缺刻缘绿藻cDNA文库的构建

缺刻缘绿藻（Myrmecia incise）富含花生四烯酸（arachidonic acid,AA）,是迄今为止所知道的花生四烯酸含量最高的藻类。采用Trizol法提取总RNA,然后按照Clontech公司的SMART cDNA文库构建的方法,构建了缺刻缘绿藻的cDNA文库,测得的原始文库滴度为6×10^6pfu／mL,随机挑选文库的阳性单克隆进行PCR鉴定,扩增出的片段主要集中在0．5-1．5kb,平均插入片段长度约为1kb,文库的重组率达95．83％,说明本实验所构建的cDNA文库质量合格。     

紫外线胁迫的花生幼果cDNA文库构建与RS cDNA的分离

紫外线胁迫可导致花生产生白藜芦醇的诱导合成防御反应,本研究在利用UV处理花生幼果、激发花生幼果防御反应的基础上提取总RNA,应用SMART-cDNA文库构建试剂盒构建了花生幼果的cDNA文库.该文库含有1.0×106独立克隆,插入片段平均1 kb左右.利用所构建的cDNA文库,采用96孔板PCR筛选方法,分离获得2个白藜芦醇合成酶cDNA.     

利用SMART技术构建海带配子体cDNA文库

用Trizol试剂提取海带配子体总RNA,用SMART cDNA文库构建试剂盒构建cDNA文库。经测定原始文库滴度达到1.1×108Pfu/ml,文库有500μl体积,库容量为5.5×107Pfu,通过PCR检测,文库的重组率达100%,扩增出的片段主要集中在0.8~1.8 kb,平均插入片段长度约为1.34 kb。这些数据表明,已获得高质量的海带cDNA文库,为海带基因资源保存及新基因的克隆奠定了基础。     

利用改进的SMART法构建花生种皮全长cDNA文库

SMART法是目前全长cDNA文库构建的重要方法之一。在研究多种构建全长cDNA文库的方法基础上,吸收和改进了SMART法,对特异引物和PCR条件进行可行性的优化,成功构建了高质量的花生种皮全长cDNA文库,改进后的方法更经济、简便易行。经过涂平板测定和酶切反应快速鉴定表明,原始文库的滴度为1.23×106cfu.mL-1,重组率达93.3%,全长率为59%。插入片段大小多在1.0～2.0kb,所占比例为70%,平均大小在1.1kb左右,采用涂平板均匀扩增得到的扩增文库滴度达到了3.84×109 cfu.mL-1,可用于长期保存。     

石蒜叶片全长cDNA文库的构建

以石蒜叶片为材料,根据SMART[TM] cDNA文库构建试剂盒所示方法,提取叶片总RNA合成cDNA,连接到质粒载体pDNR-LIB上,采用电穿孔法将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中,构建了石蒜叶片全长cDNA文库.文库质量鉴定结果表明:文库滴度为1.15×106 PFU/ml,重组率99.17%,插入片段大小多为0.5～2.0 kb,1.0 kb以上的占60%.     

微藻异养/兼养生产多不饱和脂肪酸以及向卤虫的传递

等鞭金藻（Isochrysis sp.）与缺刻缘绿藻（Myrmecia incisa）分别富含二十二碳六烯酸（DHA）和花生四烯酸（ArA），是具有极高营养价值的微藻。对于这两种微藻的培养，大多是以传统的光自养为主；本研究展开了异养/兼养培养方式的探索，以期获得更高密度的生物量，以及更高产量的DHA与ArA。在使用葡萄糖作为外源有机碳源时，等鞭金藻和缺刻缘绿藻均可以实现异养生长，在黑暗条件下快速积累生物量。适宜等鞭金藻和缺刻缘绿藻异养的葡萄糖浓度分别为5 g/L和1 g/L。在此基础上，继续探究了氮浓度的影响：对于等鞭金藻，300 mg/L的硝酸钠对于生物量的生产最佳，同时对于胞内DHA积累的促进作用最强；对于缺刻缘绿藻，氮浓度对于微藻的生长影响不明显，但对其ArA的含量影响显著，缺氮培养时ArA的含量最高。在证实了两种微藻的异养特性与最适碳、氮营养供给后，我们进一步开展了兼养的研究，从而获得了显著提升的微藻生物量以及目标多不饱和脂肪酸的含量。最后，将兼养获得的两种微藻用于投喂卤虫，结果表明DHA与ArA都可以被有效传递给卤虫，从而有望开发成为营养强化型的水产饵料。本研究为等鞭金藻和缺刻缘绿藻的资源化利用提供了有价值的技术参考。     

东北梅花鹿鹿茸尖端组织全长cDNA文库的构建

为克隆出与鹿茸生长发育相关基因的全长序列,采用SMART技术构建了东北梅花鹿鹿茸尖端组织的全长cDNA文库.用SV Total RNA Isolation System试剂盒提取总RNA,以逆转录酶PowerScriptTM 反转录合成第一链cDNA,然后通过LD-PCR合成并扩增ds cDNA.扩增产物经纯化、SfiⅠ酶切、过CHROMA SPIN-400柱去除小片段后,连接到SfiⅠ消化过的pDNR-LIB质粒载体中,最后用电转化法将重组质粒转化到E. coli DH5α内得到原始文库.经测定,构建的原始文库约含有2.56×10~6个重组子,插入片段多在0.5～2kb之间,平均插入片段长度约1.1kb,重组效率接近100%.结果表明,东北梅花鹿鹿茸尖端组织的全长cDNA文库已构建成功.     

