鲤鱼卵中丝氨酸蛋白酶抑制剂活性的初步研究

利用凝胶层析法从鲤鱼(Cyprinus carpio)卵中分离纯化得到一种丝氨酸蛋白酶抑制剂。选择胰蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、凝血酶及其特异底物,建立比色法检测,对初步分离的丝氨酸蛋白酶抑制剂活性进行了分析。结果表明,丝氨酸蛋白酶抑制除对胰凝乳蛋白酶无抑制作用外,对其他的蛋白酶均有抑制效果;当温度超过70℃时,丝氨酸蛋白酶抑制剂失活,但在pH 2~11均保持活性,具有较强的酸碱稳定性。     

白鲢骨骼肌丝氨酸蛋白酶抑制剂对Jarkat,Sp20,MG63细胞增殖的影响

应用MTT法分析了白鲢骨骼肌丝氨酸蛋白酶抑制剂对急性T细胞白血病细胞Jarkat、人骨髓瘤细胞Sp20和人骨瘤细胞MG63生长的影响。结果表明:白鲢骨骼肌丝氨酸蛋白酶抑制剂对以上3种肿瘤细胞的增殖都有抑制作用,而且抑制作用呈剂量依赖性;该丝氨酸蛋白酶抑制剂在0.1 g/L浓度下对Jarkat细胞的增殖有明显的抑制作用。     

丝氨酸蛋白酶与植物器官衰老关联的研究进展

丝氨酸蛋白酶是最大的一类蛋白酶家族,广泛参与植物的衰老、细胞分化、超敏反应、蛋白质降解和加工等生理过程。笔者综述了丝氨酸蛋白酶家族在植物体内作用,丝氨酸蛋白酶在植物器官衰老方面的作用以及在瓶插切花衰老方面的研究进展。     

毛果杨丝氨酸蛋白酶抑制剂基因PtrSPI的克隆及真核表达

利用PCR技术从毛果杨(Populus trichocarpa)中分离得到1条丝氨酸蛋白酶抑制剂基因PtrSPI,该基因cDNA编码区全长为1176 bp,可编码391个氨基酸。BlastP预测结果显示,该丝氨酸蛋白酶抑制剂属于SERPIN超家族。多序列比对结果表明,毛果杨PtrSPI基因的氨基酸序列与已报道的胡杨(P.euphratica)丝氨酸蛋白酶抑制剂氨基酸序列XP_011030699同源性最高,相似性为92%,且蛋白的C端氨基酸序列都含有高度保守的反应中心环(RCL)。在此基础上,成功构建了PtrSPI基因的重组真核表达载体pPICK-PtrSPI并获得了重组毕赤酵母菌株GS115-PtrSPI。利用终质量分数为0.5%甲醇诱导重组真核蛋白表达,SDS-PAGE电泳结果显示,在42648.45处出现了重组蛋白,与预期值一致。     

小麦叶片中1种降解Rubisco大亚基的蛋白酶鉴定

[目的]探明小麦叶片衰老过程中1种降解1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase,Rubisco)大亚基蛋白酶的生化特性.[方法]通过天然梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳后切胶回收的方法获得Rubisco全酶,采用离子交换层析、非完全变性十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和切胶回收蛋白等方法分离目的蛋白酶,并采用含明胶的聚丙烯酰胺凝胶电泳研究其生化特性(主要是最适pH、最适温度、热稳定性、蛋白酶类型等).[结果]切胶回收的Rubisco全酶样品中存在降解大亚基的蛋白酶.在Mono-Q离子交换层析条件下,该蛋白酶与Rubisco不易分离.利用非完全变性十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离出这种降解大亚基的蛋白酶;在聚丙烯酰胺凝胶中,该蛋白酶相对分子质量大于大亚基相对分子质量,位置在大亚基上方,其余部分没有检测到蛋白酶活性.该酶的最适温度为60℃;最适pH值为7.0,在pH 5.0～ 8.0均表现出较高的活性;该酶热稳定性一般,在50℃以上几乎完全丧失其活性;丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF[4-(2-Aminoethyl) benzenesulfonyl fluoride hydrochloride]可以完全抑制蛋白酶活性,金属蛋白酶抑制剂1,10-phenanthroline可以部分抑制该蛋白酶的活性,酸性蛋白酶抑制剂pepstatin、半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64[transepoxysuccinyl-L-leucylamido(4-guanidino)butane]、金属蛋白酶抑制剂EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid)和EGTA[ethylenebis (oxyethylenenitrilo) tetraacetic acid]以及丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF(phenylmethanesulfonyl fluoride)不抑制该蛋白酶的活性.[结论]在切胶回收的Rubisco全酶中发现了1种可以降解Rubisco大亚基的蛋白酶,其可能是1种需要金属离子的丝氨酸型蛋白酶.     

