茶多酚钝化大豆胰蛋白酶抑制因子（STI）的研究

探索钝化豆类中胰蛋白酶抑制因子(STI)的生物抑制方法.通过测定胰蛋白酶活性来间接反映大豆STI的活性.在探明STI对胰蛋白酶抑制效果的基础上,进行了茶多酚(TP)在不同浓度、pH值、温度和时间条件下对鲜豆奶中的STI及STI标准品(KSTI及BBI)的钝化效果.结果表明:鲜豆奶中的STI和STI标准品均对胰蛋白酶活性具有很强的抑制作用;当鲜豆奶试液、KSTI及BBI的添加浓度分别为0.5 mg/ml、28.0 μg/ml和21.0 μg/ml时,对胰蛋白酶活性的抑制程度最大,抑制率分别为86.67%、100.00%和97.94%;当TP试液与鲜豆奶试液的比例为1:2(体积比)时,TP对STI的钝化效果最好,抑制率为52.30%;当TP:KSTI为25:1(质量比)、作用温度45 ℃、pH4.5、作用时间90 min时,TP对KSTI的抑制率达83.15%;当TP :BBI为20:1(质量比)、作用温度40 ℃、pH4.5、作用时间60 min,TP对BBI的抑制率达76.58%.     

黑眶蟾蜍皮肤白蛋白的纯化及胰蛋白酶抑制活性

[目的]探讨黑眶蟾蜍皮肤白蛋白的纯化及胰蛋白酶抑制活性。[方法]通过离子交换层析和凝胶过滤层析,从黑眶蟾蜍皮肤中得到其白蛋白,命名为BufomA-skin。65nmol／L的BufomA-skin分别与30nmol／Ltrypsin在25℃不同保温时间（0．25—24h）下测定胰蛋白酶抑制活性,计算剩余酶活力。[结果]BufomA-skin为单链蛋白,分子量约为66．7kDa。但在非还原状态下,50～66kDa条带呈弥散样。该蛋白有抑制胰蛋白酶水解小肽底物的活性,但对其他丝氨酸蛋白酶如凝血酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶无抑制。BufomA-skin与胰蛋白酶保温24h后,胰蛋白酶活性无恢复。[结论]黑眶蟾蜍皮肤白蛋白具有稳定的胰蛋白酶抑制活性,在黑眶蟾蜍防御天敌捕食的过程中发挥重要作用.     

红肉菠萝蜜种子胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及其特性

采用阴离子交换层析和凝胶过滤层析方法,从海南红肉菠萝蜜种子中分离纯化得到胰蛋白酶抑制剂,命名为AHTI.结果表明:该蛋白有抑制胰蛋白酶水解小肽底物的活性作用,由相对分子质量分别约为28.8 kD和16.4 kD的亚基组成的多聚体.AHTI具有稳定的胰蛋白酶抑制活性,对胰蛋白酶的抑制活性与其浓度成正比,AHTI对温度、pH的耐受性较强,2种因素对其胰蛋白酶抑制活性影响较小.     

重组猪α干扰素理化性状及其体外抗病毒活性研究

[目的]研究重组猪α干扰素（rPoIFN-α）半成品理化性状并对其体外抗病毒活性进行测试与鉴定。[方法]用HEp-2/VSV体系对3批rPoIFN-α蛋白进行抗病毒活性检测,以重组人IFN-α为参比品,测定干扰素效价;用0.25%胰蛋白酶HCl以及鼠抗猪α干扰素单克隆抗体作用已知效价的rPoIFN-α半成品,并检测各批次抗病毒活性,对rPoIFN-α理化性状进行评价;在猪肾细胞株（PK-15）上检测rPoIFN-α对猪细小病毒（PPV）和猪伪狂犬病毒（PRV）的致细胞病变抑制效应,观察rPoIFN-α的体外抗病毒活性。[结果]HEp-2/VSV体系滴定rPoIFN-α半成品效价可达1.5×105IU/ml,比活性达1.1×106IU/mg;rPoIFN-α经0.25%胰蛋白酶37℃作用1h,效价残留率低于1%,经HCl（pH=2.0）处理72h效价残留率高达95%以上,经56℃处理30min效价残留率高于47%,经鼠抗猪α干扰素单克隆抗体37℃作用1h后效价残留率约为1%;体外抗病毒试验表明,用50和500IU/mlrPoIFN-α可分别抑制PRV和PPV对PK-15细胞株致细胞病变效应。[结论]rPoIFN-α具有IFN-α的基本理化性状,其在体外可分别抑制PRV、PPV对PK-15细胞株致细胞病变效应,但剂量有差别。     

