克氏原螯虾原肌球蛋白的纯化及过敏原性分析

以13份甲壳类动物过敏患者血清的Western—blotting分析,确定克氏原螯虾主要过敏原为36ku蛋白质．通过盐析、等电点沉淀及热处理等方法纯化该蛋白质,以兔抗拟穴青蟹原肌球蛋白（Tropo-myosin,TM）多克隆抗体的Western—blotting分析,确定该蛋白质为TM．同源性分析表明,克氏原螯虾TM与南美白对虾TM、拟穴青蟹的氨基酸序列相似性较高（〉90％）．酶切位点预测显示,它分别有49个胰蛋白酶和6个胰凝乳蛋白酶的酶切位点．模拟胃肠液消化实验结果显示,纯化TM不易被胃蛋白酶降解,易于被胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶降解,进一步的Western—blotting和抑制性ELISA分析结果显示,其消化产物仍具有一定的免疫活性．采用蒸煮处理可降低TM的消化稳定性及免疫活性,且蒸煮处理时间越长,效果越显著．说明。TM为克氏原螯虾主要过敏原．与其他甲壳娄动物TM的序列相似件较高．     

太平洋牡蛎肌肉蛋白的模拟胃肠液消化研究

采用美国药典提供的模拟胃液、肠液配方,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹法（Western blot）,分析了太平洋牡蛎肌肉过敏蛋白和非过敏蛋白在体外模拟胃液、肠液消化稳定性的差异.结果表明：在模拟胃液中,非过敏蛋白均能被胃蛋白酶快速降解,而主要过敏蛋白原肌球蛋白在60 min时仍未被完全分解;在模拟肠液中,肌浆蛋白不易被分解,肌原纤维蛋白和原肌球蛋白都能在一定程度上被胰蛋白酶分解.可见,太平洋牡蛎的主要过敏蛋白原肌球蛋白相对于非过敏蛋白具有一定的耐消化性.     

人工神经网络优化酶法制备马氏珠母贝 低聚肽的工艺研究

以马氏珠母贝全脏器为原料,采用胃蛋白酶、胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶模拟消化道酶解的方式制备低聚肽,先通过胃蛋白酶酶解获得初产物,在此基础上利用人工神经网络对胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶的双酶酶解过程进行模拟预测,对其酶解工艺进行优化.试验结果表明,通过人工神经网络预测获得小肠消化蛋白酶双酶酶解的优化工艺条件为:复合酶添加量4 500 U/g(m 胰蛋白酶∶m胰凝乳蛋自酶=6∶1)、料水比1∶2(W/V)、酶解时间3.5 h,在此条件下制备的低聚肽(200～2 000 u)得率达55％以上.通过优化的工艺条件制备的低聚肽可获得较高的得率,能够为马氏珠母贝全脏器低聚肽的开发利用奠定基础.     

章鱼内脏胰蛋白酶抑制剂的分离纯化与性质研究

通过热处理、硫酸铵盐析、膜超滤及SP-Sepharose离子交换层析,从章鱼内脏中纯化得到一种胰蛋白酶抑制剂（Octopus Trypsin Inhibitor,OTI）.Tricine-SDS-PAGE电泳结果显示,OTI的分子质量约为6500 u.性质分析结果表明：OTI在pH=1.0～11.0缓冲液中孵育30 min,抑制活性稳定;在100℃下加热1 h、2 h后仍分别具有90%和65%的抑制活性,具有良好的pH值稳定性和热稳定性;OTI能够显著抑制胰蛋白酶的活性,对胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶几乎无抑制活性;OTI能够有效抑制蓝圆鲹肌肉中肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶（MBSP）引起的肌球蛋白降解.     