鲤鱼肌肉中胶原蛋白酶的分离纯化与性质分析

利用明胶酶谱法,在鲤鱼肌肉中检测到了一种具有分解胶原蛋白能力的丝氨酸蛋白酶.通过硫酸铵盐析、DEAE-Sephacel和Phenyl-Sepharose等一系列柱层析法,纯化得到了分子质量为70 ku,能够降解胶原蛋白的丝氨酸蛋白酶（Collagenolytic Serine Proteinase,CSP）.性质分析表明,CSP在弱碱性条件下显示活性,最适温度为30℃;丝氨酸蛋白酶抑制剂特异抑制CSP的活性.CSP能有效地分解鲤鱼肌肉中的I型胶原蛋白,提示其可能在鱼体死后肌肉胶原蛋白降解中发挥着重要的作用.     

毛果杨丝氨酸蛋白酶抑制子PtrSPI的抗虫能力分析

  目的  研究毛果杨丝氨酸蛋白酶抑制子PtrSPI的抗虫功能,为开发新型林木抗虫生物农药奠定基础。  方法  本研究通过研究毛果杨丝氨酸蛋白酶抑制子基因PtrSPI的启动子及其在舞毒蛾幼虫取食胁迫下的表达模式,分析PtrSPI基因功能;利用真核重组蛋白PtrSPI饲喂舞毒蛾幼虫,观察记录幼虫的取食量、体质量和死亡率,并测定取食后的幼虫体内丝氨酸蛋白酶活性,探讨PtrSPI蛋白的抗虫能力。  结果  结果表明毛果杨丝氨酸蛋白酶抑制子基因PtrSPI的启动子区域共包含5个与植物抗病虫相关的元件;经舞毒蛾幼虫取食后,毛果杨叶片的PtrSPI基因呈先降后升的表达模式,且在取食30 h达到峰值,为空白对照的2.03倍;高质量浓度重组蛋白PtrSPI（300和500 mg/mL）对舞毒蛾幼虫的取食量和体质量有显著的抑制作用,而且分别在取食4和6 d后舞毒蛾幼虫死亡率均达到60%以上,而幼虫体内丝氨酸蛋白酶的活性在取食初期显著上升。  结论  本研究验证了毛果杨丝氨酸蛋白酶抑制子PtrSPI的抗虫能力,可为进一步研发新型无公害抗虫生物农药提供理论基础和研究材料。      

暗诱导衰老小麦叶片内一种耐热蛋白水解酶的分离及其生化特性鉴定

采用30%～50%饱和度的硫酸铵沉淀、凝胶层析脱盐及聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳,再通过直接切胶后用回收槽电洗脱回收的方法,从暗诱导衰老小麦叶片中分离得到了1种耐热的蛋白水解酶.该酶具有良好的热稳定性,且表现出相当宽的pH稳定范围.该酶的最适温度为50 ℃,最适pH为8.分离得到的酶液在0～60 ℃处理1 h后,酶活性无明显变化,70 ℃处理1 h后仍有部分活性.酸性蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和半胱氨酸蛋白酶抑制剂都不能抑制该蛋白水解酶的活性,但丝氨酸蛋白酶抑制剂能部分抑制该酶的活性.     

