大麻性别相关AFLP分子标记筛选

利用扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)分子标记,用8个EcoRⅠ-NNN和8个MseⅠ-NNN组成64对引物,对大麻10个品种混合组成的雌性、雄性植株基因池进行筛选,并将筛选到的引物在此10个品种中进行验证,引物E-ACT/M-CTA在10个品种的雄株中均扩增出1条特异条带,雌株中均没有此带,对此引物扩增得到的特异性条带回收、克隆、测序,获得1条大小为348 bp的雄性特异性条带,得到的序列进行GenBank序列比对,数据库中没有与此特异条带同源的序列.该条特异条带可作为分子遗传标记用于大麻早期性别鉴定的参考.     

大麻性别相关AFLP分子标记筛选

利用扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)分子标记,用8个EcoRⅠ-NNN和8个MseⅠ-NNN组成64对引物,对大麻10个品种混合组成的雌性、雄性植株基因池进行筛选,并将筛选到的引物在此10个品种中进行验证,引物E-ACT/M-CTA在10个品种的雄株中均扩增出1条特异条带,雌株中均没有此带,对此引物扩增得到的特异性条带回收、克隆、测序,获得1条大小为348bp的雄性特异性条带,得到的序列进行GenBank序列比对,数据库中没有与此特异条带同源的序列.该条特异条带可作为分子遗传标记用于大麻早期性别鉴定的参考.     

菠菜性别相关的RAPD标记

菠菜为雌雄异株植物,用CTAB法提取其雌雄成株幼嫩叶片总DNA分别构建雌、雄株的DNA池,以之为模板,用已优化的RAPD体系扩增,在160条随机引物(10 bp)和40个引物对中筛选出44个扩增效果较好的单引物,再从中进行进一步筛选.研究发现,引物S1497扩增出1条雄性特异性条带,检测发现该条带只在雄株DNA池中出现.回收纯化该特异扩增片段,将其连接于pUCm-T载体,转化进大肠杆菌JM109菌株,并进行检测及测序.测序结果显示,该片段全长1 978 bp,该特异条带的获得为菠菜性别相关基因的克隆奠定了基础.     

西瓜炭疽病菌Colletetrichum orbiculare的分子检测

【研究目的】探索西瓜炭疽病菌(Colletetrichum orbiculare )的分子检测技术，为西瓜、甜瓜等生长期和采后炭疽病的快速、准确鉴定和检测提供技术和方法。【采用的主要方法和研究结果】根据GeneBank中Colletetrichum属的24个种的ITS系列，比较设计出一对引物CY1/CY2，可以特异的从西瓜炭疽病菌C. orbiculare和菜豆炭疽病菌C. lindemuthianum菌株中扩增到一条442bp的条带，将这两个种的炭疽菌和其它菌分开。进一步利用RAPD随机引物扩增C. orbiculare和C. lindemuthianum，找出在C. orbiculare中的特异性条带，经过克隆、测序后，设计出一对SCAR引物RB/RC，可以特异的在C. orbiculare中扩增出一条216bp的条带，将C. orbiculare和C.lindemuthianum分开。采用两对引物组成双重PCR，能够将C. orbiculare和其它相关和近似菌株分开。【主要结论】利用上述两对引物组成双重PCR检测体系，可以快速鉴定C. orbiculare，并且能够直接在植物组织中将西瓜炭疽病菌C. orbiculare检测出来，灵敏度可以达到1pg/μl。     

四川不同地区慈竹的遗传多样性研究

【目的】比较四川不同地区慈竹的遗传多样性,为其遗传改良研究提供理论依据。【方法】以四川具有代表性的12个地区慈竹为材料,选取29条随机扩增多态性DNA标记(RAPD)和12条简单序列重复区间标记(IS-SR)引物,利用RAPD和ISSR技术,对慈竹的遗传多样性进行研究,并对扩增的特异性条带进行克隆分析。【结果】筛选出14个RAPD引物,扩增出168条条带,其中142条具有多态性,多态率高达84.52%;筛选出8个ISSR引物,扩增出73条条带,其中56条具有多态性,多态率为76.71%。慈竹RAPD和ISSR遗传距离分别为0.140 4~0.570 1和0.071 0~0.706 9。引物OPAA-04从眉山青神慈竹(C-MSQS)中可扩增出长度为570 bp的特异性条带,与细胞色素c氧化酶Ⅰ亚基相关。【结论】四川不同地区慈竹资源具有较高的遗传多样性。     