梅花鹿心脏组织cDNA文库的构建

[目的]构建梅花鹿心脏cDNA文库。[方法]提取梅花鹿心脏总RNA,纯化mRNA;合成双链cDNA,连接载体,并电转化至感受态细胞;测定文库的克隆数、重组率及插入片段大小。[结果]经鉴定,所构建梅花鹿心脏组织cDNA文库,库容量为3.8×106个克隆,重组率为100%,插入片段大小为0.5～2.0kb,平均长度约为1.0kb。[结论]所构建cDNA文库的各项指标均达到要求。     

水稻幼苗酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

为解析水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)与寄主水稻的互作机制,筛选水稻中与病毒互作的蛋白,以易感RBSDV的水稻品种日本晴3~4叶期的组织样品为材料,通过提取总RNA后分离获得m RNA,合成cDNA双链后连入pDONR222载体,获得初级文库。初级文库的滴度为6.6×10~6CFU/mL,库容为1.9×10~7CFU,重组率95%,插入片段平均长度1 kb。提取初级文库质粒,通过重组反应将水稻cDNA文库转移至pGADT7-DEST载体,构建获得水稻幼苗的酵母双杂交cDNA文库,文库的滴度为4.5×10~6CFU/mL,库容为1.3×10~7CFU,重组率95%,cDNA插入片段平均长度1 kb。采用RBSDV候选基因进行文库筛选,结果表明所构建的酵母文库可用于筛选病毒互作蛋白。     

新吉细毛羊皮肤组织均一化全长cDNA文库的质量评价

通过对已构建新吉细毛羊皮肤组织的均一化全长cDNA文库进行活化,在此基础上进行EST生物信息学分析研究,期望能发现影响细毛羊羊毛性状的主效基因或相关基因。运用菌落PCR、菌液PCR、质粒快速鉴定3种方法对cDNA文库进行评价,通过测序,在NCBI上BLASTn搜索、比对及运用DNAstar等软件进行分析。初步鉴定的结果：cDNA文库的库容量（滴度）为1．57×10。pfu／mL,菌落PCR、菌液PCR阳性克隆的小片段率在80％～90％,克隆的片段大小在0．6～2．0kb,cDNA在300～500bp,而质粒快速鉴定的在90％,克隆的片段载体带大小3．5～5．0kb。质粒快速鉴定的效果好于其他两种方法,耗时相对短,同时小片段率高;cDNA文库保存完好,符合基因文库的质量要求,有足够大的库容量来保证筛选目的基因。通过对筛选的阳性克隆5’端随机测序,随后获得可读序列169条,经过相关生物信息查询之后,发现其中可能含有完整基因。     

索式桃花水母全长cDNA文库的构建

[目的]构建索式桃花水母的全长cDNA文库,为桃花水母的生长、发育、衰老过程功能基因的进一步筛选、克隆和表达奠定基础。[方法]利用RNAiso试剂盒提取桃花水母的总RNA,采用SMART技术合成全长cDNA,经SfⅠi酶切消化后,将cDNA克隆到质粒载体pDNR-LIB,并对cDNA文库进行质量评价。[结果]经鉴定,原始文库的滴度为7.9×10^5cfu/ml,库容量约为1.0×10^6cfu。随机挑取28个克隆,经PCR快速鉴定,插入片段大小在0.5～2.5kb,平均大小在1.0kb左右,重组率达94%,表明获得了高质量的桃花水母cDNA文库。[结论]该试验成功构建了桃花水母cDNA文库,其cDNA原始文库的库容,根据真核生物能够满足建库的要求,同时文库的cD-NA插入片段序列是完整的,从而证实构建的文库质量较好,可以用于桃花水母目的基因的筛选。     

利用SMART技术构建蓝狐脾脏cDNA文库

用Trizol试剂提取蓝狐脾脏总RNA.用SMARTcDNA文库构建试剂盒构建全长cDNA文库.经测定,原始文库滴度达到3.0×106Pf/mL,文库的重组率达到了90%,通过随机PCR检测,扩增出的片断主要集中在0.6～1.8kb,平均插入片段长度约 为1.2 kb.这些数据表明,已获得高质量的蓝狐脾脏cDNA文库.构建的蓝狐脾脏的cDNA文库为进一步筛选、克隆脾脏特异表达基因奠定了基础.     