紫花芸豆胰蛋白酶抑制剂粗提条件优化及稳定性研究

为寻找新型的、高活性的胰蛋白酶抑制剂,将紫花芸豆磨碎乙醚脱脂后制成花豆粉,用pH4.0的稀酸溶液抽提,并在70 ℃对抽提液热变性15 min,然后进行40 %～70 %饱和度的硫酸铵分级沉淀.对花豆胰蛋白酶抑制剂的粗提条件进行了优化,并探索了不同温度处理对PVTI抑制活性的影响.结果表明:100 ℃处理60 min后,活性丧失约30 %,PVTI具有良好的热稳定性.     

抑制剂和激活剂对梨星毛虫中肠蛋白酶活性的影响

旨在研究不同抑制剂和激活剂对梨星毛虫Illiberis pruni中肠蛋白酶活性的影响。利用生化技术分别测定梨星毛虫幼虫不同龄期的4种中肠蛋白酶（总蛋白酶、强碱性胰蛋白酶、弱碱性胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶）活性,进而在最适龄期（4龄幼虫）测定蛋白酶激活剂（EDTA,MgCl₂,EGTA,CaCl₂）和抑制剂（PMSF,TPCK,STI,TLCK,IAA,DTT）对梨星毛虫中肠蛋白酶活性的影响。结果表明：梨星毛虫幼虫中肠总蛋白酶、强碱性胰蛋白酶、弱碱性胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶均在4龄具有最高酶活性。所有试剂均对总蛋白酶有激活作用;5 mmol/L CaCl₂对强碱性胰蛋白酶抑制作用最高;对弱碱性胰蛋白酶有抑制作用的仅有5 mmol/L DTT;对胰凝乳蛋白酶抑制效果最佳的为10 mmol/L EGTA。所筛选的对梨星毛虫主要中肠蛋白酶具有抑制作用的抑制剂,对以昆虫中肠蛋白酶为靶标的绿色害虫防控技术的开发具有参考价值。     

无种皮南瓜籽胰蛋白酶抑制剂的分离纯化与部分性质研究

采用分级盐析和Sephadex G-50的方法分离纯化无种皮南瓜籽胰蛋白酶抑制剂,用BAPNA法进行抑制活性的测定,用SDS-PAGE法测定蛋白质的分子量,用不同的温度处理方法对它的热稳定性进行研究,并对抑制剂的Lys和Cys进行了化学修饰。结果表明在饱和度为60%的硫酸铵作用下,能够沉淀出活性较强的胰蛋白酶抑制剂,其分子量为29 512 Da,并且具有一定热稳定性,在80℃恒温处理1 h仍保持一定的抑制活性。证明了无种皮南瓜籽胰蛋白酶抑制剂是一种分子量较小的,以Lys为活性中心的具有一定热稳定性的蛋白质。     

黑眶蟾蜍血清白蛋白的纯化及胰蛋白酶抑制活性

通过离子交换层析和凝胶过滤层析,从黑眶蟾蜍(Bufo melanostictus)血清中得到其白蛋白,命名为Bu-fom-SA。该蛋白有抑制胰蛋白酶水解小肽底物活性的作用,但对其他丝氨酸蛋白酶如凝血酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶无抑制。Bufom-SA对温度、pH及还原剂二硫苏糖醇的耐受性较强,3种因素对其胰蛋白酶抑制活性影响不大。黑眶蟾蜍血清白蛋白具有稳定的胰蛋白酶抑制活性,可能在黑眶蟾蜍防御天敌捕食的过程中发挥重要作用。     

重组酵母E22植酸酶的分离纯化及酶学性质研究

对用黑曲霉植酸酶基因构建的一株重组酵母E22所产植酸酶进行分离纯化并研究各种酶学性质,表明E22植酸酶分别在pH2.5～3.0和pH5.5左右具有2个最适pH峰,有活性pH范围为pH2.0～7.5,pH2.5时的最适温度为45℃左右、对植酸钠的Km值为0.000 2 mol/L、比活为493 328.7 u/mg、受Fe2+抑制,pH5.5时的最适温度为55℃.对植酸钠的Km值为0.000 1 mol/L、比活为624 376.2 u/mg、受Ca2+和Zn2+抑制,85℃热处理10 min酶活性保留70%,pH2.5下用胃蛋白酶、pH5.5下用胰蛋白酶处理6 h后酶活均保留90%左右,分子量为61.7KD,等电点在4.5到5.0之间.     

