双酶水解黄粉虫蛋白制备生物活性肽的工艺优化

【目的】对胰蛋白酶与碱性蛋白酶Alcalase双酶组合水解黄粉虫蛋白制备生物活性肽的工艺进行优化,为获得高活性黄粉虫蛋白多肽及有效利用黄粉虫蛋白提供科学依据。【方法】以水解度和酸溶性肽得率为指标,研究了酶解时间、酶活比、料液比、加酶量、pH和酶解温度6种因素对酶解反应的影响。在此基础上设计了3因素(加酶量、pH和酶解温度)3水平的响应面试验。【结果】胰蛋白酶与碱性蛋白酶Alcalase双酶水解黄粉虫蛋白的最佳酶解条件为:酶解时间120 min,酶活比1∶1,料液比1∶3,加酶量23.41 mg/g,pH 8.77,酶解温度53.41℃。【结论】利用优化双酶水解条件制得的低分子多肽的水解度高达21.61%,酸溶性肽得率为92.09%。     

双酶水解麦胚制备抗氧化肽的工艺优化

以麦胚为原料,制备具有抗氧化活性的麦胚肽。对碱性蛋白酶Alcalase 2.4 L与胰蛋白酶双酶组合酶解麦胚的工艺进行优化。以水解度和1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基清除率为考察指标,探讨酶与底物浓度的比值([E]/[S])、酶降温度和酶解时间对制备麦胚抗氧化肽工艺的影响,采用Box-Behnken中心组合设计和响应面法(RSM)优化了麦胚双酶水解的工艺条件。结果表明:双酶水解麦胚制备抗氧化肽的工艺条件为底物浓度10.0%、碱性蛋白酶与胰蛋白酶酶活比1∶1、[E]/[S]为0.041 3、酶解温度50.3℃、酶解时间2.03 h、pH8.0。验证试验表明,在此条件下,麦胚水解度和抗氧化肽对DPPH自由基清除率分别为16.65%和50.16%;其抗氧化活性小于10 mg/ml VC。     

风味蛋白酶酶解波纹巴非蛤制备小分子肽工艺研究

以波纹巴非蛤为原料,通过风味蛋白酶酶解制备小分子肽,并应用响应面分析法对波纹巴非蛤的酶解条件进行优化,确定酶解波纹巴非蛤制备小分子肽的最佳条件。试验结果表明:酶解温度50℃、酶解时间3.5 h、风味蛋白酶(E)与底物波纹巴非蛤肉(S)的质量比为3.1∶100时,酶解液的小分子肽得率为38.15%,与响应面模型所预测的小分子肽得率39.07%比较接近。     

马氏珠母贝肉酶解条件优化及其产物活性分析

[目的]优化超声波辅助酶解马氏珠母贝肉工艺条件,并对酶解产物进行自由基清除活性分析,为马氏珠母贝肉的高值化利用提供参考依据.[方法]以马氏珠母贝肉为原料,采用单因素及响应面试验分析酶解温度、加酶量、超声功率和酶解时间对珠母贝肉蛋白质水解度的影响,确定最佳工艺参数,并测定酶解产物对羟基自由基(·OH)、超氧自由基(O2)及DPPH自由基(DPPH·)的清除能力.[结果]影响马氏珠母贝肉酶解效果的4个因素主次顺序为:超声波功率>加酶量>酶解温度>酶解时间,其中酶解温度、加酶量和超声波功率影响极显著(P<0.0 1),酶解时间及加酶量与超声波功率的交互作用影响显著(P<0.05).马氏珠母贝肉最佳超声波辅助酶解条件为:酶解温度48℃、加酶量2200 U/g'超声波功率13%(总输出功率900W)、酶解时间12 min,在此条件下的蛋白质水解度为21.937%,与预测值(22.140%)的相对误差为0.92%.酶解产物对·OH、O2-和DPPH·的清除能力随酶解产物质量浓度的增加而增强,当质量浓度为2.0 mg/mL时,清除率分别为68.85%、83.62%和82.36%.[结论]优化得到的超声波辅助酶解马氏珠母贝肉工艺参数准确可靠,酶解时间显著缩短,酶解产物具有明显的清除自由基活性,可作为具有抗氧化作用的保健食品、保健酒等产品的优质原料.     

