黑眶蟾蜍血清白蛋白的纯化及胰蛋白酶抑制活性

通过离子交换层析和凝胶过滤层析,从黑眶蟾蜍(Bufo melanostictus)血清中得到其白蛋白,命名为Bu-fom-SA。该蛋白有抑制胰蛋白酶水解小肽底物活性的作用,但对其他丝氨酸蛋白酶如凝血酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶无抑制。Bufom-SA对温度、pH及还原剂二硫苏糖醇的耐受性较强,3种因素对其胰蛋白酶抑制活性影响不大。黑眶蟾蜍血清白蛋白具有稳定的胰蛋白酶抑制活性,可能在黑眶蟾蜍防御天敌捕食的过程中发挥重要作用。     

黑眶蟾蜍皮肤丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆与序列分析

[目的]克隆黑眶蟾蜍皮肤丝氨酸蛋白酶抑制剂基因。[方法]从海南海口产黑眶蟾蜍皮肤中抽提总RNA,经mRNA纯化后构建黑眶蟾蜍皮肤cDNA文库。根据已报道的丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)序列,设计寡核苷酸引物用于筛选、克隆、测序。[结果]从所构建的cDNA文库中得到1个Serpin基因,命名为BmSP。对cDNA序列推导出的氨基酸序列分析表明,该BmSP蛋白属于Serpin家族中SERPIN B亚家族,与鼠鳞状细胞癌抗原2(SCCA2)同源。该蛋白C末端含有一个RCL环(Reactive center loop regions)和一段高度保守的五肽。[结论]与SERPIN B亚家族中其他类型蛋白氨基酸序列比较结果表明,黑眶蟾蜍BmSP与SERPIN B亚家族中其他类型成员氨基酸序列相似度较高,具有高度的保守性,可能在其防御天敌捕食的过程中发挥重要作用。     

酸性水与碱性水中Mg2+浓度对黑眶蟾蜍蝌蚪存活率的影响

[目的]研究野外黑眶蟾蜍(Bufo melanostictus)蝌蚪的生存状况。[方法]研究分别在碱性水(p H 7.5~8.0)以及酸性水(p H 5.5~6.0)2种模拟环境条件下,通过急性毒性试验方法以不同的浓度梯度Mg~(2+)对黑眶蟾蜍蝌蚪进行24和48 h的胁迫试验。[结果]在相同浓度梯度和相同观察时间下,黑眶蟾蜍蝌蚪在碱性水中的存活率低于酸性水;不同p H的水环境与Mg~(2+)的协同作用显著影响黑眶蟾蜍蝌蚪的48 h存活率(F7,32=3.373,P0.05);黑眶蟾蜍蝌蚪在酸性水环境下适宜生存的Mg~(2+)浓度范围为1 418.41~1 590.54 mg/L,半致死浓度(LC_(50))为2 357.32 mg/L,安全浓度为521.51 mg/L;在碱性水环境下适宜生存的Mg~(2+)浓度范围为1 264.91~1 418.41 mg/L,LC_(50)为1 879.81 mg/L,安全浓度为533.99 mg/L。[结论]该研究可为今后黑眶蟾蜍的保护提供理论依据。     

3种复合酶法从肠渣中提取肝素钠的对比研究

[目的]为肝素钠的大规模生产提供依据。[方法]利用3种复合酶从肠渣中提取肝素钠,通过测定提取肝素钠的质量、蛋白含量以及效价对3种复合酶法进行评价。[结果]由木瓜蛋白酶和链蛋白酶复合酶提取的肝素钠中蛋白含量最高（47％）,效价为15USPU／mg;由胰蛋白酶和链蛋白酶复合酶提取的肝素钠中蛋白含量为29％,而其效价为34USPU／mg。由2709碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合酶提取的肝素钠中蛋白含量最少（24％）,效价最高（39USPU／mg）。[结论]2709碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合酶能有效提取肠渣中残留的肝素钠。     

