绿色木霉外源基因表达系统的构建

利用PCR方法克隆瑞氏木霉(Trichoderma reesei)外切葡聚糖纤维二糖水解酶Ⅰ基因(cbhⅠ)启动子序列,以pSK载体为骨架,构建了pSK-cbh Ⅰ-GFP-hph表达载体,并成功转入到绿色木霉(T.viride)Sn-9106中.通过对绿色木霉Sn-9106进行遗传改造,为纤维素酶基因在木霉中同源重组表达提供遗传转化平台.     

里氏木霉外源表达载体的构建

[目的]构建里氏木霉外源表达载体。[方法]以里氏木霉40359的CBHI启动子和终止子构建了里氏木霉40359外源表达载体,并用该表达载体成功表达了抗潮霉素B磷酸转移酶基因,得到6株可在含175 mg/L潮霉素的基础培养基上生长的抗性菌株;提取6株抗性菌株的DNA整合到里氏木霉菌株中,并对其进行潮霉素耐受性检测。[结果]6株抗性菌株的抗潮霉素能力比原始菌株提高了75%;转基因菌株的潮霉素抗性可以稳定遗传,证明表达载体构建成功。[结论]为开展里氏木霉分子生物学研究与遗传改造奠定了基础。     

里氏木霉外源表达载体的构建（摘要）

[目的]构建里氏木霉外源表达载体。[方法]以里氏木霉40359的CBHI启动子和终止子构建了里氏木霉40359外源表达载体,并用该表达载体成功表达了抗潮霉素B磷酸转移酶基因,得到6株可在含175mg/L潮霉素的基础培养基上生长的抗性菌株;提取6株抗性菌株的DNA整合到里氏木霉菌株中,并对其进行潮霉素耐受性检测。[结果]6株抗性菌株的抗潮霉素能力比原始菌株提高了75%;转基因菌株的潮霉素抗性可以稳定遗传,证明表达载体构建成功。[结论]为开展里氏木霉分子生物学研究与遗传改造奠定了基础。     

β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因在粟酒裂殖酵母中的表达及功能分析

【目的】克隆绿色木霉β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因,并在粟酒裂殖酵母细胞中进行表达分析。【方法】利用PCR技术,从绿色木霉中克隆纤维素酶β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因的DNA序列,再通过XhoⅠ和NotⅠ2个酶切位点与粟酒裂殖酵母表达载体pREP5N连接,构建酵母真核表达载体,利用电转化方法转化粟酒裂殖酵母SP-Q01细胞,并在SP-Q01中进行表达分析,最后采用DNS法测定表达产物的酶学活性。【结果】PCR扩增得到2 380bp的bglⅠ基因序列,包括完整的CDS序列和信号肽序列,编码序列与已报道的里氏木霉纤维素酶基因序列相似性为100%;对酵母转化子进行诱导培养后,SDS-PAGE电泳检测得到大小为76ku的目的蛋白条带,在SP-Q01细胞中重组酶活性最高达155U/mL,最佳培养时间为72h,产生酶活的最适温度为60℃。【结论】成功克隆出了绿色木霉β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因的DNA序列,该基因能在粟酒裂殖酵母细胞中成功表达,为绿色木霉β-葡萄糖苷酶bglⅠ基因的深入研究和应用奠定了基础。     

高产纤维素酶绿色木霉基因工程菌的构建

[目的]构建CBHⅡ基因过量表达的绿色木霉工程菌。[方法]根据绿色木霉cDNA序列设计合成引物,PCR扩增CBHⅡ基因序列,将完整的目的基因与表达载体pCAMBIA1302连接,转入大肠杆菌DH5α中,获得重组质粒pCAMBIA1302-CBHⅠ。再将pCAM-BIA1302-CBHⅠ重组质粒与瑞氏木霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶Ⅱ（CBHⅡ）PcbhⅡ启动子片段连接,将潮霉素磷酸转移酶（hyg）基因片段插入PcbhⅡ启动子下游,转入大肠杆菌DH5α中,获得重组表达质粒pCAMBIA1302-CBHⅡ。[结果]构建的重组表达质粒电转化后经SDS-PAGE电泳检测,绿色木霉纤维素酶CBHII基因在原宿主菌中成功过量表达,证实CBHⅡ基因在PcbhⅡ启动子控制下进行高效表达。[结论]为高产纤维素酶系的工业化菌株构建奠定基础。     