小麦抗叶锈基因Lr45的SCAR标记

 【目的】建立小麦抗叶锈基因Lr45 SCAR（sequenced characterized amplified region序列特征扩增区域）标记。【方法】以小麦抗叶锈病基因材料TcLr45和感病材料Thatcher为亲本,利用黑麦基因组特异的RAPD标记引物OPH20进行PCR扩增,对获得的与预期大小相同的1.5kb的特异片段进行克隆测序,并根据该序列设计一对特异PCR引物LRYR和LRYF,对TcLr45×Thatcher F2代单株构建的分离群体进行扩增,验证该标记与Lr45的连锁关系,Mapmaker 3.0软件绘制遗传连锁图。【结果】该标记在TcLr45中扩增出单一条带,片段大小为1 272 bp（命名为Ypsc20H1272）,而在感病亲本中则无扩增条带。F2代分离群体进行连锁分析,遗传距离为8.2 cM,该标记为与Lr45连锁的SCAR标记。【结论】将Lr45的RAPD标记转化成SCAR标记。     

辣椒细胞质雄性不育相关线粒体基因片段的克隆及序列分析

【目的】探究3种不同类型辣椒细胞质雄性不育材料的不育分子机理,寻找与雄性不育相关的基因。【方法】采用高盐-蛋白酶K法提取辣椒细胞质雄性不育系及其保持系的绿色叶片线粒体DNA(mtDNA),根据已报道的辣椒细胞质雄性不育相关基因orf456序列设计特异引物,利用PCR反应,从3种不同类型辣椒细胞质雄性不育材料线粒体基因组中均扩增出330 bp左右大小的条带。【结果】经克隆测序及序列分析表明,3种不同类型辣椒细胞质雄性不育材料所获片段序列完全一致,大小为330 bp,命名为CMS330,与orf456核酸序列同源性达99%。【结论】3种不同类型辣椒细胞质雄性不育材料具有相似的不育分子机理。     

燕麦D基因组特异标记开发

为了提高燕麦分子育种的效率,旨在开发燕麦D基因组特异分子标记。先利用300 条10 碱基随机引物对9 种燕麦种材料进行随机多态性扩增(random amplified polymorphic DNA,RAPD),扩增出燕麦D基因组特异性条带,命名为OPAB011287,经Blast 比对后发现该条带为一反转座子重复序列,根据此条带序列设计特异性引物,建立更简便稳定的SCAR标记。结果发现该SCAR标记可以准确特异的检测到9 种试验材料中含有D基因组的燕麦品种,结论表明该标记可用于燕麦分子标记辅助育种,有效服务于燕麦优良品种培育。     

草菇菌种退化相关分子标记的筛选

【目的】基于SRAP分子标记技术,筛选出与草菇(Volvariella volvacea)菌丝退化性状紧密连锁的分子标记,为进一步研究目标性状基因的克隆与功能奠定基础。【方法】以草菇正常生长菌株V51(对照)与其菌丝退化菌株(VNM1~10)为材料,采用群体分离分析法分别构建2种草菇的近等基因池。利用SRAP分子标记技术,寻找两类菌株的差异片段,回收差异片段后与pMD-18T载体连接,构建重组质粒pMD-VNMDF并转化E.coli DH5α感受态细胞,将筛选的阳性克隆测序。根据差异片段序列设计引物,将其转化成SCAR分子标记,并对草菇正常菌株V51及其菌丝退化菌株VNM进行扩增试验,验证该标记的真实性和可靠性。【结果】81对SRAP引物组合中有2对引物可扩增出稳定差异条带,其中引物对Me8-Em4PCR扩增出长度约300bp的差异条带(命名为VNMDF)存在于退化菌株中。对SRAP分子标记片段VNMDF回收、测序并进行序列分析发现,该片段长度为279bp,其核酸、氨基酸序列与编码26S蛋白酶体亚基的相似性分别达到81%和93%。利用SCAR特异引物对SCAR250可在菌丝退化菌株中稳定扩增出长度约250bp片段,与预期大小(279bp)一致,而在正常菌株中未扩增出此片段。【结论】获得了1条可能与草菇菌丝退化性状基因紧密连锁的SRAP分子标记,并将其成功转化为SCAR标记(SCAR250)。     