碱性蛋白酶水解大豆多肽及抑制ACE效果的研究

[目的]为了进行碱性蛋白酶水解大豆多肽及抑制ACE效果的研究。[方法]利用胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和碱性蛋白酶分别水解大豆蛋白,制备具有ACE抑制活性的大豆多肽,通过正交优化试验确定碱性蛋白酶的最佳水解条件,考察底物浓度、反应时间、反应温度与大豆蛋白酶解多肽对ACE抑制活性的影响,并将超滤法和聚丙烯酰胺凝胺电泳技术相结合,考察大豆蛋白酶水解物的分子量分布。[结果]结果表明,碱性蛋白酶的最佳水解条件为底物浓度5%,加酶量4%,水解时间2h。[结论]该研究为更好地利用大豆蛋白展示了良好的应用前景。     

鱿鱼肝脏活性肽的制备及生物活性研究

[目的]为鱿鱼肝脏的高值化利用提供基础研究数据。[方法]以鱿鱼肝脏蛋白为原料,通过蛋白酶水解来制备生物活性肽,研究了多种蛋白酶水解鱿鱼肝脏制得水解液的抗凝血活性、抑制血管紧张素Ⅰ转换酶（ACE）活性及抗氧化活性。[结果]当鱿鱼肝脏水解液浓度为5 mg/ml时,中性蛋白酶的水解液对ACE抑制率为68.0%;APTT值为59.8 s,TT值为34.2 s,比空白对照组分别延长26.7和20.6 s,表明鱿鱼肝脏的中性蛋白酶水解液具有抗凝血活性。中性蛋白酶解液对Fe3＋的还原力为0.588,羟自由基清除能力为64.5%,说明鱿鱼肝脏中性蛋白酶水解液具有较好的抗氧化活性;而其余的木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶的鱿鱼肝脏水解液的抗凝血活性和ACE抑制活性均低于中性蛋白酶水解液的酶解液活性。[结论]鱿鱼肝脏蛋白质具有较好的综合利用价值。     

草鱼卵中蛋白酶抑制剂的初步分离及性质研究

[目的]草鱼卵匀浆液中纯化获得蛋白酶抑制剂。[方法]采用Sephadex凝胶层析技术和发色底物检测,经分离与纯化获得具有专一性抑制活性的蛋白酶抑制剂。在不同温度(30～100℃)和酸碱(pH 2～11)条件下研究该抑制剂稳定性。[结果]从草鱼卵中分离到表观分子量50 kD的蛋白酶抑制剂,其对胰蛋白酶的最低抑制浓度约为500μg/ml,抑制常数为14.6 nmol/L。该蛋白酶抑制剂还具有高度的热稳定和酸碱稳定性。[结论]该研究可为淡水鱼卵的高效利用提供理论依据。     

文蛤蛋白抗菌肽制备工艺优化与抗菌活性研究

[目的]为文蛤的深加工提供科学依据。[方法]以鲜活文蛤为供斌材料,采用胰蛋白酶水解文蛤肉,选取大肠杆菌作为供试菌检测酶解物的抗菌活性,并采用响应面回归分析法优化酶解工艺。[结果]胰蛋白酶酶解文蛤蛋白的最优条件为：酶用量0．5％,酶解时间8h,酶解温度40℃;酶解液经蛋白质层析系统层析分离得到7个洗脱峰;抗菌性检测结果显示第2个洗脱峰的抗菌性最强,其分子质量为1650u。[结论]胰蛋白酶水解文蛤肉的酶解产物具有明显的抗菌性。     

不同蛋白酶水解鹿鞭制备活性肽的比较研究

[目的]研究制备鹿鞭活性肽的最佳蛋白酶。[方法]选用碱性蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶和胰蛋白酶分别在最适条件下水解鹿鞭,以水解物鹿鞭活性肽的水解度(DH)及其对还原能力、抑制硫代巴比妥酸(TBARS)的作用和清除DPPH自由基作用的影响为指标,优选出最佳水解蛋白酶。[结果]碱性蛋白酶水解鹿鞭产物鹿鞭活性肽的水解度、还原能力、对卵磷脂脂质氧化的抑制作用和DPPH自由基的清除率都为最高。[结论]碱性蛋白酶水解鹿鞭产物鹿鞭活性肽具有很好的抗氧化性。     