暗诱导衰老小麦叶片内一种耐热蛋白水解酶的分离及其生化特性鉴定

采用30%～50%饱和度的硫酸铵沉淀、凝胶层析脱盐及聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳,再通过直接切胶后用回收槽电洗脱回收的方法,从暗诱导衰老小麦叶片中分离得到了1种耐热的蛋白水解酶.该酶具有良好的热稳定性,且表现出相当宽的pH稳定范围.该酶的最适温度为50 ℃,最适pH为8.分离得到的酶液在0～60 ℃处理1 h后,酶活性无明显变化,70 ℃处理1 h后仍有部分活性.酸性蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和半胱氨酸蛋白酶抑制剂都不能抑制该蛋白水解酶的活性,但丝氨酸蛋白酶抑制剂能部分抑制该酶的活性.     

中药蒲黄纤溶蛋白的分离纯化及部分性质

用DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析从中草药蒲黄中分离纯化一种纤维蛋白溶解酶,用纤维蛋白板检测分离后组分的纤溶蛋白活性,天然电泳检测分离效果,分离后得到了比活力为25.29的单一组分,SDS电泳确定该组分的表观分子量为31 000 D,同时比较了不同蛋白酶抑制剂对该组分的抑制作用。结果表明:该组分的纤维蛋白水解酶活性被PMSF、亮抑肽素、抑肽酶、大豆胰蛋白酶抑制剂以及苯甲脒强烈抑制,表明该粗提物中的蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶家族。     

豇豆籽肽的制备及抗氧化活性研究

[目的]采用酶法制备豇豆籽蛋白肽,并探讨其抗氧化活性。[方法]先用碱提酸沉法制备豇豆籽蛋白,然后分别用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解制备豇豆籽肽,后者脱盐后进行DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子清除活性分析。[结果]碱性蛋白酶水解能力强于木瓜蛋白酶,2种酶水解后的豇豆籽肽对3种自由基均具有较好的清除活性。在相应浓度范围内,对DPPH自由基最大清除率分别为63.92%(碱性蛋白酶)和63.06%(木瓜蛋白酶),半数抑制浓度IC50分别为3.20和3.28 mg/ml;对羟基自由基最大清除率分别为87.66%(碱性蛋白酶)和85.88%(木瓜蛋白酶),相应IC50分别为4.21和4.89 mg/ml;对超氧阴离子自由基的最大清除率64.06%(碱性蛋白酶)和47.92%(木瓜蛋白酶)。[结论]研究可为豇豆籽蛋白肽的深度开发和综合利用提供一定的理论基础。     

饲料蛋白质水平对大鳞鲤幼鱼消化酶活性的影响

试验研究了不同饲料蛋白质水平对初重（11．07±2．42）g大鳞纪幼鱼（Barbus capito）消化酶活性的影响。饲料蛋白质水平设7个梯度：30．24％（G1）、33．22％（G2）、36．23％（G3）、39．33％（G4）、42．15％（G5）、45．33％（G6）和48．12％（G7）,每处理组设3个重复,每重复30尾鱼。试验鱼饲养周期为56d。结果表明,饲料蛋白质水平影响前肠和中肠的蛋白酶活性;G5前肠蛋白酶活性显著高于G1和G7（P〈0．05）;G4中肠蛋白酶活性显著高于G1、G6和G7（P〈0．05）。随着饲料蛋白质水平的升高,后肠蛋白酶活性先增大、后降低。各处理组前肠、中肠、后肠和肝胰腺的脂肪酶活性均无显著差异（P〉0．05）。而随着饲料蛋白质水平的升高,前肠、中肠、后肠和肝胰腺淀粉酶活性降低：G7前肠淀粉酶活性显著低于G3和G6（P〈0．05）;G7中肠淀粉酶活性显著低于G1和G4（P〈0．05）;G7后肠淀粉酶活性显著低于其它处理组（P〈0．05）;G7肝胰腺淀粉酶活性显著低于G1、G2、G3和G4（P〈0．05）。从而得出结论：饲料蛋白质水平显著影响大鳞鱼巴幼鱼的蛋白酶和淀粉酶活性,而对脂肪酶的活性影响不显著。饲料蛋白质水平为39．33％时,大鳞鱼巴幼鱼的消化酶活性最强。     