鲤鱼胶原蛋白的过敏原性研究

以鲤鱼鱼皮为研究对象,通过碱溶、酸溶、NaCl盐析等方法从鱼皮中分离纯化得到了胶原蛋白.SDS-PAGE分析显示,鲤鱼胶原蛋白由分子质量约为120 ku和115 ku的2条α链（α1与α2）、分子质量约为250 ku的β链以及大分子质量的γ链组成.分析比较鲤鱼胶原蛋白与鲢鱼小清蛋白的基本性质,结果显示：2种蛋白质的pH值稳定性相似;胶原蛋白的热稳定性不如小清蛋白,但比小清蛋白更耐胃蛋白酶消化;在高温高压处理下,胶原蛋白明显降解,小清蛋白则出现了降解与聚合2种情况.应用8份鱼类过敏患者血清的酶联免疫吸附测定实验结果显示,小清蛋白对6份血清有特异性IgE反应,胶原蛋白对3份血清有特异性IgE反应.Dot-blot实验结果显示,胶原蛋白与鱼类过敏患者血清出现了特异性的杂交显色斑点.与小清蛋白相似,鲤鱼胶原蛋白具有特异的IgE结合活性,提示其是一种潜在的过敏原.     

大豆分离蛋白对幼建鲤肝胰脏发育及消化道蛋白酶活力的影响

研究了大豆分离蛋白（SPI）对10～35g幼建鲤Cyprinus carpio Var．Jian肝胰脏发育及消化道蛋白酶活力的影响。结果表明：饲料中用SPI替代鱼粉蛋白水平对幼建鲤肝胰指数、肝胰脏中的胰蛋白酶、凝乳蛋白酶活力以及肠道中胰蛋白酶、凝乳蛋白酶活力影响极显著（P＜0．01）或显著（P＜0．05）,随着SPI替代鱼粉蛋白比例的增加,蛋白酶活力均极显著下降（P＜0．01）,肝胰指数显著升高（P＜0．05）。用SPI替代鱼粉蛋白后,可引起幼建鲤消化能力下降,肝胰脏和肠道等消化器官的发育受阻,胰蛋白酶和凝乳蛋白酶的活力降低,饲料利用率下降;SPI中胰蛋白酶抑制因子是引起上述症状的重要因素之一。     

鲤鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的初步研究

利用凝胶层析法从鲤鱼(Cyprinus carpio)卵中分离纯化得到一种丝氨酸蛋白酶抑制剂。选择胰蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、凝血酶及其特异底物,建立比色法检测,对初步分离的丝氨酸蛋白酶抑制剂活性进行了分析。结果表明,丝氨酸蛋白酶抑制除对胰凝乳蛋白酶无抑制作用外,对其他的蛋白酶均有抑制效果;当温度超过70℃时,丝氨酸蛋白酶抑制剂失活,但在pH 2~11均保持活性,具有较强的酸碱稳定性。     

鲤鱼肌肉中胶原蛋白酶的分离纯化与性质分析

利用明胶酶谱法,在鲤鱼肌肉中检测到了一种具有分解胶原蛋白能力的丝氨酸蛋白酶.通过硫酸铵盐析、DEAE-Sephacel和Phenyl-Sepharose等一系列柱层析法,纯化得到了分子质量为70 ku,能够降解胶原蛋白的丝氨酸蛋白酶（Collagenolytic Serine Proteinase,CSP）.性质分析表明,CSP在弱碱性条件下显示活性,最适温度为30℃;丝氨酸蛋白酶抑制剂特异抑制CSP的活性.CSP能有效地分解鲤鱼肌肉中的I型胶原蛋白,提示其可能在鱼体死后肌肉胶原蛋白降解中发挥着重要的作用.     

抗除草剂转基因稻米蛋白的消化稳定性和热稳定性分析

为抗除草剂转基因水稻食用安全性评价中的致敏性评估提供参考,对抗除草剂转基因稻米蛋白的消化稳定性和热稳定性进行分析。体外模拟胃肠液消化和热加工处理抗除草剂转基因水稻Bar68-1稻米蛋白、非转基因亲本对照D68稻米蛋白、阴性对照酪蛋白、阳性对照大豆胰蛋白酶抑制剂和牛血清蛋白,通过SDS-PAGE凝胶电泳观察它们在各时间点的降解情况。研究结果显示:消化稳定性试验中,转基因稻米蛋白和非转基因稻米蛋白在2~30 min内全部消化,可判断它们在模拟胃、肠液中可消化;热稳定性试验中,转基因稻米蛋白和非转基因稻米蛋白一样,在一定温度下(60、75、90、100℃)加热一定时间(15、30、60、120 min)后仍具有较好的热稳定性。结果表明,转基因抗除草剂水稻Bar68-1具有较好的热稳定性,在模拟胃液和模拟肠液中均可消化,不具备过敏原抗消化性的特征。     

