实时荧光定量PCR技术在球毛壳ND35定殖检测中的应用

对球毛壳(Chaetomium globosum)ND35菌株的RAPD扩增特异性DNA片段进行分析,利用Prim-er 5.0软件设计了一对引物,即ND35-1:5'-GCTCGCAGCTCTGGTGCGGT-3',ND35-2:5'-GCCGATTGC-CCATGTCCACCTC-3',以球毛壳ND35菌株基因组DNA为模板,利用此引物建立并优化了SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应的最佳体系,并据此对杨树和黄瓜两种植物中ND35菌株的定殖情况进行了检测。结果表明,该引物可以用于球毛壳ND35的实时荧光定量PCR检测。     

利用SCAR-PCR检测杂交油菜"蜀杂9号"的杂种纯度

用两个分别能在“蜀杂9号”父、母本之间稳定产生多态性的随机引物S18和S31,对父、母本DNA样品进行RAPD扩增,将得到的特异标记片段S18750和S31550进行回收、克隆和测序。根据测序结果设计序列特异性扩增(SCAR)引物SZ9SP1和SZ9SP2,将“蜀杂9号”的亲本RAPD标记转化为序列特异的SCAR标记。当用两对引物分别扩增杂种F1代单株总DNA时,能分别获得父、母本特异序列扩增带,表明获得的SCAR标记能可靠地用于“蜀杂9号”杂种纯度的检测。     

小麦条锈菌条中32号生理小种SCAR检测标记的建立

【目的】建立具有应用价值的小麦条锈菌条中32生理小种的SCAR检测标记。【方法】用100条随机引物对我国目前主要流行的12个小麦条锈菌生理小种进行RAPD筛选,寻找特异性片断,并对其进行克隆、测序,将该特异性片段转化成条中32号小种的SCAR专化型标记。设计并合成SCAR特异性引物,对不同来源的条中32号进行SCAR检测。【结果】引物S1271从条中32号生理小种中扩增出长度为320 bp的特异片段,该片段可作为条中32号的SCAR标记。从不同来源的条中32号生理小种中扩增出了筛选到的SCAR标记。【结论】成功建立了条中32专化SCAR标记。     

高番茄红素加工番茄品系的RAPD引物筛选及特异片段的克隆

以加工番茄高茄红素近等基因系为材料,分别从高茄红素含量及低茄红素含量植株中提取DNA构建DNA池,采用RAPD技术,从260个随机引物中筛选出1个在2基因池间具有特异性的引物S636,在轮回亲本及回交后代单株的DNA中进行验证,证明了该引物扩增出的特异性片段是1个与番茄耐高茄红素含量连锁的RAPD标记.经琼脂糖凝胶电泳回收扩增出的特异条带与载体pMD-18T连接,并转入大肠埃希菌DH-5α,对克隆片段测序结果表明其实际大小为827 bp,这为转化成稳定的SCAR标记奠定了基础.     

大白菜杂交种“冠春”特异性SCAR标记的获得及其验证

以获得的春大白菜品种"冠春"的特异性RAPD标记为依据,通过对8个特异片段的回收,克隆测序,采用引物延长法设计了SCAR引物,经过双亲及其杂交一代的鉴定,6个SCAR引物多态性消失,2个SCAR引物扩增出了单一的特异条带,而且SCAR标记的差异与原始的RAPD特异性标记的差异完全相同,为大白菜杂交种"冠春"的品种鉴定和品种保护提供了技术依据。     

燕麦D基因组特异标记开发

为了提高燕麦分子育种的效率,旨在开发燕麦D基因组特异分子标记。先利用300 条10 碱基随机引物对9 种燕麦种材料进行随机多态性扩增(random amplified polymorphic DNA,RAPD),扩增出燕麦D基因组特异性条带,命名为OPAB011287,经Blast 比对后发现该条带为一反转座子重复序列,根据此条带序列设计特异性引物,建立更简便稳定的SCAR标记。结果发现该SCAR标记可以准确特异的检测到9 种试验材料中含有D基因组的燕麦品种,结论表明该标记可用于燕麦分子标记辅助育种,有效服务于燕麦优良品种培育。     

