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利用改进的SMART法构建花生种皮全长cDNA文库 总被引:1,自引:0,他引:1
SMART法是目前全长cDNA文库构建的重要方法之一。在研究多种构建全长cDNA文库的方法基础上,吸收和改进了SMART法,对特异引物和PCR条件进行可行性的优化,成功构建了高质量的花生种皮全长cDNA文库,改进后的方法更经济、简便易行。经过涂平板测定和酶切反应快速鉴定表明,原始文库的滴度为1.23×106cfu.mL-1,重组率达93.3%,全长率为59%。插入片段大小多在1.0~2.0kb,所占比例为70%,平均大小在1.1kb左右,采用涂平板均匀扩增得到的扩增文库滴度达到了3.84×109 cfu.mL-1,可用于长期保存。 相似文献
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体外特异位点重组技术应用于cDNA文库的构建,克服了传统文库构建方法中的常见问题。本研究利用这一技术,以能够分离得到植物激活蛋白的黄瓜灰霉菌(B.cinerea)菌株为材料,用TRIZOL试剂提取总RNA,从中分离纯化出mRNA,用预先接有attB2位点的Oligo(dT)引物和SuperScriptTMⅡ反转录酶合成cDNA,双链cDNA与attB1接头连接,经重组、转化后构建了其cDNA文库。文库滴度为2.3×106pfu/mL,文库总容量达2.53×107。随机挑取24个克隆,经酶切检测,平均插入片断为1466bp,重组率达100%。 相似文献
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小黑麦异多附加系M17叶片cDNA文库构建及抗小麦白粉病特异表达cDNA的差别筛选(英文) 总被引:1,自引:0,他引:1
以对小麦白粉病菌免疫的小黑麦异多附加系M17(1R“6R”)为材料,一组接种小麦白粉病菌,另一组不接种.分别提取两组叶片的总RNA,经磁珠法分离出poly(A+)RNA,以Oligo(dT)为引物,经反转录合成cDNA.将接种组双链cDNA克隆进λgt10载体,得到一个含9.8×104个重组噬菌体的cDNA文库.两组cDNA双链经切口平移法制成总cDNA探针,分别与cDNA文库杂交,通过差别筛选的方法,找到了6个与小麦白粉病抗性有关的cDNA克隆. 相似文献
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为筛选青枯菌M5菌株特有的序列,利用SSH技术对青枯菌生理小种5号菌株M5(tester)和生理小种1号菌株GMI1000(driver)基因组进行了比较。分别提取二者基因组DNA,RsaⅠ酶切,将酶切后M5菌株DNA分为两份,分别与接头1和接头2R连接,然后进行两轮杂交和两轮PCR扩增,并检测连接效率与消减效率。将获得的消减PCR产物,即差异基因/差异DNA片段,与pGEM-T载体连接,转化E.coli DH5α感受态细胞,建立消减文库。随机挑取96个白色克隆,经菌液PCR法测定,80个为预期阳性,含有预期的插入片段。首次构建了青枯菌M5菌株特异基因的抑制消减文库,为进一步筛选、克隆青枯菌M5菌株特异核苷酸片段奠定了基础。 相似文献
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【目的】构建水貂生长激素(mGH)基因真核表达载体,并在巴斯德毕赤酵母GS115中进行表达,为大量获得水貂生长激素奠定基础。【方法】将体外合成的水貂生长激素基因插入分泌型表达载体pPIC9K。将重组的pPIC9K-mGH用SacI酶切后,LiC1法转化巴斯德毕赤酵母菌株GS115,经G418筛选后进行甲醇诱导表达,并以SDS-PAGE和Western blot检测酵母上清中水貂生长激素的表达。【结果】酵母上清中可见与目的蛋白相对分子量(31kd)相符的条带,该条带可被水貂生长激素多克隆抗体特异识别。【结论】正确构建了水貂生长激素真核表达载体,该蛋白能在巴斯德毕赤酵母中成功表达。 相似文献
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Gateway技术构建酵母双杂分析用辣椒cDNA文库 总被引:1,自引:0,他引:1
构建cDNA文库是利用酵母双杂交技术开展特定cDNA分离的重要基础工作.利用Gateway技术,在成功提取辣椒总RNA并分离mRNA的基础上,合成了3种读码框的双链cDNA,通过BP反应构建其相应的入门文库,再通过LR反应将cDNA迅速且定向地重组到酵母双杂分析用目的载体pDESTTM22上,构建成高质量目的文库.经检测入门文库和目的文库滴度均达到(4.0~5.0)×106 cfu/ mL,文库总容量为(2.4~3.0)×107 cfu,平均插入片段大小为1 250 bp,其质量完全满足于进一步利用酵母双杂体系分析目的基因互作蛋白cDNA. 相似文献
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建立了一种以LD-PCR为基础的cDNA文库的快速构建方法.以人胎盘组织为材料获得总RNA,利用引物F1、R2在逆转录酶M-MLV的作用下合成cDNA第1链,进而利用引物F3、R4在DNA聚合酶的作用下通过LD-PCR方法合成cDNA第2链;双链cDNA经SfiⅠ酶切,通过T4 DNA连接酶连接到经相同酶切的JG45质粒载体后构建成cDNA文库,并对文库的容量、重组率以及多样性进行了分析.结果表明,通过该方法构建的cDNA文库容量约为7.01×105 个/μgds-cDNA,重组率为96%;对随机提取的100个克隆质粒的插入序列进行分析,共获得80个不同的cDNA序列,且未见重复序列.该法构建的cDNA质粒文库具有快速、简单的特点,构建的文库质量符合要求,可用于大规模的基因分析. 相似文献
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枸杞叶片cDNA文库的构建 总被引:3,自引:0,他引:3
以宁夏枸杞叶片为材料,采用异硫氰酸胍—酚—氯仿法提取完整的总RNA,利用PolyATractmRNAIsolationSystem分离mRNA,然后用UniversalRibocloneRcDNASynthesisSystem合成双链cDNA,在cDNA末端连接上EcoRⅠ接头,并与λExCell载体连接,利用PackageneLambdaDNAPackagingSystem进行包装,在国内外首次构建出滴度为2 78×105pfu/mL,重组效率为88 1%的枸杞叶片cDNA文库。 相似文献
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[目的]构建索式桃花水母的全长cDNA文库,为桃花水母的生长、发育、衰老过程功能基因的进一步筛选、克隆和表达奠定基础。[方法]利用RNAiso试剂盒提取桃花水母的总RNA,采用SMART技术合成全长cDNA,经SfⅠi酶切消化后,将cDNA克隆到质粒载体pDNR-LIB,并对cDNA文库进行质量评价。[结果]经鉴定,原始文库的滴度为7.9×10^5cfu/ml,库容量约为1.0×10^6cfu。随机挑取28个克隆,经PCR快速鉴定,插入片段大小在0.5~2.5kb,平均大小在1.0kb左右,重组率达94%,表明获得了高质量的桃花水母cDNA文库。[结论]该试验成功构建了桃花水母cDNA文库,其cDNA原始文库的库容,根据真核生物能够满足建库的要求,同时文库的cD-NA插入片段序列是完整的,从而证实构建的文库质量较好,可以用于桃花水母目的基因的筛选。 相似文献