抑制剂和激活剂对梨星毛虫中肠蛋白酶活性的影响

旨在研究不同抑制剂和激活剂对梨星毛虫Illiberis pruni中肠蛋白酶活性的影响。利用生化技术分别测定梨星毛虫幼虫不同龄期的4种中肠蛋白酶（总蛋白酶、强碱性胰蛋白酶、弱碱性胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶）活性,进而在最适龄期（4龄幼虫）测定蛋白酶激活剂（EDTA,MgCl₂,EGTA,CaCl₂）和抑制剂（PMSF,TPCK,STI,TLCK,IAA,DTT）对梨星毛虫中肠蛋白酶活性的影响。结果表明：梨星毛虫幼虫中肠总蛋白酶、强碱性胰蛋白酶、弱碱性胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶均在4龄具有最高酶活性。所有试剂均对总蛋白酶有激活作用;5 mmol/L CaCl₂对强碱性胰蛋白酶抑制作用最高;对弱碱性胰蛋白酶有抑制作用的仅有5 mmol/L DTT;对胰凝乳蛋白酶抑制效果最佳的为10 mmol/L EGTA。所筛选的对梨星毛虫主要中肠蛋白酶具有抑制作用的抑制剂,对以昆虫中肠蛋白酶为靶标的绿色害虫防控技术的开发具有参考价值。     

利福昔明在人工胃/肠液和大鼠肠道菌群及组织样品中的稳定性初步分析

为初步分析利福昔明(Rifaximin)在人工胃/肠液和肠道菌群及动物组织样品中的稳定性,将利福昔明分别与空白人工胃液(pH=1.3,不含酶)、空白人工肠液(pH=6.8,不含酶)、人工胃液(pH=1.3,含胃蛋白酶)、人工肠液(pH=6.8,含胰蛋白酶)、SD大鼠(雄性)肠道菌群及不同组织样品的匀浆液等共孵育不同时间后,采用高效液相色谱法(HPLC)检测剩余利福昔明百分比的变化。结果表明:1)在空白人工胃液中,随孵育时间的增加,剩余利福昔明百分比虽有下降,但仍在90%以上;在人工胃液中孵育6 h,其剩余百分比为84.03%;而在空白人工肠液和人工肠液中孵育6 h后,其剩余百分比则分别降至81.14%和78.12%。2)利福昔明在SD大鼠肠道菌群中孵育12 h后,虽发生部分降解,但剩余百分比仍在90%以上,总体呈稳定的趋势。3)利福昔明在空白SD大鼠的胃、肝、小肠和大肠及内容物的匀浆液中分别孵育6 h后,其剩余百分比分别为92.09%、75.95%、78.24%和83.90%。综上,利福昔明在酸性条件下较稳定,而在碱性条件下,胰蛋白酶、胃蛋白酶和肠壁、肝脏代谢酶等对其稳定性的影响亦较为有限。本研究将为兽用利福昔明口服制剂的开发提供数据支持。     

草鱼模拟肠液的开发及其在仿生消化仪上的应用

[目的]研制草鱼模拟肠液配方。[方法]根据草鱼成鱼的肠道淀粉酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶活性,pH以及钠离子环境,研制了一套草鱼成鱼的模拟肠液配方,并研究其在仿生消化仪上的应用。[结果]利用配制的草鱼模拟肠液进行体外仿生消化试验,发现饲料中干物质和粗蛋白的消化率与真实值的绝对差值均在10%左右,达到仿生消化的目的与要求。此外,经过仿生消化,外源植酸酶能够显著提高干物质消化率、粗蛋白消化率和代谢能值,促进植酸磷的释放。[结论]该研究结果可为草鱼的体外模拟消化提供更可靠的试验数据,并为水产其他动物模拟肠液的开发提供参考。     