茶树的RAPD标记向SCAR标记转化的研究

SCAR标记是在RAPD技术的基础上发展起来的一种新型分子标记技术,相对其他分子标记,它具有开发成本低,稳定性高,单位点多态等特点,将为茶树分子育种开辟一条新的有效途径。通过将随机引物在不同茶树品种基因组DNA中扩增得到的特异性片段,经回收、克隆、测序后重新设计1对特异性引物,将RAPD标记成功转化成SCAR标记,提高了分子鉴定的稳定性。     

水貂自咬症遗传病因的SCAR分子标记分析

以自咬和健康水貂作为研究对象,利用序列特异性扩增(SCAR)技术对其进行遗传分析,从分子水平探讨水貂自咬症的发病原因。首先从100个随机引物中筛选出10个重复性好的标记引物,对94只水貂群体进行随机扩增DNA(RAPD)标记检测。挑选出在健康组与患病组差异明显的A8引物,其仅可以在患病水貂组中扩增出500 bp左右的DNA片段,而在健康组中没有此特异片段。将该片段克隆、测序,根据测序结果设计特异PCR引物,转化为SCAR标记,回到原样本群体中扩增,验证。结果发现,MA8-500特异性条带在患病水貂群体的分布频率高达86.4%(38/44)以上,而在健康水貂群体中的分布频率仅为4.0%(2/50),因此可将其初步作为区分健康和患病水貂群体的分子遗传标记,为进一步研究水貂自咬症奠定基础。     

甘薯抗茎线虫病基因SCAR标记辅助育种初探

用已获得的与抗甘薯茎线虫病基因连锁的RAPD标记OPD01-700引物对高抗亲本徐781和高感亲本徐薯18的F1分离群体的161个品系进行PCR扩增.根据该标记扩增结果,利用Mapmaker3.0软件计算遗传距离,得出此标记与甘薯茎线虫病基因的连锁距离为19.4 cM.对RAPD标记OPD01-700片段进行克隆、测序,得到长度为689 bp的DNA序列,将该序列命名为OPD689.根据测序结果,设计1对特异引物,进行特异性扩增,成功地将OPD689标记转化为SCAR标记.将SCAR标记在7个高抗品系和13个高感品系进行初步验证应用,其结果与田间鉴定结果基本一致.初步建立了甘薯抗茎线虫病育种分子标记辅助选择技术.     

菠菜性别相关的ISSR标记

菠菜为雌雄异株植物,用CTAB法提取其雌、雄株成株幼嫩叶片DNA,分别构建雌、雄株DNA池,以之为模板,用已优化的ISSR体系扩增,在74条ISSR引物中,I62扩增出一条约1 200bp雌性连锁标记,回收纯化该特异扩增片段,将其连接于pUCm-T载体,转化进大肠杆菌JM109菌株,并检测及测序。回收克隆和测序后发现该片段全长1 176bp,富含AT,AT占57.0%。根据测序结果设计1对25bp的特异引物将这个雌性连锁的ISSR标记转化为稳定性和特异性更好的SCAR标记。该特异引物对随机选取的雌雄菠菜单株进行PCR扩增,在雌株中均有1 176bp的特异条带,而雄株中均无。此特异条带的获得为菠菜性别相关基因的克隆奠定基础。     

