SMART策略构建小黑杨茎形成层全长cDNA文库

为了研究小黑杨木材形成过程中的关键基因,以2年生小黑杨茎形成层组织为试验材料提取RNA,采用SMART(RNA转录过程中的5′末端转换机制)技术合成cDNA第一链,通过LD-PCR合成双链cDNA。利用SfiⅠ限制性酶酶切后将其连接到质粒载体pDNR-LIB上,采用电穿孔法将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中,构建全长cDNA文库。文库质量鉴定表明:原始文库滴度为2.18×106pfu/mL,扩增后的文库滴度为5.46×109pfu/mL,重组率为96%。插入片段长度在0.5～2.0kb之间,平均长度为1.12kb,表明构建的小黑杨茎形成层cDNA文库较为理想。     

CAP-trapper法构建台湾乳白蚁中后肠全长cDNA文库

通过CAP-trapper法构建台湾乳白蚁的中后肠全长cDNA文库,经过中后肠总RNA的提取、mRNA的纯化与分离、cDNA双链的合成、cDNA大片段的分级分离与回收、载体的连接,体外包装等步骤,获得了滴度为1.6×106pfu/mL,重组率为98.7%,库容量为5.6×107cfu的初级文库,扩增后文库滴度为8.5×109pfu/mL,插入片段平均大小为2.1 kb,插入片段全长率约为44%。这表明利用该方法构建台湾乳白蚁中后肠cDNA文库切实可行。     

石蒜叶片全长cDNA文库的构建

以石蒜叶片为材料,根据SMART[TM] cDNA文库构建试剂盒所示方法,提取叶片总RNA合成cDNA,连接到质粒载体pDNR-LIB上,采用电穿孔法将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中,构建了石蒜叶片全长cDNA文库.文库质量鉴定结果表明:文库滴度为1.15×106 PFU/ml,重组率99.17%,插入片段大小多为0.5～2.0 kb,1.0 kb以上的占60%.     

水稻幼苗酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

为解析水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)与寄主水稻的互作机制,筛选水稻中与病毒互作的蛋白,以易感RBSDV的水稻品种日本晴3~4叶期的组织样品为材料,通过提取总RNA后分离获得m RNA,合成cDNA双链后连入pDONR222载体,获得初级文库。初级文库的滴度为6.6×10~6CFU/mL,库容为1.9×10~7CFU,重组率95%,插入片段平均长度1 kb。提取初级文库质粒,通过重组反应将水稻cDNA文库转移至pGADT7-DEST载体,构建获得水稻幼苗的酵母双杂交cDNA文库,文库的滴度为4.5×10~6CFU/mL,库容为1.3×10~7CFU,重组率95%,cDNA插入片段平均长度1 kb。采用RBSDV候选基因进行文库筛选,结果表明所构建的酵母文库可用于筛选病毒互作蛋白。     

鹿茸间充质细胞全长cDNA文库的构建

解剖梅花鹿鹿茸,取得间充质,经过胰酶消化,体外培养鹿茸间充质细胞。利用TRIZOL提取鹿茸间充质细胞总RNA,利用BD SMART技术构建鹿茸间充质细胞全长cDNA文库,测定该文库初级文库滴度为3.0×105 pfu/mL,扩增文库滴度为6.0×108 pfu/mL。插入片段长度大于500 bp。     

津田芜菁直根皮cDNA文库的构建及ESTs测序质量的分析

利用Trizol法从津田芜菁中提取总RNA,分离纯化富含Poly(A)+的mRNA,反转录合成双链cDNA,并以λ-ZAP为载体,构建了津田芜菁cDNA文库。以XL1-Blue为受体菌,测定原始文库的滴度为4. 3×106pfu/mL,重组率为96%,扩增后文库总滴度为6×1010pfu/mL。对随机提取的质粒进行PCR鉴定,表明插入片段大多分布在0. 5~2. 0kb之间。文库质量鉴定结果表明,构建的津田芜菁直根皮cDNA文库具有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段。对3 020个克隆的序列测定表明,获得可用序列2 718个,测序成功率为90%,首批共获得652个芜菁直根皮ESTs。     