鲎素对几种常见基因工程菌的抑杀研究

采用肉汤微量稀释法和MTT法分别测定了鲎素对基因工程菌大肠杆菌BL21、枯草芽孢杆菌WB800、枯草芽孢杆菌BS168、酵母菌GS115、里氏木霉QM9414的MIC(最小抑菌浓度)及其MBC(最小杀菌浓度)值.结果表明,其MIC值分别为10、10、10、20、40 μg/mL,MBC值分别为20、20、20、40、80μg/mL.鲎素对上述5种常见基因工程菌均有不同程度的抑杀作用,考虑到鲎素基因表达量低甚至不表达,很可能是由于鲎素对宿主的抑杀作用,相比于其他基因工程菌,认为丝状真菌里氏木霉QM9414作为鲎素的表达宿主有比较大的潜能.     

康氏木霉HEX1蛋白的原核表达及纯化

【目的】对康氏木霉HEX1蛋白进行原核表达和纯化,为进行抗体制备及深入研究HEX1功能奠定基础。【方法】采用RT-PCR方法扩增康氏木霉hex1基因,构建pMD19-T-hex1重组克隆质粒,在此基础上构建pET28a-hex1表达载体,转化E.coli BL21(DE3)细胞。通过IPTG诱导表达,对重组HEX1蛋白进行可溶性分析、纯化及鉴定。【结果】成功克隆了长660bp的hex1基因并构建了融合表达载体,HEX1蛋白在IPTG诱导下得到表达。融合蛋白主要以包涵体形式存在,能与抗His标签的兔多克隆抗体发生特异性反应,并纯化出了融合表达蛋白。【结论】康氏木霉HEX1蛋白在原核细胞中得到成功表达及纯化,获得了分子质量约为25ku的重组蛋白。     

盐穗木醛脱氢酶基因HcALDH7A1原核表达载体的构建及蛋白诱导表达与优化

[目的]为构建盐穗木盐响应基因HcALDH7A1的原核表达载体并进行外源基因的诱导表达和优化.[方法]以实验室已构建好的p mD18-T Simple-HcALDH7A1/DH5α(Pst Ⅰ,SacⅠ)重组载体中盐穗木醛脱氢酶基因(HcALDH7A1)为模板,设计带有酶切位点(EcoRⅠ,XhoⅠ)的引物通过PCR扩增亚克隆到p mD18-TSimple vector中,测序鉴定正确后,通过EcoRⅠ和Xho Ⅰ双酶切,构建重组的原核表达载体pET28a-HcALDH7 A1.将鉴定正确的重组质粒转化到大肠杆菌Transetta(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,SDS-PAGE检测目的蛋白表达,并对其表达体系进行优化.[结果]成功构建盐穗木醛脱氢酶基因HcALDH7A1的原核表达载体,诱导HcALDH7A1外源基因表达蛋白优化的最佳条件为IPTG终浓度为0.6 mmol/L,30℃诱导时间为4h.融合蛋白分子量大小为61 kD.[结论]成功在大肠杆菌体内诱导表达盐穗木醛脱氢酶HcALDH7A1基因,并明确目的蛋白的最佳表达条件.为后续在原核表达系统大肠杆菌细胞中探索盐穗木HcALDH7A1的生物和非生物胁迫的功能奠定了基础.     