稻蝗属特异性SCAR分子标记的鉴定

【目的】研究稻蝗属特异性DNA分子标记,为稻蝗属物种的分类鉴定提供快速有效的分子检测方法。【方法】基于稻蝗属物种及其近缘属种的大量RAPD-PCR结果,筛选出稻蝗属物种特异性的RAPD条带,对该特异RAPD条带进行克隆、测序。基于所测序列设计特异引物,以稻蝗属不同物种和蝗总科其它物种基因组DNA为模板进行PCR扩增。【结果】随机引物S823可在稻蝗属不同物种扩增出约650bp的RAPD条带,经对该条带的克隆、测序,发现在3个受试的稻蝗属物种中序列同源度达92.3%—96.6%,序列G+C含量大于15%,并富含大量的A、T重复区;基于已知序列设计的特异引物对稻蝗属7个物种可以扩增出目的条带(550bp),而对赤胫伪稻蝗及蝗总科其它物种均无扩增条带。【结论】鉴定了稻蝗属特异的RAPD条带,基于该条带序列设计的特异引物可用于稻蝗属物种的快速分子鉴定。     

与棉花无蜜腺基因紧密连锁SSR标记的筛选及SCAR标记的转化

以无蜜腺棉(97014)xTM-1的正、反交后代F1、F2群体为试验材料,采用SSR标记技术,结合集群分类分析法(BSA)进行了棉花无蜜腺性状基因分子标记的筛选.通过对203对SSR引物的筛选,获得1个与蜜腺性状基因紧密连锁的SSR标记BNL1673,连锁距离为1.33 cM.对该标记片段进行序列测定,根据序列特点设计...     

燕麦C基因组反转录转座子分离与特异性标记的建立

燕麦属是禾本科中重要的属,其中,栽培燕麦是一种营养价值很高的粮、经、饲、药多用途作物,而野生物种中则含有多种优良农艺性状基因,是遗传改良的重要资源。基因组和染色体特异性的分子标记是分子育种工作的重要工具,以燕麦属不同倍性和基因组物种为材料,利用300条随机引物(random amplified polymorphic DNA,RAPD),从燕麦C基因组中筛选到一条基因组特异性序列OPR51655;比对和原位杂交发现,OPR51655为一Ty1-copia型反转录转座子重复序列,其同源序列分布于除端部和着丝粒外的整个染色体臂上;根据OPR51655建立了燕麦C基因组特异性(sequence-characterized amplified region,SCAR)标记,利用该标记能有效地检测燕麦栽培种和野生种中的C基因组染色质。     

球毛壳ND35对植物生长的影响及其生防效果初探

［目的］研究球毛壳DN35对植物生长的影响及其生防效果,为该菌的推广应用提供依据。［方法］以植物内生真菌球毛壳（Chaetomiumglobosum）ND35为供试菌株,在温室和大田条件下测定其对植物生长的影响及其对5种植物病害的防治效果。［结果］ND35对杨树侧根和胸径生长有一定的促进作用。接种ND35能诱导杨树对腐烂病菌和叶锈病菌产生抗性;也能诱导番茄和菜豆对灰霉病菌产生系统抗病性;还可有效防治菜豆立枯病。［结论］内生真菌球毛壳ND35引起的诱导系统抗病性在植物病害的生物防治中有重要作用。     