基于转录组测序的花椒属物种EST-SSR标记开发

【目的】开发适用于花椒(Zanthoxylum bungeanum)和竹叶花椒(Zanthoxylum armatum)的EST-SSR引物,为花椒属物种的鉴定及遗传多样性探究提供分子标记。【方法】对花椒和竹叶花椒分别进行转录组测序(RNA-seq),基于得到的EST序列开发SSR引物。在2种花椒的EST-SSR引物中分别随机挑选60对引物,用12份材料(4份花椒和8份竹叶花椒)为样本,利用琼脂糖凝胶电泳验证其特异性。从有特异性条带的引物中,再随机选取花椒和竹叶花椒SSR引物各15对,选取6个(2份花椒和4份竹叶花椒)样本,利用聚丙烯酰胺银染电泳进行多态性检测。【结果】花椒共有64 944条Unigene,碱基对长度共54 073 890bp,含有12 746个SSR位点,分布在10 595条Unigene上,SSR位点出现频率为19.63%,平均分布距离4.24kb。竹叶花椒Unigene共75 669条,碱基对长度58 975 053bp,共15 096个SSR位点,分布在12 612条Unigene上。SSR位点出现频率为19.95%,平均分布距离为3.91kb。60对花椒引物中,有46对成功扩增出特异性条带,扩增效率76.67%;60对竹叶花椒引物中,有41对扩增出特异性条带,扩增效率68.33%。花椒和竹叶花椒的特异性条带大小在100～300bp,主要集中在150～250bp。多态性验证试验中,15对花椒引物中有12对产生了多态性条带,多态率80.00%;15对竹叶花椒引物中则有14对产生了多态性条带,多态率93.33%。【结论】基于花椒和竹叶花椒转录组高通量测序结果开发的EST-SSR分子标记引物,具有较明显的特异性和多态性。     

对辣椒抗性基因Me3表现毒性的南方根结线虫 群体的SCAR分子标记

【目的】研究南方根结线虫（Meloidogyne incognita）Me3毒性变异群体的分子标记,用快速有效的分子方法来鉴定毒性变异的发生。【方法】以南方根结线虫的无毒群体以及抗性基因Me3毒性群体为材料,用根据南方根结线虫基因组设计的100对引物和19对来自文献的引物进行扩增,筛选出在3个种群中扩增的差异条带,设计SCAR引物,并建立多重PCR反应体系。【结果】得到了7对能在3个群体稳定扩增出差异条带的多态性引物,把其中的2个位点开发为SCAR标记,能够区分开3个线虫群体。多重PCR反应体系在无毒群体和Me3毒性群体中分别扩增出1条999 bp和1条629 bp的条带,在混合群体扩增出999和629 bp的2条带。【结论】成功开发了对Me3表现毒性的南方根结线虫变异群体的分子标记,可用多重PCR体系一次性鉴定Me3毒性变异的发生。     