双孢蘑菇As2796全长cDNA文库的构建及鉴定

双孢蘑菇As2796是我国的主栽品种。为方便获得相关的目的基因,构建了该菌株的全长cDNA文库,文库初始库容达3.3×106 cfu.mL-1,插入片段长度范围0.7～4.0kb,平均长度约1.5kb,重组率约82%,全长率约35%。文库扩增出了5个目的基因全长编码序列(CDS),表明该文库的有效性,今后可用于扩增所需的双孢蘑菇基因的全长cDNA或CDS。     

大豆干旱和低温cDNA文库的构建与检测

以栽培大豆（Glycine max）吉林35为材料,在幼苗期进行干旱、低温处理,分离mRNA经逆转录合成cDNA后,插入到融合表达载体中,分别构建了干旱和低温两个融合表达文库。检测表明,两个初始文库的滴度分别为2．75×10^6pfu·mL^-1和5．52×10^5pfu·mL^-1插入的cDNA片断长度在0．5～2．0kb。此文库的构建为今后分离与干旱、低温相关基因奠定了基础。     

鸡胚成纤维细胞cDNA T7噬菌体表达文库的构建和鉴定

构建鸡胚成纤维细胞(CEF)T7噬菌体表达型cDNA文库,为筛选和研究CEF上病毒受体分子奠定基础。提取纯化CEF的mRNA,反转录合成双链cDNA,补平末端,连接EcoRⅠ/HindⅢ接头,双酶切,凝胶过滤层析除去小于400bp的cDNA片段,合成双链cDNA定向与T7噬菌体左右臂连接,体外包装后建成cDNA表达文库。测定文库大小、重组率,并以PCR鉴定cDNA插入片段的大小。结果表明,构建的cDNA文库滴度为2.2×107pfu/mL、扩增后滴度为3.5×1010pfu/mL,重组效率达98%、插入片段多在0.4～3kb之间,平均插入片段长约1.3kb。表明所建文库具有很高的质量,从而为筛选目的cDNA克隆奠定了基础。     

抗黑胫病烟草品种K326 cDNA文库的构建*

 以优质高抗黑胫病的烟草品种K326为材料,在苗期接种黑胫病菌丝,3d后取叶片用Trizol试剂提取总RNA,经电泳检测28S,18S条带清晰,无DNA污染。以总RNA为模板,采用SMART技术合成双链cDNA,其产物主要集中在0.5～3kb之间,最大片段超过3kb。合成的双链cDNA经SfiⅠ（A/B）酶酶切后,用CHROMA SPIN-400层析柱分离分级cDNA,将大于0.5kb的cDNA片段混合,载入λTriplEx2载体,构建成云南第一个烟草cDNA文库。该文库的大小为1.2×10⁷pfu。扩增文库的滴度达到1.2×10⁹pfu/mL。文库的重组率大于94%。取阳性克隆转化为质粒,通过PCR反应检测,重组体确有DNA插入, 其片断大小在0.5～1kb之间。     

抗稻瘟病链霉菌JK-1基因组BAC文库构建

实验以抗稻瘟病链霉菌JK-1的基因组DNA为材料构建了其BAC（bacterial artificial chromosome）文库。该文库共有3456个克隆,插入片段在40-100kb,平均插入片段55kb,空载率低于5%,覆盖了链霉菌基因组约17.3倍。抗稻瘟病链霉菌JK-1基因组BAC文库的构建,为进一步研究基因组结构及其功能基因的利用等奠定了基础。     

彩叶草叶片cDNA文库的构建与分析

用植物(叶)总RNA抽提试剂盒提取彩叶草红色品种顶部叶片总RNA,用SMARTcDNALi-braryConstructionKit构建cDNA文库。经测定原始文库滴度为1.2×106pfu/ml,扩增总文库滴度为6.7×109pfu/ml,重组率达到98%,插入片段在0.5kb到2kb之间,1kb以上的占60%。通过PCR检测,从总文库中检测到了彩叶草CHS、DFR及ANS基因的特异片段。各项指标都表明,已获得较高质量的cDNA文库,为彩叶草叶色基因的分离克隆,彩叶草类黄酮类色素合成的分子调控的研究奠定了基础。     

策略构建小黑杨茎形成层全长cDNA文库

为了研究小黑杨木材形成过程中的关键基因,以2年生小黑杨茎形成层组织为试验材料提取RNA,采用SMART (RNA 转录过程中的5′末端转换机制) 技术合成cDNA第一链,通过LD-PCR合成双链cDNA。利用SfiⅠ限制性酶酶切后将其连接到质粒载体pDNR-LIB上,采用电穿孔法将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中,构建全长cDNA文库。文库质量鉴定表明:原始文库滴度为2.18×106 pfu/mL,扩增后的文库滴度为5.46×109 pfu/mL,重组率为96%。插入片段长度在0.5～2.0 kb之间,平均长度为1.12 kb,表明构建的小黑杨茎形成层cDNA文库较为理想。