用1.0×10~7 OBs·头~(-1)PsEPV处理时,只获得46.33%的死亡率。将AcMNPV多角体蛋白与病毒粒子分离,进一步测定,单独用1.0×10~6 OBs·虫~(-1) PsEPV侵染3龄末幼虫时,幼虫不被感染,而用同样浓度再混以AcM- NPV多角体蛋白或病毒粒子时,则会有41.67%和36.67%的死亡率,说明多角体蛋白或是病毒粒子的包涵体蛋白是产生增效作用的重要因子。     

保护地蔬菜病虫害发生特点及其综合防治

根据保护地蔬菜病虫害发生特点,掌握综合防治方法,把病虫为害损失控制在经济允许水平之下,达到优质、高产、低成本和农产品无污染的目的。     

雪松的栽植及后期管护

雪松是常绿的观赏树种,栽植时要选择恰当的栽植季节、苗木和采取正确的挖掘方法,后期管护浇水、施肥,加强高温季节以及越冬的管护。     

牡蛎的营养保健功能及其开发利用

介绍了牡蛎的营养价值、保健功能和产品开发利用的现状,并分析了牡蛎产品开发的前景及存在的问题。     

精甲霜灵与百菌清在黄瓜和土壤中的残留降解规律研究

[目的]研究精甲霜灵与百菌清在黄瓜和土壤中的残留状况与残留降解规律,评价精甲霜灵与百菌清在黄瓜上使用的安全性,建立同时测定黄瓜和土壤中精甲霜灵与百菌清残留量的液相色谱分析方法。[方法]黄瓜和土壤中的精甲霜灵与百菌清采用乙腈溶液振荡提取,使用酸性氧化铝固相萃取小柱净化,液相色谱带二极管阵列检测器（DAD）测定,外标法定量;田间试验按照NY/T 788-2004《农药残留试验准则》进行。[结果]在添加量为0.02～2.00 mg/kg时,精甲霜灵在黄瓜和土壤中的添加平均回收率为84.7%～101.0%,变异系数为2.72%～6.46%;当添加量为0.01～1.00 mg/kg时,百菌清在黄瓜和土壤中的添加平均回收率为76.9%～95.8%,变异系数为3.36%～4.90%。精甲霜灵的最小检出量为5×10-10 g,百菌清为2×10-10 g;精甲霜灵的最低检出质量分数为0.02 mg/kg,百菌清为0.01 mg/kg。精甲霜灵和百菌清在黄瓜和土壤中的残留消解动态符合方程Ct=Coe-kt;精甲霜灵在黄瓜中的半衰期为2.8～3.2 d,在土壤中的半衰期为7.8～9.8 d;百菌清在黄瓜中的半衰期为1.3～2.1 d,在土壤中的半衰期为3.7～4.0 d。在黄瓜上施用精甲霜灵.百菌清440 g/L悬浮剂,施药剂量为推荐用量990 g a.i/hm2和推荐用量的1.5倍1 485 g a.i./hm2,施药3～4次,末次施药1 d后黄瓜中的精甲霜灵残留量低于联合国食品法典委员会（CAC）规定的最大残留限量值（MRL）0.5 mg/kg,百菌清残留量低于CAC规定的MRL值5.0mg/kg。[结论]精甲霜灵.百菌清440 g/L悬浮剂按推荐剂量施用,1 d后收获的黄瓜食用安全。     

论现代农业,农业科技发展与高校教学和科研组织

本在论述世界家业发展的三个阶段和现代农业科学技术特点及其对农业人才素质要求的基础上,提出了高等农业教育应当处理好专与博关系、两络与教师关系、外在知识系统性与内在思维创造性关系,指出了在学校管理中,应当逐步克服传统弊端,哿横向管理力度。     

劳伦斯和他的《儿子与情人》

劳伦斯的《儿子与情人》体现了母子冲突自古有之的文学主题。由于婚姻生活的不幸,直接或间接地造成了母亲与儿子之间的爱恨缠绵的冲突。畸变的母爱使得儿子在本应属于自己的生活天地中失去了自主性与独立性,产生了悲剧。     

隰县河沟流域水土流失及其防治对策

在综合调查的基础上,分析了隰县河沟流域水土流失形式、分布、危害及其形成原因,并据此提出了调整土地利用结构,加强基本农田建设,适当发展果树和经济林、建立生物和工程相结合的水土流失综合控制体系,为建设高产、优质、高效农业提供保障,积极发展多种经营,重视庭院经济及聚落周围经济建设的研究,加快水土流失综合治理步伐。     

高校思想政治教育与创新创业教育的双向构建

高校顺应社会经济发展要求,越来越重视思想政治教育与创新创业教育的融合。分析了思想政治教育与创新创业教育的互动关系,阐述了思想政治教育与创新创业教育双向构建优势,提出了构建的对策:教育理念层面实现互相融合、教学内容层面实现丰富升华、实践活动层面实现有机结合和组织管理层面实现系统完备。     

家畜繁育生物技术研究开发与产业化推广应用

家畜繁育生物技术包括人工授精、胚胎移植、体外受精、动物性别控制、动物克隆、转基因动物、干细胞等多元化的生殖生物工程技术。繁育生物技术的早期研究开发阶段主要集中在20世纪,到产业化推广应用经历了大约一个世纪的历程。目前,包括动物细胞性别控制、转基因-克隆技和干细胞技术已经进入产业化应用阶段,并且在人类疾病治疗方面显示了潜在的应用前景。     

绿色富硒不知火高产优质栽培与管理

阐述了绿色富硒不知火的品质优势和价格优势,并根据不知火的生态特性和生长习性,从园地选择、土壤改良、开垦定植、整形修剪、肥水管理、杂草管理、病虫害防治、结果期管理整个栽培流程8个方面进行了详细的阐述,以期通过严格科学的管理技术获得高产优质的富硒绿色不知火产品。