我国黄淮麦区10个短体线虫样品种类的分子鉴定

【目的】短体线虫(Pratylenchus spp.)是植物根系内迁移性寄生线虫,可引起许多作物的根腐线虫病,给世界农业生产造成了极大的危害。为明确我国黄淮麦区与禾谷孢囊线虫复合侵染小麦的短体线虫种类,本研究对采自黄淮4省麦区的10个短体线虫样品进行种类的分子鉴定,分析种群系统进化关系及种内遗传变异,以期为我国小麦根部线虫病害的综合防治提供指导。【方法】对采自江苏、安徽、河南和山东4省小麦孢囊线虫发病田中的10个小麦短体线虫样品进行线虫分离,从各样品中随机挑取5条短体线虫,分别提取单条线虫DNA,扩增r DNA 18S片段并进行测序比对,选取序列有代表性的2个DNA样本进一步扩增其r DNA 28S D2-D3区以及mt DNA-COI基因片段,经序列比对分析后,利用MEGA4.0软件采用邻接法分别构建基于r DNA 18S、28S D2-D3和mt DNA-COI序列的系统进化树,通过聚类关系及相似度分析确定线虫种类,同时利用种特异性引物进行验证。【结果】扩增挑取的50条短体线虫的r DNA 18S区片段,测序得到片段长度在857—935 bp,BLAST比对分析揭示部分样品可能为短体线虫的混合种群;进一步测定的20个代表性DNA样本的r DNA 28S D2-D3区和mt DNA-COI基因的片段长度分别在771—784 bp和415—417 bp;系统进化树以及相似度分析揭示我国黄淮流域4省麦区10个短体线虫样品中有咖啡短体线虫(P.coffeae)、落选短体线虫(P.neglectus)和斯克里布纳短体线虫(P.scribneri),其中,江苏沛县样品JS2和山东潍坊样品SD1是落选短体线虫单一侵染样品,河南永城样品HN2和安徽淮北样品AH3是咖啡短体线虫单一侵染样品,安徽萧县样品AH2、AH5和淮北样品AH4以及河南永城样品HN1和HN3均为落选短体线虫和咖啡短体线虫的混合侵染样品,江苏徐州样品JS1是落选短体线虫和斯克里布纳短体线虫的混合侵染样品。用SCAR特异性引物扩增20个短体线虫单条DNA样本,结果显示,用落选短体线虫特异性引物PNEG-F1/D3B5能够从JS1-2、JS2-1、JS2-2、AH2-2、AH4-1、AH5-1、HN1-2、HN3-2、SD1-1和SD1-2等10个样本中扩增出140 bp的单一条带,用咖啡短体线虫引物PC1/PC2能够从AH2-1、AH3-1、AH3-2、AH4-2、AH5-2、HN1-1、HN2-1、HN2-2和HN3-1等9个样本中扩增出630 bp的单一条带,用斯克里布纳短体线虫引物Ps F7/Ps R7从JS1-1中扩增出130bp的单一条带,种类鉴定结果与上述序列分析结果相一致。【结论】我国黄淮流域4省小麦孢囊线虫发病田中的短体线虫种类有咖啡短体线虫、落选短体线虫和斯克里布纳短体线虫,其中落选短体线虫是优势种,证实了短体线虫不同种群复合侵染小麦的现象较为普遍。基于mt DNA-COI基因构建的系统进化树可以有效区分短体线虫的近缘种,相比r DNA 18S和28S基因更适于作为短体线虫种类鉴定的分子靶标。     

基于SCAR标记的小麦禾谷孢囊线虫快速分子检测技术

【目的】建立从禾谷孢囊线虫及其近缘种的混合群体中检测禾谷孢囊线虫的快速分子检测方法。【方法】使用随机扩增多态性DNA（RAPD）和特征序列扩增区域（SCAR）标记的方法,运用PCR技术进行特异性检测。【结果】用本研究建立的SCAR标记快速分子检测体系对9种32个线虫种群进行检测,能够直接从混合线虫样品中检测出禾谷孢囊线虫。该检测方法对禾谷孢囊线虫的孢囊、2龄幼虫具有扩增能力,最低检出阈值为1/2000个孢囊,1/80头2龄幼虫。【结论】本研究设计的SCAR标记快速分子检测体系能够从禾谷孢囊线虫及其近缘种的混合种群中快速检测出禾谷孢囊线虫,且检测准确、灵敏度高。     