低纤维素酶背景里氏木霉菌株的构建和应用

丝状真菌里氏木霉（Trichoderma reesei）产生的纤维素酶主要包括纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。在使用里氏木霉表达外源基因时,它们会形成较高的纤维素酶背景,而且其表达还可能会导致对细胞转录、翻译和分泌等相关资源的占用。应用CRISPR/Cas9技术,在体外组装Cas9/gRNA复合物并转化里氏木霉以定点敲除主要的纤维二糖水解酶cbh1基因,同时结合RNAi干扰技术来沉默主要的内切葡聚糖酶eg2基因,以期一步构建里氏木霉低纤维素酶背景的表达系统。获得了一株纤维素酶表达显著下降的11号转化子SUS6。该转化子中,cbh1的表达完全消失,而eg2基因的表达水平较出发菌株SUS5降低了98%。以该转化子为宿主表达外源基因NfBgl3A,两个代表性转化子的β-葡萄糖苷酶酶活最高分别为172.4和79.3 U·mL^-1,远高于以出发菌株（高纤维素酶背景）为宿主表达β-葡萄糖苷酶酶活（两个代表转化子分别为11.6和31.9 U·mL^-1）。因此,构建低纤维素酶背景的菌株作为表达宿主,还可明显的提高某些异源基因的表达水平。     

里氏木霉纤维二糖水解酶基因cbh1的分子改造

[目的]用分子改造的方法改造里氏木霉(Trichoderma reesei的纤维二糖水解酶基因cbh1,提高其纤维素酶活力,为工业化生产纤维素酶提供参考.[方法]用DNaseI消化里氏木霉cbh1,回收100 bp左右的片段后用T4 DNA连接酶连接,以连接产物作为模板进行PCR扩增,将PCR改造的cbh1基因转化里氏木霉原生质体,使改造的cbh1基因与里氏木霉原有的cbh1基因发生同源重组.通过比较滤纸酶活力的方法筛选纤维素酶活力提高的突变菌株,在NCBI上比对分析突变菌株的cbh1序列.[结果]经克隆测序获得基因片段大小为637 bp,与里氏木霉同属菌株cbh1基因的相似性在88‰98％,确定为里氏木霉cbh1的基因片段.经DNaseI消化15 min、T4 DNA连接酶连接、经PCR扩增获得改造后的cbh1基因.将改造cbh1基因片段转化里氏木霉原生质体,得到cbh1基因突变体库.从cbh1基因突变体库中筛选获得1株纤维素酶滤纸酶活比出发菌株高1.7518倍的突变菌株E2-1.序列比对分析发现,与出发菌株相比,突变菌株E2-1的cbh1基因有14个碱基发生了突变,其中5个碱基为置换突变,8个碱基为缺失突变,1个碱基为插入突变,分布于cbh1基因的9个位置.[结论]改造后的cbhl因能与里氏木霉的染色体DNA发生同源重组,进而提高突变菌株的纤维素滤纸酶活力.     

低纤维素酶背景里氏木霉菌株的构建和应用

丝状真菌里氏木霉（Trichoderma reesei）产生的纤维素酶主要包括纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶。在使用里氏木霉表达外源基因时，它们会形成较高的纤维素酶背景，而且其表达还可能会导致对细胞转录、翻译和分泌等相关资源的占用。应用CRISPR/Cas9技术，在体外组装Cas9/gRNA复合物并转化里氏木霉以定点敲除主要的纤维二糖水解酶cbh1基因，同时结合RNAi干扰技术来沉默主要的内切葡聚糖酶eg2基因，以期一步构建里氏木霉低纤维素酶背景的表达系统。获得了一株纤维素酶表达显著下降的11号转化子SUS6。该转化子中，cbh1的表达完全消失，而eg2基因的表达水平较出发菌株SUS5降低了98%。以该转化子为宿主表达外源基因NfBgl3A，两个代表性转化子的β-葡萄糖苷酶酶活最高分别为172.4和79.3 U·mL^-1，远高于以出发菌株（高纤维素酶背景）为宿主表达β-葡萄糖苷酶酶活（两个代表转化子分别为11.6和31.9 U·mL^-1）。因此，构建低纤维素酶背景的菌株作为表达宿主，还可明显的提高某些异源基因的表达水平。     