胃-胰蛋白酶水解蜂王浆主蛋白制备血管紧张素转化酶抑制肽工艺的优化

采用胃-胰蛋白酶水解蜂王浆主蛋白(MRJPs),对底物浓度、pH值、酶作用时间和蛋白酶浓度对水解效果的影响进行单因素分析,然后通过正交试验对胃-胰蛋白酶共同作用的酶解工艺进行优化;最后采用超滤分离技术对王浆主蛋白水解产物(H-MRJPs)进行分离,以制备血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽。结果表明:优化的酶解工艺为37℃恒温、质量比为1%的胃蛋白酶(pH=2.0)和胰蛋白酶(pH=7.5)各水解2h;在最佳工艺条件下,MRJPs水解度为28.7%,总氮回收率为35.5%;通过SDS-PAGE电泳未检测到MRJPs水解产物(H-MRJPs)含有明显的蛋白条带;采用超滤法对H-MRJPs分离得到分子质量范围为<1、1～5和>5ku的3类血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽,其ACE半抑制质量浓度(IC50)分别为0.33、0.61和1.09mg.mL-1,即以分子质量<1ku的产物活性最强。该结果为利用王浆主蛋白开发降压功能食品提供了科学依据。     

外源水杨酸对棉花相关抗虫酶活性诱导的时间和浓度效应

采用喷雾方法,初步探讨外源水杨酸对棉叶总酚和抗虫酶活性的诱导作用,结果表明,在适度浓度和时间范围内,水杨酸（SA）能明显诱导棉叶中总酚含量、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）活性和胰蛋白酶抑制力（TI）活性的增加;5 mmol／L 水杨酸处理后4 d对棉叶总酚含量、PAL活性和胰蛋白酶抑制力的诱导作用最为显著,水杨酸5 mmol／L处理后2 d和0．5 mmol／L 处理后4 d对棉叶PPO活性的诱导效果最优;随着水杨酸处理时间的延长,水杨酸诱导棉叶总酚含量和抗虫酶（PAL、PPO、TI）活性具有先升高后降低随后又升高的特点。这说明外源水杨酸能在一定程度上提高棉花抗虫相关的物质和酶活性以达到抗虫目的。     

格氏乳球菌素LG34生物稳定性的研究

从发酵酸黄瓜中筛选到一株产新型广谱细菌素的格氏乳球菌LG34,对其产生的格氏乳球菌素LG34的生物稳定性进行了研究。结果表明:格氏乳球菌素LG34既能抑制革兰氏阳性菌,也能抑制革兰氏阴性菌;格氏乳球菌素LG34具有较强的热稳定性;对胃蛋白酶和胰蛋白酶具有较强敏感性;在pH 2.0~8.0抑菌活性很稳定,抑菌活性损失小于20%;当无机盐浓度低时,抑菌活性损失较小,而当无机盐浓度较高时,抑菌活性损失较大,最大可达47.6%。有机溶剂、表面活性剂对格氏乳球菌素LG34的抑菌活性影响不显著。     

拮抗菌B-001抗菌蛋白产生的最佳发酵条件和特性及其室内防效

分离得到1株抑制烟草青枯病菌的内生拮抗菌B-001菌株.为确定其抗菌蛋白产生的最佳培养基和培养条件,用硫酸铵沉淀法从发酵液中提取抗菌蛋白质,测定其对烟草青枯病菌抗菌活性,确定产生抗菌蛋白的最佳培养基为BPY液体培养基,最佳发酵条件为pH7.0,30℃,装液量100 mL,200 r/min振荡培养96 h;抗菌蛋白在pH5.0,pH8.0时抑菌活性仍分别保持90%,96%;pH6.0,pH7.0时抑菌活性仍保持不变;对酸、碱稳定;经40～100℃处理20 min后抑菌活性保持不变,具有良好的热稳定性;对蛋白酶有一定的耐受性.在温室内,抗菌蛋白粗提液对烟草青枯病可取得83.8%的防效.     