响应面法优化孔鳐软骨抗氧化多肽的酶解工艺

[目的]探讨酶解法制备孔鳐鱼软骨抗氧化肽的最佳工艺。[方法]以孔鳐软骨为试验材料,以DPPH自由基清除率为考察指标,采用双酶复合法酶解制备抗氧化多肽,通过响应面分析优化为最佳酶解工艺参数。[结果]采用胰蛋白酶与碱性蛋白酶复配(1∶3)组合制备酶解物的抗氧化性最好,酶解的最优工艺条件为:p H 8.5,加酶量6.25%,料液比2.1%,温度50.19℃,预测的DPPH自由基清除率为34.45%。[结论]通过响应面设计优化确定了孔鳐软骨抗氧化多肽的酶解工艺,为软骨鱼类高值化利用提供技术支持。     

复合酶法水解大麦虫蛋白制备酸性多肽及其抗氧化活性

采用复合蛋白酶(胰蛋白酶、碱性蛋白酶)对大麦虫蛋白进行控制酶解,研究酶解时间、酶活比、底物浓度、酶解温度、pH与加酶量等对酶解反应的影响;采用中心组合试验设计,优化酶解工艺;并对大麦虫酸性多肽清除自由基能力进行了测定评价.结果表明,酶解最佳条件为底物浓度5%,时间120 min,胰蛋白酶∶碱性蛋白酶1∶1,pH 8.71,温度48℃,加酶量16.91 mg/g.该酸性多肽对(O)_2~(-·))、DPPH·自由基有很好的清除作用,具有很强还原力.利用优化工艺制得酸性肽得率为79.05%.     

双酶直接酶解米糠制备短肽的工艺优化

 【目的】建立在中低温度下直接酶解米糠制备短肽的优化工艺。【方法】采用二次回归正交旋转组合设计优化直接酶解米糠制备短肽的工艺条件,其中总糖含量测定采用蒽酮比色法,水解度（degree of hydrolysis,DH）采用pH-stat法,蛋白质回收率采用凯氏定氮法。【结果】确定直接酶解米糠制备短肽最佳工艺条件为：米糠先经糖酶（viscozyme）反应2 h去除糖类杂质,然后用碱性蛋白酶（alcalase）和胰蛋白酶双酶水解,最适pH 8.2,温度45℃,alcalase与胰蛋白酶酶活比59﹕41,总酶活5 750 U/g底物,水解时间3 h。在此条件下,DH为23.04%,蛋白质回收率为84.33%,酸溶性多肽（TCA-SN）为68.40%,短肽分子量主要集中在1 000 D以下。【结论】在中低温和偏中性（pH 8.2）条件下,采用碱性蛋白酶和胰蛋白酶双酶直接酶解米糠制备短肽,与先提取蛋白后酶解制备短肽的方法相比,具有操作步骤简单、蛋白质利用率高等特点,是一种制备米糠肽的新途径。     

单-双酶法制备苏麻饼粕多肽工艺的优化

为脱脂苏麻饼粕的开发利用提供参考，以可溶性氮含量及多肽提取指数为指标，考察原料处理方式、酶种类、酶底比、酶解方法等因素对苏麻多肽提取的影响；并优化单-双酶法直接酶解苏麻饼粕制备苏麻多肽工艺。结果表明：碱性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶单独酶解的最佳工艺是酶底比分别为5%、7%和5%，料液比均为3%，50℃酶解6 h，该条件下，碱性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶单独酶解的多肽提取指数分别为（49.05±0.91）%、（47.98±0.36）%和（44.22±0.87）%。双酶法酶解的最佳工艺为料液比5%，55℃条件下，先加3.5%的胰蛋白酶在pH8.0条件下酶解3 h，调节pH为9.5后再利用3.5%的碱性蛋白酶酶解3 h，该条件下，酶解液中可溶性氮含量较单酶酶解显著提高，苏麻多肽提取指数达（52.88±0.39）%。     

单-双酶法制备苏麻饼粕多肽工艺的优化

为脱脂苏麻饼粕的开发利用提供参考,以可溶性氮含量及多肽提取指数为指标,考察原料处理方式、酶种类、酶底比、酶解方法等因素对苏麻多肽提取的影响,优化单-双酶法直接酶解苏麻饼粕制备苏麻多肽工艺。结果表明:碱性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶单独酶解的最佳工艺是酶底比分别为5%、7%和5%,料液比均为3%,50℃酶解6h,该条件下,碱性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶单独酶解的多肽提取指数分别为(49.05±0.91)%、(47.98±0.36)%和(44.22±0.87)%。双酶法酶解的最佳工艺为料液比5%,55℃条件下,先加3.5%的胰蛋白酶在pH8.0条件下酶解3h,调节pH为9.5后再利用3.5%的碱性蛋白酶酶解3h,该条件下,酶解液中可溶性氮含量较单酶酶解显著提高,苏麻多肽提取指数达(52.88±0.39)%。     