山羊乳酪蛋白酶解工艺研究

【目的】确定山羊乳酪蛋白的酶解工艺,为制备山羊乳酪蛋白活性肽奠定基础。【方法】选用中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶,采用对比和正交试验方法,研究山羊乳酪蛋白单酶和复合酶的酶解工艺,测定山羊乳酪蛋白的总肽键物质的量,优选山羊乳酪蛋白的酶解工艺参数。【结果】山羊乳酪蛋白的总肽键物质的量为8.5379mmol/g。单酶中,胰蛋白酶和中性蛋白酶对山羊乳酪蛋白的水解度均较大,木瓜蛋白酶次之,碱性蛋白酶最小;胰蛋白酶对山羊乳酪蛋白的水解度最高,为14.67%,其适宜的酶解工艺为:加酶量2500U/g,pH7.5,50℃下酶解2h。复合蛋白酶中,中性蛋白酶和胰蛋白酶复合及中性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶3酶复合时的水解度均较大,2种复合酶的水解度、平均肽链长度和平均相对分子量分别为17.34%,21.16%;5.77,4.73和692,567。【结论】在最佳酶解工艺条件下,单酶中,胰蛋白酶和中性蛋白酶对山羊乳酪蛋白水解度均较大,复合酶中,中性蛋白酶、胰蛋白酶复合及中性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶3酶复合时的水解度均较大。     

温度和光照时间对中华大蟾蜍胚胎发育的影响

[目的]探索温度、光照时间对中华大蟾蜍受精卵孵化率和蝌蚪成活率的影响。[方法]采用单因子试验方法,研究在不同温度和不同光照时间下中华大蟾蜍受精卵的孵化时间、孵化率和蝌蚪成活率,探讨中华大蟾蜍受精卵孵化的最适温度和光照时间。[结果]不同温度下中华大蟾蜍受精卵的孵化率及蝌蚪成活率差异极显著(P0.01)。20℃是中华大蟾蜍受精卵的最适孵化温度,此时其孵化率和蝌蚪成活率均在90%以上,且孵化时间较快,随着温度升高孵化速度加快,但孵化率与蝌蚪成活率明显下降。25℃下不同光照时间对中华大蟾蜍蝌蚪孵化率的影响差异不显著(P0.05),但对中华大蟾蜍蝌蚪成活率有极显著的影响(P0.01),每天24 h光照是中华大蟾蜍受精卵的最适孵化光照时间。[结论]该研究可为促进中华大蟾蜍养殖业的发展提供科学依据。     

鲤鱼鱼鳞蛋白的酶解制备工艺及其抗氧化活性

[目的]确定鲤鱼鱼磷蛋白的酶解制备工艺,并分析所得的鱼磷抗氧化肽的抗氧化性能。[方法]以鲤鱼鱼鳞为原料,选用胰蛋白酶考察其加酶量、反应温度、酶解时间、pH、底物浓度等因素对鱼鳞蛋白水解程度的影响,用单因素及正交试验的方法优选出鱼鳞蛋白酶解的最佳条件并测定其抗氧化活性。[结果]试验得到鲤鱼鱼磷抗氧化肽酶法制备的最佳工艺条件为pH 8.4、酶解温度45℃、加酶量4000 U/g、酶解时间3 h、底物浓度15%,此条件下得到的鱼磷抗氧化肽水解度较佳(29.97%),抗氧化能力较好。[结论]胰蛋白酶有溶解鲤鱼鱼鳞蛋白的能力,并且酶解产物的抗氧化活性与水解度有关。     

一株产壳聚糖酶菌株的培养条件优化

[目的]优化产壳聚糖酶菌株的培养条件。[方法]对一株从海洋中筛选的假单胞菌XK-3菌株产壳聚糖酶条件进行优化。[结果]培养基最佳组成:葡萄糖30.0 g/L,牛肉膏为15.0 g/L,(NH_4)_2SO_415.0 g/L,K_2HPO_42.0 g/L,KH_2PO_42.0 g/L,NaCl 5.0 g/L,MgSO_4·7H_2O 0.5 g/L。摇瓶培养最佳条件:培养初始pH 6.0,培养温度28℃,装液量20%。Mg~(2+)、Ca~(2+)、Mn~(2+)对壳聚糖酶活力有一定的促进作用,Fe~(3+)、Cu~(2+)和Zn~(2+)对壳聚糖酶活力有一定的抑制作用。摇瓶培养条件优化后得到的壳聚糖酶活力为3 430 U/L,优化前壳聚糖酶活力为1 072 U/L,优化后是优化前的3.2倍。摇瓶培养得到菌体的最适生长时间为24 h,发酵于64 h后结束。[结论]优化后的培养条件提高了壳聚糖酶产量,使该菌株的工业应用成为可能。     

