基于转录组测序的花椒属物种EST-SSR标记开发

【目的】开发适用于花椒（Zanthoxylum bungeanum）和竹叶花椒（Zanthoxylum armatum）的EST-SSR引物，为花椒属物种的鉴定及遗传多样性探究提供分子标记。【方法】对花椒和竹叶花椒分别进行转录组测序(RNA-seq)，基于得到的EST序列开发SSR引物。在2种花椒的EST-SSR引物中分别随机挑选60对引物，用12份材料（4份花椒和8份竹叶花椒）为样本，利用琼脂糖凝胶电泳验证其特异性。从有特异性条带的引物中，再随机选取花椒和竹叶花椒SSR引物各15对，选取6个（2份花椒和4份竹叶花椒）样本，利用聚丙烯酰胺银染电泳进行多态性检测。【结果】花椒共有64 944条Unigene，碱基对长度共54 073 890 bp，含有12 746个SSR位点，分布在10 595条Unigene上，SSR位点出现频率为19.63%，平均分布距离4.24 kb。竹叶花椒Unigene共75 669条，碱基对长度58 975 053 bp，共15 096个SSR位点，分布在12 612条Unigene上。SSR位点出现频率为19.95%，平均分布距离为3.91 kb。60对花椒引物中，有46对成功扩增出特异性条带，扩增效率76.67%；60对竹叶花椒引物中，有41对扩增出特异性条带，扩增效率68.33%。花椒和竹叶花椒的特异性条带大小在100~300 bp，主要集中在150~250 bp。多态性验证试验中，15对花椒引物中有12对产生了多态性条带，多态率80.00%；15对竹叶花椒引物中则有14对产生了多态性条带，多态率93.33%。【结论】基于花椒和竹叶花椒转录组高通量测序结果开发的EST-SSR分子标记引物，具有较明显的特异性和多态性。     

花椒cpSSR标记开发及在种间、种内的通用性分析

叶绿体基因组为母系遗传,保守性高,因此叶绿体基因组中的简单序列重复（SSR）标记可在更高分类水平上进行种质资源鉴定和群体遗传结构分析。利用TRF软件和SSR Hunter软件相结合对花椒Zanthoxylum bungeanum叶绿体基因组中的SSR位点进行筛选。结果显示:花椒叶绿体基因组中共有144个SSR位点,位点间的平均分布距离为1 100.00 bp。基于检测软件设置参数,SSR重复类型主要集中在一、三核苷酸重复,二者占SSR位点总数的91.67%。此外,随机设计合成30对SSR引物对10份花椒种质、5份竹叶花椒Zanthoxylum armatum种质和1份日本花椒Zanthoxylum piperitum种质进行PCR扩增检测,共筛选出10对多态性引物,其中单核苷酸重复位点的多态性高于多核苷酸重复位点。本研究开发的叶绿体SSR标记可有效区分花椒、竹叶花椒和日本花椒,但在花椒种内并未检测出多态性。表明花椒叶绿体基因组的SSR标记可用于花椒属Zanthoxylum不同种间的遗传多样性分析。     

荔枝EST资源的SSR信息分析及EST-SSR标记开发

 【目的】明确荔枝EST序列中SSR的总体特点,开发荔枝EST-SSR引物,为利用EST-SSR分子标记进行荔枝种质资源遗传多样性、连锁图谱构建及亲缘关系研究奠定基础。【方法】应用SSRIT软件,按照设定标准从自行构建的一个荔枝果皮发育关键期的cDNA文库中的1 331条Unigene（惟一序列）中搜索SSR位点。利用软件Primer primer5.0设计EST-SSR引物。选用16份表型差异较大的荔枝种质资源检测引物的有效性及多态性,利用聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)进行片段分离。【结果】荔枝的1 331条EST序列中共搜索出220个SSR位点,分布于189条EST中,出现频率是16.53%。这些EST-SSR的平均长度为18.43 bp,平均分布频率1/4.42 kb。在1—6 bp的重复基元中,二核苷酸和三核苷酸重复类型占主导地位,共占总SSR的69.09%,二者出现的频率分别为37.27%和31.82%。共观察到72种重复基元,出现频率最高的是GA/TC（16.82%）;其次是AG/CT、A/T、AT/TA及GAA/TTC,频率分别为14.55%、11.82%、5.00%和3.64%。不同核苷酸数目的重复基元的重复次数差异很大。设计、合成150对EST-SSR引物,122对（81.33%）引物在荔枝中获得有效扩增,100对引物具有多态性。【结论】荔枝EST资源中含有高频率的SSR位点,且EST-SSR 标记开发效率较高。本研究为利用EST-SSR标记开展荔枝遗传研究提供了100 对EST-SSR引物,并为进一步开发荔枝EST-SSR标记提供了含SSR位点的候选序列。     