尼罗罗非鱼肝cDNA文库的构建

用Stratagene技术构建了吉富品系尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus,GIFT strain)肝cDNA文库。首先用TRIZOL法提取肝总RNA,经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度检测,表明总RNA纯度高且完整性良好。然后分离纯化mRNA,合成双链cDNA之后,加EcoRⅠ接头、EcoRⅠ末端磷酸化、XhoⅠ消化,并用葡聚糖凝胶柱层析分级收集cDNA样品,得到300 mg cDNA,符合建库要求。双链cDNA与Uni-ZAP XR Vector连接后,用GigapackⅢGold Packaging Extract进行体外包装得到cDNA文库。测得的文库滴度为1.25×107pfu/mL,文库噬菌体的滴度符合文库保存和筛选实验的要求。随机挑选20个阳性单克隆噬菌斑进行PCR鉴定后,得出文库的重组率达100%,扩增出的片段主要集中在0.5~2 kb之间,平均插入片段长度约为1.05 kb,结果说明本实验所构建的cDNA文库质量较高。取扩增文库80μL进行体外切割,约含3.6×106个重组子,切割后phagemid量为2.0×106,切割效率为79.4%。经抽提质粒获得质粒DNA约1.2 mg。     

春大豆花芽cDNA文库的构建及质量分析

【目的】为了解大豆多荚、多粒相关基因的调控机制,构建了大豆花芽cDNA文库,根据要求初步鉴定了所构建文库的质量.【方法】以大豆吉农18突变体的幼嫩花芽为材料提取总RNA,采用SMART技术合成双链cDNA.经蛋白酶K的消化及SfiⅠ酶切后,将所得cDNA克隆到λTriplEx质粒载体中,成功构建了大豆花芽全长cDNA文库.【结果和结论】将初始文库经扩增后保存,检测扩增文库滴度为2.13×108pfu/mL,重组率接近95.3%,菌落PCR鉴定插入片段主要分布在0.5~2.0 kb.插入片段平均大小在1.0 kb左右.表明本研究所构建的文库既满足了目的基因的分离筛选,又可保证全长cDNA文库的获得,该文库的构建为进一步开展相关基因的克隆及分子生物学研究奠定基础.     

东北梅花鹿鹿茸尖端组织全长cDNA文库的构建

为克隆出与鹿茸生长发育相关基因的全长序列,采用SMART技术构建了东北梅花鹿鹿茸尖端组织的全长cDNA文库.用SV Total RNA Isolation System试剂盒提取总RNA,以逆转录酶PowerScriptTM 反转录合成第一链cDNA,然后通过LD-PCR合成并扩增ds cDNA.扩增产物经纯化、SfiⅠ酶切、过CHROMA SPIN-400柱去除小片段后,连接到SfiⅠ消化过的pDNR-LIB质粒载体中,最后用电转化法将重组质粒转化到E. coli DH5α内得到原始文库.经测定,构建的原始文库约含有2.56×10~6个重组子,插入片段多在0.5～2kb之间,平均插入片段长度约1.1kb,重组效率接近100%.结果表明,东北梅花鹿鹿茸尖端组织的全长cDNA文库已构建成功.     

抗黑胫病烟草品种K326 cDNA文库的构建*

 以优质高抗黑胫病的烟草品种K326为材料,在苗期接种黑胫病菌丝,3d后取叶片用Trizol试剂提取总RNA,经电泳检测28S,18S条带清晰,无DNA污染。以总RNA为模板,采用SMART技术合成双链cDNA,其产物主要集中在0.5～3kb之间,最大片段超过3kb。合成的双链cDNA经SfiⅠ（A/B）酶酶切后,用CHROMA SPIN-400层析柱分离分级cDNA,将大于0.5kb的cDNA片段混合,载入λTriplEx2载体,构建成云南第一个烟草cDNA文库。该文库的大小为1.2×10⁷pfu。扩增文库的滴度达到1.2×10⁹pfu/mL。文库的重组率大于94%。取阳性克隆转化为质粒,通过PCR反应检测,重组体确有DNA插入, 其片断大小在0.5～1kb之间。     