除虫脲在人工胃/肠液和肠道菌群及生物样品中的稳定性研究

为了考察除虫脲(DFB)在人工胃/肠液和肠道菌群及生物样品中的稳定性,为合理开发DFB口服制剂提供试验依据。采用高效液相色谱法(HPLC),分别将DFB与空白人工胃液(pH为1.3,不含酶)、空白人工肠液(pH为6.8,不含酶)、人工胃液(pH为1.3,含胃蛋白酶)、人工肠液(pH为6.8,含胰蛋白酶)、SD大鼠(雄性)肠道菌群或生物样品分别共孵育不同时间后,检测DFB的含量变化。结果表明,DFB在空白人工胃液和人工胃液中孵育0～2 h剩余百分比基本没有发生变化,之后随着时间的增加,剩余百分比略有下降,但剩余百分比都在90%以上,总体呈现稳定趋势。在空白人工肠液中孵育,剩余百分比随着时间增加显著下降,孵育6 h后剩余百分比为82.97%;在人工肠液中孵育6 h, DFB的剩余百分比为77.41%。DFB在SD大鼠肠道菌群中孵育12 h发生部分降解,但DFB的剩余百分比在90%以上,总体呈稳定趋势。DFB在肝、胃、大肠等生物样品中孵育6 h后,DFB的剩余百分比均在90%以上;而在小肠生物样品中孵育6 h后DFB的剩余百分比为84.06%。     

模拟胃液对Pena 1及其抗原表位免疫原性的影响

【目的】Pen a 1是虾中的主要过敏原,已知其5个抗原表位在过敏反应中起着决定性的作用。用全蛋白抗体和表位特异性抗体,检测Pen a 1经体外模拟胃液（simulated gastric fluid,SGF）消化后其抗原表位免疫原性的变化情况,为研究人体消化对Pen a 1的影响机理及脱敏食品的制备提供理论依据。【方法】以刀额新对虾(metapenaeus ensis）为原材料,提取纯化虾过敏原Pen a 1,采用Fmoc化学法合成Pen a 1抗原表位的5个多肽片段(No.1-No.5),分别与载体蛋白KLH和牛血清蛋白BSA偶联制备人工免疫原和包被原。用Pen a 1和制备的多肽免疫原免疫新西兰纯种白兔获得全白蛋抗体和特异性表位抗体。参照美国药典模拟人体胃液的条件消化处理Pen a 1,利用SDS-PAGE和Tricine-SDS-PAGE观察消化后Pen a 1分子量变化;通过免疫印迹(Western-blot)定性观察Pen a 1消化后生成的新蛋白片段与各抗体的结合情况;再经竞争抑制酶联免疫吸附试验（ci-ELISA）定量检测消化后的Pen a 1和表位多肽与各抗体结合能力,从而得出Pen a 1经SGF消化后各抗原表位免疫原性的变化程度。【结果】SDS-PAGE结果显示Pen a 1随SGF消化时间的延长逐渐被降解,在22 kD处生成一些较稳定的新蛋白片段,Tricine-SDS-PAGE结果表明在1.7-18 kD之间无新蛋白片段生成。Western-blot表明消化后分解生成的小分子蛋白与六种抗体发生不同程度结合,其中全蛋白抗体和No.4抗体几乎与生成的所有小分子蛋白结合,在22 kD左右处生成的稳定新蛋白片段均与No.3、4、5抗体有较强的结合,而与No.1、2抗体结合较弱甚至无结合,表明该蛋白携带No.3、4、5表位,而基本无No.1、2表位。ci-ELISA结果显示,Pen a 1经SGF消化后对全蛋白抗体和5个表位抗体的抑制率均显著下降,说明经过消化后Pena1及其抗原表位的免疫原性均明显降低,各抗原表位消化稳定性排序为No.4＞No.2>No.1>No.3＞No.5,其中No. 2、1、3之间无显著性差异;ci-ELISA检测表位多肽经消化后其免疫原性也显著下降,消化稳定性排序为No.1> No.2 >No.3＞No.4＞No.5,其中No.2、3、4之间无显著性差异。结合免疫印迹结果可知No.4抗原表位消化稳定性最高,但其表位多肽消化稳定性没有显著高于其它所有表位多肽,说明在消化过程中Pen a 1结构对该表位起到一定的保护作用,使其保持较高的消化稳定性;No.1、2、3次之,3个表位间无显著性差异;No.5消化稳定性最差,表明Pen a 1空间结构对其无明显保护作用。【结论】建立了一种用表位抗体检测过敏原经模拟消化后抗原表位消化稳定性的方法。Pen a 1经SGF消化后,免疫原性降低,分解生成部分较稳定的蛋白片段,但仍具有致敏性;5个抗原表位中No.4消化稳定最高,No.5最差。     