鳀鱼蛋白粉制备工艺研究

以鳀鱼为对象,以鳀鱼内源酶自溶结合复合外源蛋白酶多酶法深度酶解作为关键控制点,研究了鳀鱼蛋白粉的制备新工艺。结果表明,鳀鱼在55℃,pH8．0条件下内源蛋白酶自溶6h,调解pH7．0,再加入外源蛋白酶（0．1％复合蛋白酶＋0．1％风味蛋白酶）,55℃酶解24h,酶解效果最佳。采用该工艺制备的鲲鱼蛋白粉,蛋白质含量高达82．8％,脂肪含量为0．8％。蛋白粉呈乳白色粉末,香味浓郁,无苦味,可速溶于水,是理想的高蛋白低脂肪的健康配料,可用作海鲜调味料基料和保健品配料的基料。     

山药蛋白酶解液的分离纯化

以山药(Dioscorea opposite Thumb.)为原料,选取碱性蛋白酶酶解山药蛋白粗提物制备山药蛋白酶解液。分别采用纤维素DE-52阴离子交换层析和Sephadex G-50凝胶层析,对酶解制备的山药蛋白酶解液进行分离纯化。结果表明:经过纤维素DE-52阴离子交换层析,得到4个吸收峰,收集每个峰组分,其单位质量的还原能力分别为峰2(P2)>峰1(P1)>峰3(P3)>峰4(P4)。采用Sephadex G-50凝胶分别用蒸馏水和Tris-HCl缓冲液对P1和P2组分继续分离纯化,均能得到2个吸收峰(组分)。     

模拟酸雨与凋落物对柳杉幼苗根际土壤酶活性的影响

为了探讨酸雨和凋落物对柳杉Cryptomeria fortunei林地土壤酶活性的影响,以柳杉幼苗根际土壤为材料,采用酸雨(pH 4.0),凋落物(500 g·m-2)和酸雨与凋落物复合等3种处理,测定了短时间(30 d)和长时间(90 d)处理后土壤氧化还原酶和水解酶活性的变化。结果表明:酸雨和凋落物处理对土壤氧化还原酶活性具有不同的影响,酸雨对土壤硝酸还原酶活性无显著影响,凋落物极显著地提高其酶活性,复合处理极显著地降低其酶活性(P<0.01);3种处理均显著提高了土壤多酚氧化酶活性(P<0.05);复合处理对土壤过氧化物酶活性无显著影响,短时间酸雨和凋落物处理均对其具有抑制作用,长时间处理具有促进作用(P<0.05);凋落物处理对土壤过氧化氢酶活性表现为抑制作用,复合处理对其具有极显著促进作用(P<0.01)。在水解酶中,短时间3种处理和长时间复合处理均对土壤脲酶活性具有极显著促进作用(P<0.01);酸雨、长时间凋落物和复合处理对土壤酸性磷酸酶活性具有显著地抑制作用(P<0.05);酸雨和凋落物处理以及长时间复合处理均使土壤蛋白酶活性降低(P<0.05);长时间酸雨处理对土壤蔗糖酶活性具有显著抑制作用,复合处理和短时间凋落物处理具有促进作用(P<0.05)。酸雨和凋落物复合处理柳杉幼苗根际土壤,显著改变了两者对土壤酶活性的影响,说明酸雨和林地凋落物长时间并存,能够缓解两者对除土壤蛋白酶外其他土壤酶活性的不利影响,有助于改善土壤条件。     