海岛棉抗枯萎病性状与 SSR标记的关联分析

【目的】运用SSR( Simple sequence repeat) 分子标记关联分析204份海岛棉种质资源的抗枯萎病性状,为抗枯萎病棉花育种材料的利用、分子标记辅助选择提供参考。【方法】采用前期实验室研究的抗病基因序列,设计出40对SSR分子标记,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测筛选标记引物特异性,并鉴定204份海岛棉种质资源。【结果】(1)从40对引物中筛选出6对引物具有多态性,多次重复后选用CHS-04和CHS-05两个分子标记,均来自类黄酮代谢途径;(2)引物CHS-04扩增条带与群体抗病性一致率介于41.67%~52.94%,平均值为46.67%;引物CHS-05扩增条带与群体材料一致率介于30.39%~54.68%,平均值为35.78%。【结论】引物CHS-04和CHS-05可以作为海岛棉枯萎病抗性的分子标记鉴定指标。     

基于线粒体DNA-COI序列的禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫双重PCR检测

【目的】设计禾谷孢囊线虫（Heterodera avenae）和菲利普孢囊线虫（Heterodera filipjevi）特异性引物,建立同步快速检测这两种线虫的双重PCR体系,为中国小麦孢囊线虫（cereal cyst nematodes,CCN）的田间快速诊断与综合治理提供技术支持。【方法】通过比对分析10种植物寄生线虫24个群体的线粒体DNA（mtDNA）COI序列,分别设计并筛选禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫的上游特异性引物HaF8和HfF9,以及下游通用引物HafR8;通过引物浓度比和退火温度的优化,建立针对这两种CCN的双重PCR检测体系;利用该体系对中国黄淮麦区部分CCN样品进行种类鉴定。【结果】筛选并获得的特异性引物HaF8/HafR8及HfF9/HafR8,可在一步PCR反应中实现对禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫的特异性检测。引物HaF8/HafR8对禾谷孢囊线虫的特异性扩增产物为200 bp,而HfF9/HafR8对菲利普孢囊线虫的特异性扩增产物为320 bp,条带区分较明显。对双重PCR检测体系的优化发现,引物HaF8、HfF9、HafR8的退火温度为58℃时,该检测体系具有较高的特异性和扩增效率;引物HaF8﹕HfF9﹕HafR8浓度比为0.24﹕0.16﹕0.4 μ·L^-1时,该检测体系能从不同供试线虫中同时特异性地检测出禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫,且扩增效率较高。该检测体系对禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫单孢囊的检测灵敏度为1/2 000 000个孢囊,而对2龄幼虫的检测灵敏度则分别为1/640条线虫和1/1 280条线虫。对采集自中国黄淮麦区CCN病田的14份土样进行双重PCR检测,发现有8个样本只扩增出200 bp的条带,表明这些样本的CCN种类为禾谷孢囊线虫,有4个样本只扩增出320 bp的条带,表明CCN种类为菲利普孢囊线虫,2个样本同时扩增出200和320 bp两个条带,表明样品为禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫的混合发生。以上结果表明,该检测体系可以成功用于两种小麦孢囊线虫田间复合侵染情况的快速诊断。【结论】基于mtDNA-COI序列开发的特异性引物以及建立的双重PCR检测体系,可用于禾谷孢囊线虫和菲利普孢囊线虫田间单一和混合发生样本的同步快速检测。     

利用SCAR分子标记鉴别香菇双单杂交后代

目的】利用SCAR分子标记鉴别香菇双单杂交后代,为香菇分子辅助育种提供技术支撑。【方法】通过ISSR分析获得标识供体亲本菌株YX7两个细胞核的特异性条带,根据特异性条带序列设计SCAR引物,对菌株YX7为供体和菌株808孢子单核体为受体杂交获得的40个杂交菌株进行SCAR-PCR鉴别,并采用传统镜检和拮抗测试方法进行验证。【结果】筛选出分别标识供体菌株YX7两个细胞核核型的特异性条带a和b,据此设计的SCAR引物PA和PB分别对供体菌株YX7的2个不同细胞核具有特异性扩增作用。SCAR-PCR鉴定结果显示,40个待测菌株中,27个菌株为杂合子,其中19个菌株具有a条带标识核型,8个菌株具有b条带标识核型;13个菌株为非杂合子,其中11个菌株同时具有条带a和b标识的两个核型,是菌株YX7本身,另外2个菌株两种核型均未被检测出,属于菌株808的孢子单核体。传统方法验证结果与SCAR分子标记鉴定结果完全一致。与传统方法相比,SCAR标记方法更简便高效、结果更稳定可靠,并可通过核型标识进一步将杂合子分为两组。【结论】SCAR分子标记能高效、全面和精准鉴别香菇双单杂交菌株的杂合子和非杂合子,可应用于香菇杂交分子辅助育种和遗传分析。     