枯草芽孢杆菌B25抗菌物质初步研究

枯草芽孢杆菌B25能够产生抗菌活性物质,对香蕉枯萎病具较好的抑菌效果.研究了抗菌活性物质产生的时间,以及对温度、pH值和蛋白酶(胰蛋白酶、蛋白酶K)的敏感性;并用10、30、50 ku的超滤管超滤.研究结果表明:抗菌物质是从对数期后期就开始产生的,稳定期活性上升到最大值并一直保持在这个水平;该活性物质对热稳定,可于100℃煮沸1h而不失活;在酸性、中性及微碱性条件下相对稳定,在强碱性条件下不稳定;对蛋白酶K和胰蛋白酶敏感,10、30 ku的超滤管时超滤膜下面的滤过液无活性,50 ku超滤管时超滤膜下面的滤过液才有活性.     

Lactobacillus casei AST18抗真菌特性及其在酸奶保鲜中的应用

 【目的】考察来源于中国传统发酵制品中乳酸菌的抑真菌特性,研究其在酸奶贮藏中的抑制霉菌效果。【方法】高效液相色谱法（HPLC）检测7株具有抗真菌效果的乳杆菌发酵液中苯乳酸（PLA）含量,研究PLA与乳杆菌发酵液抗真菌活性的相关性。选取抑菌活性最强的菌株Lactobacillus casei AST18进行抑菌特性研究。Lactobacillus casei AST18分别以2%、4%、6%、8%接种量作为辅助发酵剂添加至酸奶发酵工艺中,成品酸奶贮藏期间,监测酸奶中霉菌生长状况,检测酸奶理化指标并进行感官评定。【结果】乳杆菌发酵液中苯乳酸含量与其抑真菌直径间相关关系不显著。Lactobacillus casei AST18发酵上清液经胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后不影响其抑菌活性,而环境pH对其抑菌活性的影响显著,热处理可使其丧失抑菌活性。Lactobacillus casei AST18以 2%添加量作为辅助发酵剂应用在酸奶中可抑制霉菌菌丝生长和孢子生成,且对酸奶产品风味、感官品质无显著影响。【结论】Lactobacillus casei AST18具有较好的抑制霉菌生长能力,应用在酸奶中具有显著的防霉保鲜效果。     

模拟酸雨对喜旱莲子草与莲子草生长及生理特性的影响

为了探究外来入侵植物对酸雨环境的响应，以入侵植物喜旱莲子草（Alternanthera philoxeroides (Mart. )Griseb）和土著植物莲子草（A. sessilis (L.) DC）为研究对象，于室内开展盆栽控制试验，探究不同pH值（pH 2.5、pH 3.5、pH 4.5、pH 5.6和pH7.0）条件对植物形态指标、叶绿素含量、MDA含量及抗氧化酶活性等的影响。结果表明：（1）与对照（pH 7.0）相比，喜旱莲子草的地上生物量、叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量在模拟酸雨（pH≤3.5）处理下受到显著抑制，最大降幅分别达25.4%、14.0%、7.8%和11.8%；莲子草的株高、地上生物量、叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量在模拟酸雨（pH≤5.6）处理下受到显著抑制，最大降幅分别达25.2%、33.2%、40.5%、31.3%和39.1%。喜旱莲子草分枝数在模拟酸雨（pH 4.5、pH 5.6）处理下显著高于对照，莲子草的分枝数未受模拟酸雨处理（pH≤5.6）的显著影响。（2）在模拟酸雨（pH 2.5）处理下，喜旱莲子草的MDA含量显著增加28.4%，SOD、POD和CAT活性显著下降16.5%～23.5%；莲子草的MDA含量在模拟酸雨（pH≤4.5）处理下显著增加20.4%～29.8%，SOD活性在模拟酸雨（pH≤3.5）处理下显著降低15.9%～19.0%，POD活性在模拟酸雨（pH≤5.6）处理下显著降低15.3%～28.4%，CAT活性在模拟酸雨（pH≤4.5）处理下显著降低16.1%～20.4%。由此推断酸雨对喜旱莲子草的伤害阈值在pH 2.5～3.5之间，酸雨对莲子草的伤害阈值在pH 4.5～5.6，入侵植物喜旱莲子草对酸雨表现出更强的抗性。研究结果可以为研究酸雨条件下外来植物入侵机制提供理论基础。     