沙田柚柚皮提取物的抗菌性能研究

[目的]为柚皮的综合利用提供参考依据。[方法]用乙醇提取沙田柚柚皮中的有效成分,滤纸片扩散法测定柚皮提取物的抑菌活性,研究温度对柚皮提取物抑菌活性的影响,比较柚皮中的主要成分黄酮和香精油的抑菌作用。[结果]柚皮提取物对枯草芽孢杆菌具有较强的抑制作用,与100μg/ml的青霉素效果相当,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及酵母菌的抑制作用相对较弱,对米曲霉和黑曲霉没有明显的抑菌效果,施用7 h时抑菌圈较大,10 h后抑菌圈逐渐变小。温度对柚皮提取物的抑菌活性有明显影响。柚皮中的黄酮和香精油都具有抑菌作用,且香精油的抑菌活性低于黄酮。[结论]柚皮提取物具有良好的抑菌作用。     

野生大豆内生芽孢杆菌BHL3501的鉴定及对大豆胞囊线虫的抑制作用

[目的]鉴定野生大豆内生芽孢杆菌BHL3501并研究其对大豆胞囊线虫的抑制作用。[方法]通过形态学特征、生理生化特征及16S rDNA分析,鉴定了从野生大豆根中分离筛选到的1株具有杀线虫活力的内生细菌BHL3501,并研究了BHL3501菌株代谢物不同倍数稀释液对大豆胞囊线虫卵孵化及2龄幼虫活力的影响。[结果]BHL3501菌株初步鉴定为芽孢杆菌Bacillus sp.。其发酵原液处理24h后对大豆胞囊线虫卵孵化的相对抑制率为98.3%;10倍稀释液处理下相对抑制率为79.5%,均与无菌水对照差异显著。发酵原液处理24 h后,2龄幼虫的校正死亡率为93.1%,各稀释浓度处理均与无菌水对照差异显著。[结论]BHL3501代谢物对大豆胞囊线虫卵孵化有强烈的抑制作用,对其2龄幼虫有较强的毒杀作用。     

发酵液中木聚糖酶的纯化和性质的研究

[目的]为克隆木聚糖酶基因和构建基因工程菌提供重要的生物信息。[方法]曲霉固态发酵经硫酸铵盐析、疏水层析、凝胶过滤层析和阴离子交换层析等提纯步骤,获取纯的木聚糖酶并对其性质进行研究。[结果]该酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为4.5;纯酶在45℃以下较稳定,在pH 5.0~9.0范围内稳定;Ca2+对该酶有促进作用,Mn2+、Pb2+、Sn2+有较强的抑制作用;其分子量为26.8kDa;该酶在波长250和280 nm处分别有最小和最大吸收峰,是典型的蛋白质特征吸收峰,它在200~230 nm范围内有一个很大的吸收峰;该酶的等电点为4.2,为酸性蛋白质;Km为9.2 mg/ml。[结论]该研究为研究木聚糖酶的功能与应用奠定了基础。     

香芹酚对粘虫的毒杀活性研究

[目的]研究瑞香狼毒根中2甲-基-5异-丙基苯酚对粘虫的毒杀活性。[方法]提取纯化瑞香狼毒根粉中的化合物A并分析,然后进行对粘虫毒杀活性的测定。[结果]化合物A对粘虫有较好的毒杀活性,处理24 h后的致死浓度（LC50）为12.7 mg/L。[结论]首次从瑞香狼毒根中分离得到了2甲-基-5异-丙基苯酚,这将为新型植物源农药的研究和开发奠定较好的基础。