鲤鱼过敏原（胶原蛋白）的体外模拟消化

首先采用酸法提取纯化鲤鱼过敏原（胶原蛋白）,依据美国药典提供的模拟胃液、肠液配方,分别利用胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶对纯化的胶原蛋白进行酶解消化,以SDS-PAGE和免疫印迹分析测定纯化的胶原蛋白在体外模拟胃液、肠液中的消化稳定性及免疫原性.结果表明,鲤鱼胶原蛋白经模拟胃液（胃蛋白酶）消化15min出现较为明显的降解,消化1h的产物仍具有一定的免疫原性;经模拟肠液（胰蛋白酶）消化30min出现较为明显的降解,消化3h的产物仍具有一定的免疫原性;经模拟肠液（胰凝乳蛋白酶）消化1～4h均未出现明显降解,其消化产物仍具有较强的免疫原性.结果提示,鲤鱼胶原蛋白的耐消化性及免疫原性可能是导致食物性过敏反应的重要原因.     

黑眶蟾蜍皮肤白蛋白的纯化及胰蛋白酶抑制活性

[目的]探讨黑眶蟾蜍皮肤白蛋白的纯化及胰蛋白酶抑制活性。[方法]通过离子交换层析和凝胶过滤层析,从黑眶蟾蜍皮肤中得到其白蛋白,命名为BufomA-skin。65nmol／L的BufomA-skin分别与30nmol／Ltrypsin在25℃不同保温时间（0．25—24h）下测定胰蛋白酶抑制活性,计算剩余酶活力。[结果]BufomA-skin为单链蛋白,分子量约为66．7kDa。但在非还原状态下,50～66kDa条带呈弥散样。该蛋白有抑制胰蛋白酶水解小肽底物的活性,但对其他丝氨酸蛋白酶如凝血酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶无抑制。BufomA-skin与胰蛋白酶保温24h后,胰蛋白酶活性无恢复。[结论]黑眶蟾蜍皮肤白蛋白具有稳定的胰蛋白酶抑制活性,在黑眶蟾蜍防御天敌捕食的过程中发挥重要作用.     

黑眶蟾蜍血清白蛋白的纯化及胰蛋白酶抑制活性

通过离子交换层析和凝胶过滤层析,从黑眶蟾蜍(Bufo melanostictus)血清中得到其白蛋白,命名为Bu-fom-SA。该蛋白有抑制胰蛋白酶水解小肽底物活性的作用,但对其他丝氨酸蛋白酶如凝血酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶无抑制。Bufom-SA对温度、pH及还原剂二硫苏糖醇的耐受性较强,3种因素对其胰蛋白酶抑制活性影响不大。黑眶蟾蜍血清白蛋白具有稳定的胰蛋白酶抑制活性,可能在黑眶蟾蜍防御天敌捕食的过程中发挥重要作用。     

洋根中低聚糖的提取

研究国产洋根中低聚糖的提取方法和最佳提取条件。以产自浙江省台州地区的新鲜洋根块茎为试材,先测定其主要组分含量,之后依次进行水提S、evag法除蛋白、乙醇沉淀除多糖,从而提取其中的低聚糖。选择固液比、浸提温度和浸提时间为因素,以提取率为指标,建立3因素4水平正交实验,研究低聚糖的最佳提取条件。可溶性总糖的干基含量达到92.30%(W/W)。通过正交实验得到最优提取条件为:固液比1∶4,浸提温度70℃,浸提时间60 min,此条件下低聚糖得率为52.94%(W/W)。经HPLC测定,洋根低聚糖提取物中低聚果糖含量为53.70%(W/W),接近以蔗糖为底物果糖转移酶催化反应得到的商品低聚糖浓度。该提取方法简便易行,稍加改进后即可用于工业化生产。     

抑制剂和激活剂对梨星毛虫中肠蛋白酶活性的影响

旨在研究不同抑制剂和激活剂对梨星毛虫Illiberis pruni中肠蛋白酶活性的影响。利用生化技术分别测定梨星毛虫幼虫不同龄期的4种中肠蛋白酶（总蛋白酶、强碱性胰蛋白酶、弱碱性胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶）活性,进而在最适龄期（4龄幼虫）测定蛋白酶激活剂（EDTA,MgCl₂,EGTA,CaCl₂）和抑制剂（PMSF,TPCK,STI,TLCK,IAA,DTT）对梨星毛虫中肠蛋白酶活性的影响。结果表明：梨星毛虫幼虫中肠总蛋白酶、强碱性胰蛋白酶、弱碱性胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶均在4龄具有最高酶活性。所有试剂均对总蛋白酶有激活作用;5 mmol/L CaCl₂对强碱性胰蛋白酶抑制作用最高;对弱碱性胰蛋白酶有抑制作用的仅有5 mmol/L DTT;对胰凝乳蛋白酶抑制效果最佳的为10 mmol/L EGTA。所筛选的对梨星毛虫主要中肠蛋白酶具有抑制作用的抑制剂,对以昆虫中肠蛋白酶为靶标的绿色害虫防控技术的开发具有参考价值。     