鲜切马铃薯多酚氧化酶酶学特性及褐变抑制剂的研究

［目的］研究常用防腐、防褐抑制剂对切分马铃薯多酚氧化酶（PPO）的抑制效果及贮运品质的影响。［方法］以无公害马铃薯为试材,以邻苯二酚为底物,采用分光光度法和正交试验法,测定马铃薯中PPO的酶学特性及不同试剂作用下PPO的活性。［结果］马铃薯PPO的最适pH值为7.6,最适温度为32℃,短时高温处理能显著抑制PPO活性;PPO催化酶促褐变反应符合米氏方程,酶促反应的最大速率（Vmax）为0.2866U/（gFW·min）,米氏常数（Km）为0.032mol/L;NaHSO3、抗坏血酸能较好地抑制PPO活性,且随着浓度的升高,抑制效果增强;0.1%抗坏血酸、0.06%或0.10%CaCl2、0.08%苯甲酸钠、1.0%壳聚糖保鲜切分马铃薯丝在4℃下贮藏96h后褐变度仅为6.14%。［结论］马铃薯PPO活性受诸多因素影响,尤以pH值和温度影响最为显著;试验采用抗坏血酸等复合保鲜剂对切分马铃薯丝的褐变抑制进行了系统研究,关于不同试剂间多因素协同作用机理和抑制效应尚需做进一步研究。     

单-双酶法制备苏麻饼粕多肽工艺的优化

为脱脂苏麻饼粕的开发利用提供参考，以可溶性氮含量及多肽提取指数为指标，考察原料处理方式、酶种类、酶底比、酶解方法等因素对苏麻多肽提取的影响；并优化单-双酶法直接酶解苏麻饼粕制备苏麻多肽工艺。结果表明：碱性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶单独酶解的最佳工艺是酶底比分别为5%、7%和5%，料液比均为3%，50℃酶解6 h，该条件下，碱性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶单独酶解的多肽提取指数分别为（49.05±0.91）%、（47.98±0.36）%和（44.22±0.87）%。双酶法酶解的最佳工艺为料液比5%，55℃条件下，先加3.5%的胰蛋白酶在pH8.0条件下酶解3 h，调节pH为9.5后再利用3.5%的碱性蛋白酶酶解3 h，该条件下，酶解液中可溶性氮含量较单酶酶解显著提高，苏麻多肽提取指数达（52.88±0.39）%。     

双醛氧化纤维素固定胰蛋白酶性质研究

研究固定化酶载体-氧化型纤维素条件优化,并用此载体固定胰蛋白酶。结果表明,当氧化剂高碘酸钠浓度为0.5 mol.L-1,氧化环境pH 2,氧化时间为3.5 h,反应温度为35℃时,氧化纤维素醛基质量分数可到达74.06%。以此为载体固定胰蛋白酶,可得到固定化胰蛋白酶最适温度为60℃,最适pH 9.0,固定化酶比自由酶热稳定性提高。在最适条件下,固定酶可重复使用5次以上,之后活性才有所下降,将固定化酶置于4℃冷藏保存,5 d后活性保持在90%,固定化酶表现出较高使用和贮藏稳定性,为胰蛋白酶广泛应用奠定基础。     

青鱼胰蛋白酶的分离纯化及部分性质研究

[目的]为青鱼的养殖和综合利用提供试验依据。[方法]对青鱼胰蛋白酶进行分离纯化,测定青鱼胰蛋白酶的分子量、热稳定性和酸碱稳定性,探讨pH值、温度、金属离子和EDTA对青鱼胰蛋白酶活力的影响。[结果]经SDS-PAGE和凝胶过滤,测得青鱼胰蛋白酶的分子量分别为44和43.5 kD。青鱼胰蛋白酶具有一定碱性耐受性,在pH值为8～10时活性较高,其最适pH值约为9,最适反应温度为50℃。以酪蛋白为底物,在pH值8.5、37℃时测得该酶Km值为4.6×103 mg/L。Mg2+对该酶有明显促进作用,而Cu2+、Mn2+、Pb2+和EDTA对青鱼胰蛋白酶的抑制作用很大。[结论]EDTA能抑制青鱼胰蛋白酶的作用,说明该酶可能为金属蛋白酶。