菲律宾蛤仔木瓜蛋白酶水解物抗氧化活性研究

以菲律宾蛤仔蛋白为原料,用木瓜蛋白酶对其进行水解,采用正交实验方法研究酶解温度、酶解时间,加酶量和pH对水解度和抗氧化性的影响;通过检测羟自由基清除率、DPPH自由基清除、超氧阴离子自由基清除率和还原力评价水解物的抗氧化性。结果表明：水解度与抗氧化性之间没有正反相关系,当温度为45℃,时间为6 h,加酶量为1 500μg/g,pH为7.0时,水解度最大;温度为45℃,时间为2 h,加酶量为2 000μg/g,pH为7.0时,水解物的抗氧化活性最强;水解物对羟自由、DPPH自由基和超氧阴离子自由基均有很好的清除作用,并呈现浓度依赖性。因此,菲律宾蛤仔蛋白的木瓜蛋白酶水解物具有很好的抗氧化性。     

不同培养液和温度诱导球孢白僵菌BF菌株产酶特性的研究

分别采用Folin-酚法和DNS法对球孢白僵菌BF菌株在不同培养液、不同温度下产蛋白酶和几丁质酶的活性进行了研究。结果表明,白僵菌在3种不同的培养液中均能产生蛋白酶和几丁质酶。30℃以下时,以明胶培养液中产蛋白酶的活性最高（28℃时为127.09 U）;30℃以上时,以虫尸粉培养液产酶活性最高（35℃时为133.51 U）;球孢白僵菌在胶体几丁质中诱导几丁质酶的效果最好,其中30℃时酶活性最高（2.91 U）;其次为虫尸粉培养液,在28℃时酶活性最高（1.44 U）;细粉几丁质培养液的诱导效果在5个温度下都是最差;温度高于30℃时,这3种培养液诱导的几丁质酶活性都非常低。     

毛霉型豆豉中总DNA提取的比较研究

[目的]对毛霉型豆豉中总DNA的提取方法进行比较。[方法]选用常用的3种DNA提取方法(溶菌酶法、蛋白酶K-CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法和改良溶菌酶法)提取发酵豆豉中的总DNA,并测定总DNA的纯度,比较3种方法的优劣。[结果]通过琼脂糖凝胶电泳对提取效果进行观察比较发现,蛋白酶K-CTAB法提取豆豉中微生物的宏基因组DNA的纯度最好,质量最高。[结论]蛋白酶K-CTAB法更适合豆豉这类发酵食品宏基因组DNA粗提取,可以作为豆豉宏基因组学研究的基础。     

曲霉型豆豉用高产蛋白酶菌种的选育

从曲霉型阳江豆豉曲中筛选出5株菌落形态不同的曲霉(Aspergillus spp.),通过纯种发酵制备豆豉曲,测定了豆豉曲中碱性蛋白酶和中性蛋白酶的活性,从中筛选出1株蛋白酶活性较高的菌种,并对该曲霉进行ITS r DNA序列分析,发现该曲霉与Aspergillus oryzae strain P6B2(JX429926)的同源性最高,故鉴定为米曲霉(Aspergillus oryzae).以该米曲霉为出发菌株,通过紫外线诱变和硫酸二乙酯化学复合诱变处理,选育得到优良高产蛋白酶活性的突变株,其中性蛋白酶酶     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3／4A的研究进展

丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS3共有631个氨基酸组成，具有丝氨酸蛋白酶、三磷酸核苷酶（NTpase）和螺旋酶（Helicase）的功能，在HCV多聚蛋白的成熟和病毒复制过程中发挥着重要作用．非结构蛋白NS4A，其主要功能就是作为NS3丝氨酸蛋白酶的辅助因子，在HCV多氨酸成熟过程中发挥着不可替代的调节作用．此外，NS3／4A还参与NS5A的超磷酸化修饰过程．