鸡胚成纤维细胞cDNA T7噬菌体表达文库的构建和鉴定

构建鸡胚成纤维细胞(CEF)T7噬菌体表达型cDNA文库,为筛选和研究CEF上病毒受体分子奠定基础。提取纯化CEF的mRNA,反转录合成双链cDNA,补平末端,连接EcoRⅠ/HindⅢ接头,双酶切,凝胶过滤层析除去小于400bp的cDNA片段,合成双链cDNA定向与T7噬菌体左右臂连接,体外包装后建成cDNA表达文库。测定文库大小、重组率,并以PCR鉴定cDNA插入片段的大小。结果表明,构建的cDNA文库滴度为2.2×107pfu/mL、扩增后滴度为3.5×1010pfu/mL,重组效率达98%、插入片段多在0.4～3kb之间,平均插入片段长约1.3kb。表明所建文库具有很高的质量,从而为筛选目的cDNA克隆奠定了基础。     

彩叶草叶片cDNA文库的构建与分析

用植物(叶)总RNA抽提试剂盒提取彩叶草红色品种顶部叶片总RNA,用SMARTcDNALi-braryConstructionKit构建cDNA文库。经测定原始文库滴度为1.2×106pfu/ml,扩增总文库滴度为6.7×109pfu/ml,重组率达到98%,插入片段在0.5kb到2kb之间,1kb以上的占60%。通过PCR检测,从总文库中检测到了彩叶草CHS、DFR及ANS基因的特异片段。各项指标都表明,已获得较高质量的cDNA文库,为彩叶草叶色基因的分离克隆,彩叶草类黄酮类色素合成的分子调控的研究奠定了基础。     

双低油菜华双3号幼苗全长cDNA文库的构建

利用RNA5′端模板转换技术,以甘蓝型双低油菜华双3号幼苗为材料,构建了其全长cDNA文库。结果表明:文库的原始滴度为1.25×106pfu·mL-1,重组率为87.3%;扩增后的文库滴度为1.13×109pfu·mL-1。随机挑取12个噬菌斑,利用PCR扩增插入片段,电泳结果显示其长度在0.6～1.5kb之间。     

利用SMART技术构建蓝狐脾脏cDNA文库

用Trizol试剂提取蓝狐脾脏总RNA.用SMARTcDNA文库构建试剂盒构建全长cDNA文库.经测定,原始文库滴度达到3.0×106Pf/mL,文库的重组率达到了90%,通过随机PCR检测,扩增出的片断主要集中在0.6～1.8kb,平均插入片段长度约 为1.2 kb.这些数据表明,已获得高质量的蓝狐脾脏cDNA文库.构建的蓝狐脾脏的cDNA文库为进一步筛选、克隆脾脏特异表达基因奠定了基础.     

尼罗罗非鱼肝cDNA文库的构建

用Stratagene技术构建了吉富品系尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus,GIFT strain)肝cDNA文库。首先用TRIZOL法提取肝总RNA,经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度检测,表明总RNA纯度高且完整性良好。然后分离纯化mRNA,合成双链cDNA之后,加EcoRⅠ接头、EcoRⅠ末端磷酸化、XhoⅠ消化,并用葡聚糖凝胶柱层析分级收集cDNA样品,得到300 mg cDNA,符合建库要求。双链cDNA与Uni-ZAP XR Vector连接后,用GigapackⅢGold Packaging Extract进行体外包装得到cDNA文库。测得的文库滴度为1.25×107pfu/mL,文库噬菌体的滴度符合文库保存和筛选实验的要求。随机挑选20个阳性单克隆噬菌斑进行PCR鉴定后,得出文库的重组率达100%,扩增出的片段主要集中在0.5~2 kb之间,平均插入片段长度约为1.05 kb,结果说明本实验所构建的cDNA文库质量较高。取扩增文库80μL进行体外切割,约含3.6×106个重组子,切割后phagemid量为2.0×106,切割效率为79.4%。经抽提质粒获得质粒DNA约1.2 mg。     

葱蝇夏滞育蛹的全长cDNA文库构建

葱绳具有夏滞育的特性且与果绳近缘.为构建葱蝇夏滞育蛹的全长cDNA文库,并为进一步的夏滞育专化基因筛选、克隆和表达分析莫定基础,利用RNAiso试剂盒提取葱绳夏滞育蛹的总RNA,采用SMART技术合成全长cDNA,限制性酶切消化后将cDNA克隆到质粒载体pDNR-LIB.经鉴定原始文库的滴度为2.4×107cfu/mL.随机挑取克隆,经PCR快速鉴定,插入片段大小在0.35～2.2kb之间,平均大小约为0.9kb,重组率达100%,获得了高质量的葱绳夏滞育场cDNA文库.