农杆菌介导法构建里氏木霉ura3基因突变体的研究

构建了ura3缺失基因载体pEMT-△ura3,采用农杆菌介导法转化里氏木霉QM9414,在含尿嘧啶核苷(1.87 mg.mL-1)和五氟乳氰酸(5-FOA,5 mg.mL-1)的筛选培养基上筛选转化子,经表型验证和PCR检测,获得ura3基因缺失突变体1株,ura3基因的同源重组率为16.6%。采用农杆菌介导法将黑曲霉的pyrA基因导入ura3基因缺失突变体中,使其回复野生型表型,从而建立了以pyrA基因作为筛选标记的里氏木霉受体菌株。     

玉米ZmPsaH基因真核表达载体的构建及转化

[目的]PsaH是光合系统Ⅰ(PSI)中的一个亚基,在植物光合系统中起着重要的作用.为研究玉米ZmPsaH基因在抗逆中的作用提供基础.[方法]构建玉米ZmPsaH基因真核表达载体是了解玉米中该基因功能的重要途径之一.利用RT-PCR技术扩增得到大小约为420 bp的玉米ZmPsaH基因,经限制性内切酶SalⅠ和NotⅠ进行消化,将目的基因与真核表达质粒pREP-5N连接,获得重组真核表达质粒ZmPsaH-5N.[结果]通过菌落PCR、双酶切及测序等方法进行鉴定,重组真核表达质粒ZmPsaH-5N构建成功.制备酵母感受态,将重组质粒电击转入酵母中,酵母菌落PCR结果显示电击转化成功.[结论]成功构建了玉米ZmPsaH基因真核表达载体,并且成功转化了酵母.     

盐穗木HcPS_H基因真核表达载体的构建及转化

[目的]盐穗木(Halostachys caspica)属藜科盐生植物,是广泛分布于新疆干旱或半干旱荒漠盐碱环境中的一种极端耐盐的多年生稀盐多汁半灌木,对盐分适应性极强.PS_H基因是一个参与光合反应光系统的基因,在植物光合作用中起着重要的作用.构建盐穗木HcPS_H基因真核表达载体对于了解该基因在盐穗木耐盐过程中的作用有着重要意义.[方法]利用PCR技术扩增得到大小为441 bp的盐穗木HcPS_H基因,经限制性内切酶SalI和NotI进行消化,将目的基因与真核表达质粒pREP-5N连接,获得重组真核表达质粒HcPS_H-5N.[结果]通过菌落PCR、双酶切及测序等方法进行鉴定,重组真核表达质粒HcPS_H-5N构建成功.制备酵母感受态,将重组质粒电击转入酵母中,酵母菌落PCR结果显示电击转化成功.[结论]成功构建盐穗木HcPS_H基因真核表达载体,并且能在真核细胞中正常表达.     

番鸭源禽1型副黏病毒HN基因主要抗原结构域和V基因融合表达载体的构建

为构建番鸭源禽1型副黏病毒HN主要抗原结构域(HNd)和V基因融合表达载体,经PCR及融合PCR分别从重组质粒pMDHN和pMDP中扩增HN基因主要结构域和V基因cDNA.将HNd经KpnⅠ和BamHⅠ双酶切、V基因用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后,分别定向插入真核载体pcDNA3的多克隆位点相应的酶切位点中,对2个单表达质粒pcDNAHNd和pcDNAV进行酶切和测序鉴定.利用融合PCR技术扩增出HNd-V基因,定向克隆至pcDNA3的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切酶切位点之间,转化感受态细胞后,经PCR反应初筛后,对阳性克隆进行酶切分析及测序鉴定.对单表达重组质粒进行酶切分析及测序鉴定,结果表明:HNd和V基因已被正确定向克隆至真核表达载体peDNA3,成功构建了2个基因的单表达质粒pcDNAHNd和pcDNAV;对融合重组质粒酶切分析和测序鉴定表明,HNd-V融合基因正确克隆进真核表达质粒pcDNA3中,成功构建了融合表达载体pcDNAHNd-V.     