双重PCR技术检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌方法的建立

 【目的】利用双重PCR技术快速检测马铃薯环腐病菌（Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus）和黑胫病菌（Pectobacterium atroseptica）。【方法】根据GenBank上发表的马铃薯环腐病菌pCS1质粒上纤维素酶A基因序列,对比近缘种及马铃薯上几种重要病原菌的核苷酸序列,设计并合成了1对特异性引物CMS1/CMS2,将设计的引物与已发表的PCR检测马铃薯黑胫病菌特异性引物ECA1f/ECA2r结合,经过条件优化后,建立了双重PCR体系。【结果】利用引物CMS1/CMS2扩增出了1条913 bp的马铃薯环腐病菌特异性条带。检测灵敏度在DNA水平上达100 fg•μL-1,在细菌数上达105 CFU•mL-1。利用双重PCR体系对马铃薯环腐病菌和黑胫病菌进行扩增,可获得913和690 bp的2条特异性条带。检测灵敏度在DNA水平上达600 fg•μL-1,在细菌数上达5×105 CFU•mL-1。【结论】成功建立了双重PCR检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌技术体系,该技术能够同时快速可靠地检测出马铃薯环腐病菌和黑胫病菌。     

大豆疫霉基因组SSR标记开发

 【目的】开发大豆疫霉基因组SSR标记,为从分子水平深入研究大豆疫霉及其近缘种提供一种理想的分子标记。【方法】用FPCR软件从大豆疫霉全基因组序列中查询SSRs,选择合适的SSR序列用Primer5.0软件设计引物。【结果】从发现的1 234个含有2～4个碱基重复单元的完全SSRs中选出260段设计引物,经10个大豆疫霉分离物基因组DNA检测,有213对(81.9%)扩增出SSR特征条带,其中114(53.5%)对引物扩增出多态性。通用性检测表明,14.6%～28.6%引物分别在选择的8个疫霉种中有效扩增。基于10个SSR标记数据进行聚类分析,结果表明表明这些标记可以完全区分大豆疫霉及其它疫霉。【结论】大豆疫霉基因组SSR标记具有高多态性,是大豆疫霉遗传变异、遗传多样性、及遗传图谱构建等研究理想工具。部分大豆疫霉基因组SSR标记在其近缘种中具有通用性,可以用于疫霉菌的系统进化、鉴定、区分及开发近源种的SSR标记。特别开发的SSR标记,在大豆疫霉基因组中具有准确的位置,将极大地方便大豆疫霉菌功能基因的定位和克隆,以及进行疫霉菌的比较基因组的研究。     

生防真菌球毛壳ND35的RAPD特异序列的标记转换

利用随机扩增多态性DNA（RAPD）方法对包括球毛壳ND35在内的20个真菌分离物进行分析,筛选出球毛壳ND35的RAPD扩增特异性DNA片段,经pEASY—T3载体克隆和测序、Seqman整合后,用Primer5．0软件设计了球毛壳ND35的特异引物对CgND35—1：GTTGCCAGCCCGAGGGGAAG,CgND35—2：G111ACCAGCCATGCCTTGAAG,经优化PCR条件,成功获得球毛壳ND35的SCAR标记,该标记片段长度为329bp。用CgND35—1／CgND35—2引物对进行了SCAR标记特异性和灵敏度检测,表明该特异引物可用于球毛壳ND35的快速检测。