海藻酸钙微胶囊包埋IgY及其释放特性研究

卵黄免疫球蛋白(IgY)是一种高活性的口服抗体,与人体健康密切相关。为最大限度保留IgY的生物活性,提高其稳定性,以海藻酸钠为主要壁材,使用锐孔-凝固浴法包埋IgY制备凝胶珠。以包埋率和载药量为主要指标,利用响应面法探究IgY-海藻酸钙凝胶珠的最佳制备工艺,并利用体外胃肠道消化模型评估凝胶珠释放效果。结果显示:当海藻酸钠为28.30 g·L^-1,氯化钙为10.80 g·L^-1,芯壁比(质量比)为0.46∶1时,新鲜制备得到的IgY-海藻酸钙凝胶珠成型效果较好,包埋率为(53.30±1.55)%,载药量为(10.90±0.26)%。通过宏观形态观察,凝胶珠颗粒具有较好的圆整性和均一性,粒径约为(2.10±0.05) mm,硬度为(4 396.87±331.62) g。干燥后的凝胶珠在模拟胃液中2 h后溶胀度为0.94±0.39,IgY累积释放率约在(11.10±3.20)%,在模拟肠液中2 h后,溶胀度持续增加至4.81±0.32,IgY累积释放率达(97.10±2.40)%以上。因此,IgY-海藻酸钙凝胶珠在胃液中具有缓慢释放芯材的作用,IgY在肠液中能基本全部释放。     

转植酸酶基因玉米中植酸酶蛋白在模拟消化液中的稳定性研究

植酸酶作为应用最为广泛的重要饲料酶制剂之一,明确其在动物消化道环境中的稳定性对于其应用及作用方式的研究具有重要意义。本研究在体外建立了胃、肠两种模拟消化体系,取不同消化时间的样品进行Western杂交,结果显示在模拟胃液中植酸酶蛋白经60 min处理未被消化,而在模拟肠液中处理15 min内被全部消化,表明转植酸酶玉米种子中的植酸酶蛋白在模拟胃液中极难被消化,可稳定存在,在模拟肠液中可被消化。     

A Study on Heat Resistance and Initial Characterization of Protease Inhibitors in Porcine Colostrum

Porcine colostrum was separated into the acid-soluble fraction (SF) and casein fraction (CF) by acidifying followed by centrifuge. SF was further separated by liquid chromatography and anisotropic membrane filtration. Capacities of the SF or CF of porcine colostrum, to inhibit trypsin and chymotrypsin activity and to inhibit the epidermal growth factor (EGF) degradation in pig small intestinal contents, were determined under different heat treatments. The study showed that trypsin inhibitors in porcine colostrum survived heat treatments of 100℃ water bath for up to 10 min, but exposure to boiling water bath for 30 min significantly decreased the inhibitory activity. Compared with the trypsin inhibitors, the chymotrypsin inhibitors were more heat-sensitive. SF was more heat-sensitive than CF. Separation of the SF of porcine colostrum by liquid chromatography and anisotropic membrane filtration revealed that the porcine colostrum protease inhibitors, those had the capacity to inhibit the trypsin-chymotrypsin activity and enhanced the stability of EGF in the gastrointestinal(GI) lumen of weaned pigs, existed mainly in SF, milk-derived, were a group of heat-labile small proteins with molecular weight of 10 000-50 000.