盐生植物盐穗木HcPS_H基因大肠杆菌表达载体的构建

[目的]构建盐穗木HcPS_H基因的大肠杆菌表达载体。[方法]以质粒pGEM-T-HcPS_H为模板,HcPS_H-pET28a-F、HcPS_H-pET28a-R为引物进行PCR扩增,获得两端含酶切位点的HcPS_H基因目的片段。将该目的片段与大肠杆菌表达载体pET-28a通过T4DNA连接酶连接,并转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,得到重组子克隆,抽质粒进行测序鉴定。[结果]扩增出HcPS_H基因片段长度为441 bp,将其连接到大肠杆菌表达载体pET-28a上后,得到重组子质粒,经PCR检测、双酶切验证及测序鉴定,表明成功构建原核表达载体。[结论]该研究成功构建了盐穗木HcPS_H基因的大肠杆菌表达载体,为进一步进行该基因功能的研究奠定了基础。     

利用重叠PCR法克隆里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因cel1a

在利用里氏木霉降解纤维素为葡萄糖继而发酵生产液体燃料和大宗化学品的工业生产过程中,降解纤维素为葡萄糖是关键的一步。β-葡萄糖苷酶在调控纤维素酶的活性及其表达时起到至关重要的双重作用。为了研究β-葡萄糖苷酶Cel1a在里氏木霉Rut C-30中对纤维素酶诱导表达及其酶活性的影响,以里氏木霉的基因组DNA为模板,设计扩增看家基因(β-actin)的启动子(Pact)和cel1a的引物,分别进行Pact、cel1a的PCR扩增,然后利用重叠PCR将Pact、cel1a连成1个片段Pact-cel1a,再通过酶切成功地将Pact-cel1a片段连接到p CAMBIA1300二元质粒上,从而为后续研究β-葡萄糖苷酶在调控纤维素酶的酶活性及其表达过程中的作用奠定了基础。     

水蛭素基因植物表达载体的构建

在不改变水蛭素原氨基酸序列前提前下,根椐植物基因密码子选择偏向,对水蛭素基因序列进行了改造．在设计和合成的水蛭素基因序列中添加了先导链、poly(A)尾、XbaⅠ和SacⅠ双酶切位点．将所合成序列与双元载体pBI121重组,构建成pBI121-hir植物高效表达载体．经抗性筛选法、琼脂糖凝胶电泳和测序3种方法鉴定,该载体构建成功．     

三种鸭防御素真核表达载体的构建及其表达分析

为研究鸭防御素的真核表达,人工合成了鸭防御素AvBD2、AvBD10和AvBD12基因,并将其插入到真核表达质粒pDoubleEx-EGFP-flag-N中构建重组表达质粒;重组表达质粒经酶切鉴定正确后,分别转染HEK293细胞进行表达,用RT-PCR和Westem-blot鉴定目的基因的表达情况。结果表明,酶切鉴定证实目的基因成功插入到真核表达质粒中;真核表达质粒转染HEK293细胞24 h后,在荧光显微镜下可见绿荧光蛋白表达;RT-PCR能检测到目的基因mRNA,但Western-blot没有检测到目的蛋白的表达条带。     

弓形虫GRA3基因真核表达质粒的构建与鉴定

以pGEX-GRA3为模板,经PCR扩增获得弓形虫GRA3基因,克隆于pMD-18T simple载体上。重组质粒经PCR鉴定、PstⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后测序分析,再将其定向插入真核表达载体pVAXⅠ,构建真核表达重组质粒pVAX-GRA3。经PCR和酶切鉴定后,将重组质粒pVAX-GRA3转染Hela细胞,然后进行RT-PCR检测。RT-PCR结果表明,检测到了目的基因的存在,说明pVAX-GRA3成功转入Hela细胞。