大豆分离蛋白对幼建鲤肝胰脏发育及消化道蛋白酶活力的影响

研究了大豆分离蛋白（SPI）对10～35g幼建鲤Cyprinus carpio Var．Jian肝胰脏发育及消化道蛋白酶活力的影响。结果表明：饲料中用SPI替代鱼粉蛋白水平对幼建鲤肝胰指数、肝胰脏中的胰蛋白酶、凝乳蛋白酶活力以及肠道中胰蛋白酶、凝乳蛋白酶活力影响极显著（P＜0．01）或显著（P＜0．05）,随着SPI替代鱼粉蛋白比例的增加,蛋白酶活力均极显著下降（P＜0．01）,肝胰指数显著升高（P＜0．05）。用SPI替代鱼粉蛋白后,可引起幼建鲤消化能力下降,肝胰脏和肠道等消化器官的发育受阻,胰蛋白酶和凝乳蛋白酶的活力降低,饲料利用率下降;SPI中胰蛋白酶抑制因子是引起上述症状的重要因素之一。     

A Study on the Inhibitory Potency of Protease Inhibitors in Porcine Colostrum

Porcine colostrum and milk were separated into the acid-soluble fraction (SF) and casein frac-tion (CF) by centrifuge. Trypsin and chymotrypsin inhibitory capacity in porcine colostrum, milk and theircomponents were determined by incubating bovine trypsin or chymotrypsin in a medium. The inhibition of in-sulin-like growth factor Ⅰ (IGF-Ⅰ) and epidermal growth factor (EGF) degradation in pig small intestinal con-tents by porcine colostrum was measured by incubating iodinated IGF-Ⅰ or EGF. Degradation of labeled IGF-Ⅰor EGF was determined by monitoring the generation of radioactivity soluble in 30% trichloroacetic acid(TCA). The results showed that porcine colostrum had high levels of trypsin and chymotrypsin inhibitory ac-tivity and increased the stability of IGF-Ⅰ and EGF in pig intestinal contents. The SF was higher in inhibitorypotency than CF. The present study revealed that the protease inhibitors in porcine colostrum, milk-derivedand colostrum-specific, existed mainly in SF.     

复合微生物制剂对肉仔鸡小肠内容物酶活性的影响

研究复合微生物制剂(乳酸菌 芽孢杆菌)对肉仔鸡小肠内容物酶活性的影响。结果表明:饲喂14天后,基础日粮中添加0.3%复合微生物制剂的肉仔鸡,其胰腺淀粉酶、肠胰蛋白酶和肠糜蛋白酶的活性显著增加,比只饲喂基础日粮的肉仔鸡分别提高了32%、12%和18%。说明肉鸡饲粮中添加乳酸菌和芽孢杆菌,可以刺激肉鸡胰腺淀粉酶和蛋白酶的分泌。     

A Study on Heat Resistance and Initial Characterization of Protease Inhibitors in Porcine Colostrum

Porcine colostrum was separated into the acid-soluble fraction (SF) and casein fraction (CF) by acidifying followed by centrifuge. SF was further separated by liquid chromatography and anisotropic membrane filtration. Capacities of the SF or CF of porcine colostrum, to inhibit trypsin and chymotrypsin activity and to inhibit the epidermal growth factor (EGF) degradation in pig small intestinal contents, were determined under different heat treatments. The study showed that trypsin inhibitors in porcine colostrum survived heat treatments of 100℃ water bath for up to 10 min, but exposure to boiling water bath for 30 min significantly decreased the inhibitory activity. Compared with the trypsin inhibitors, the chymotrypsin inhibitors were more heat-sensitive. SF was more heat-sensitive than CF. Separation of the SF of porcine colostrum by liquid chromatography and anisotropic membrane filtration revealed that the porcine colostrum protease inhibitors, those had the capacity to inhibit the trypsin-chymotrypsin activity and enhanced the stability of EGF in the gastrointestinal(GI) lumen of weaned pigs, existed mainly in SF, milk-derived, were a group of heat-labile small proteins with molecular weight of 10 000-50 000.