球毛壳ND35对植物生长的影响及其生防效果

[目的]研究球毛壳ND35对植物生长的影响及其生防效果,为该菌的推广应用提供依据。[方法]以植物内生真菌球毛壳ND35为供试菌株,病原菌有杨树腐烂病菌、立枯丝核菌、番茄灰霉菌。（a）调查球毛壳ND35对植物生长的影响。在扦插杨树枝条时,设2个处理：①接种10g长有球毛壳ND35的麦粒培养基;②接种10g无球毛壳ND35的麦粒培养基为对照。出芽后,测量杨树高度、1．3m处的胸径,同时调查侧根（d≥8mm）数量。（b）大田试验测定球毛壳ND35对杨树腐烂病的拮抗作用。采用烫伤接种的方法,在主干距地面高50cm和100cm（约树干的1／3和2／3）处先用火烫伤树皮,再接种含病原菌菌丝体的PDA菌饼。在随后的1个多月统计发病情况,以29d后发病的为0级,26～28d发病的为1级,23～25d发病的为2级,20～22d发病的为3级,19d之内发病的为4级。分级计数,计算发病率、病情指数和拮抗效果。（c）大田试验调查球毛壳ND35对杨树叶锈病的拮抗作用。在杨树1．3、1．7、2．1m处分别调查2个处理组杨树叶片正面（冬孢子堆）及背面（夏孢子堆）的发病情况,在发病杨树上,根据同一高度叶正面和叶背面的病斑面积占叶片总面积的比例确定分级标准：没有发病为0级、0～20％为1级、20％～40％为2级、40％～60％为3级、〉60％为4级。计算发病率、病情指数和拮抗效果。（d）温室试验测定球毛壳ND35对灰霉病的诱导抗病作用。将菜豆、番茄分别分为2个处理：①接种拮抗菌ND35;②不接种ND35。分别测量病斑长短直径,计算病斑面积。（e）温室测定ND35对菜豆立枯病的防治效果。处理组：播种时接种内生菌球毛壳ND35,同时接种立枯丝核菌;对照组：播种时只接种立枯丝核菌。在接种10d后观察发病情况,根据病斑直径占茎基周长的比例确定分级标准：没有发病的植株为0级,〈25％为1级、25％～50％为2级、50％～75％为3级、〉75％为4级。计算病情指数和防治效果。[结果]球毛壳ND35在植物体内定殖后能促进杨树根系和胸径的生长,使植株粗壮,有利于提高植物的抗病性;接种球毛壳ND35能诱导杨树对腐烂病菌和叶锈病菌产生较好的拮抗效果;也能够诱导番茄和菜豆对灰霉病菌产生抗病性,诱导抗性效果分别达58．85％和35．65％;还可有效防治菜豆立枯病,防治效果达50．9％。[结论]内生真菌球毛壳ND35引起的诱导系统抗病性在植物病害的生物防治中有重要作用。     

金针菇子实体颜色基因的分子标记

用群体分离分析法从200个随机引物中筛选出S375,其扩增片段与金针菇子实体白色基因连锁.对S375扩增片段两端测序,以该序列为依据合成一对特征序列扩增区域(SCAR)引物,它能对带有白色基因的菌株扩增出单一片段,多聚酶链反应(PCR)产物不需电泳、加EB后可在紫外灯下直接检测.     

内生真菌球毛壳ND35对植物抗病性及防御酶活性的影响

以植物内生真菌球毛壳菌ND35菌株和病原真菌立枯丝核菌Rs-1菌株及毛白杨树组培苗为试材,分析检测了接种球毛壳菌后立枯丝核菌侵染杨树组培苗的发病情况和4种不同处理的植物产生过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性变化。结果表明:与对照相比接种球毛壳菌后的植物在一定程度上能够阻止立枯丝核菌的扩展,发病率和病情指数均有所降低,明显提高植物POD、PPO和PAL的酶活性。说明接种球毛壳菌后诱导植物产生的3种防御酶对提高植物抗病性有一定的影响。     

天敌对烟粉虱捕食作用的SCAR标记检测

 以烟粉虱和捕食性天敌为研究对象，采用特征序列扩增区域（SCAR）标记法，通过对目的片段的克隆与测序设计烟粉虱特征片段扩增引物，检验该引物的种、虫态及性别特异性，并利用该引物检测捕食性天敌对棉田烟粉虱的捕食作用。研究结果表明，利用SCAR标记法获得了长度为347 bp的烟粉虱特异性片段（GenBank登录号为AY841800），根据此片段的碱基序列设计烟粉虱特异引物1对TB-F/TB-R 94585, 其扩增片段约为240 bp；种特异性检验结果表明，该引物只对烟粉虱具有扩增能力，对温室粉虱及其它相关种类不具有扩增效果；同时该引物对不同虫态、不同性别的烟粉虱具有同样的扩增效应。田间检测结果表明，同种天敌昆虫幼体捕食作用检出率高于成虫；在所检测的4类群9种捕食性天敌中，龟纹瓢虫幼虫、异色瓢虫幼虫、草蛉幼虫及东亚小花蝽成虫和蜘蛛对烟粉虱捕食作用的检出率高于50%。