花椰菜转录组SSR位点分析及其分子标记开发

【目的】开发适合花椰菜的SSR分子标记,为花椰菜品种遗传关系鉴定、遗传图谱绘制等提供候选标记。【方法】以24份花椰菜材料为研究对象,通过MISA软件对其转录组SSR位点信息进行分析,设计SSR引物,对这些引物进行PCR扩增,开发高多态性花椰菜的SSR分子标记;利用差异条带对不同花椰菜材料的亲缘关系进行分析。【结果】从转录组数据中得到66 450条Unigene基因,包含10 715个SSR位点,发生频率为12.09%,平均分布距离为5.9kb。SSR位点中优势类型为二核苷酸重复基序,出现频率占总SSR的51.16%;其次是三核苷酸,占总SSR的47.37%。重复序列基序共49种,其中出现频率较高的重复基序主要为AG/CT、GA/TC和AAG/CTT。有1 164个长度≥20bp的SSR位点,获得具有潜在高多态性的SSR引物6 119对。随机设计的40对引物中有31对引物能进行有效扩增,其中有17对引物在24份花椰菜品种中表现出多态性。UPGMA分析显示,在遗传距离为0.625时,17对多态性引物可将24份花椰菜分为3类。【结论】开发的花椰菜SSR标记类型丰富,出现频率高,具有较高的可用性。     

花椰菜转录组SSR位点分析及其分子标记开发

【目的】开发适合花椰菜的SSR分子标记，为花椰菜品种遗传关系鉴定、遗传图谱绘制等提供候选标记。【方法】以24份花椰菜材料为研究对象，通过MISA软件对其转录组SSR位点信息进行分析，设计SSR引物，对这些引物进行PCR扩增，开发高多态性花椰菜的SSR分子标记；利用差异条带对不同花椰菜材料的亲缘关系进行分析。【结果】从转录组数据中得到66 450条Unigene基因，包含10 715个SSR位点，发生频率为12.09%，平均分布距离为5.9 kb。SSR位点中优势类型为二核苷酸重复基序，出现频率占总SSR的51.16%；其次是三核苷酸，占总SSR的47.37%。重复序列基序共49种，其中出现频率较高的重复基序主要为AG/CT、GA/TC和AAG/CTT。有1 164个长度≥20 bp的SSR位点，获得具有潜在高多态性的SSR引物6 119对。随机设计的40对引物中有31对引物能进行有效扩增，其中有17对引物在24份花椰菜品种中表现出多态性。UPGMA分析显示，在遗传距离为0.625时，17对多态性引物可将24份花椰菜分为3类。【结论】开发的花椰菜SSR标记类型丰富，出现频率高，具有较高的可用性。     

越橘EST-SSR分子标记的开发及其遗传多样性分析

【目的】探讨越橘EST序列中SSR位点的分布规律,开发越橘EST-SSR引物,并分析其在越橘品种遗传多样性研究中的作用。【方法】以91份越橘种质为材料,利用越橘果实转录组(RNA-Seq)的测序结果,通过SSRIT在线搜索,利用Primer Premier 5.0软件设计30对引物,并筛选扩增效果理想的引物,用筛选出的引物分析91份种质的多态性,构建91份种质的系统发育树。【结果】34 464条越橘unigene序列中含有SSR位点的序列有829条,SSR位点有913个,其中二核苷酸、三核苷酸重复是主要的SSR类型,分别占全部SSR位点的13.69%和81.27%。不同核苷酸数目重复基元的重复次数差异很大;越橘EST-SSR位点集中在11~15bp;三核苷酸和六核苷酸重基元复种类最多,在所有重复基元中GAA/TTC发生频率最高。设计的30对引物中有17对引物在供试越橘种质中扩增出理想的PCR产物,17对引物均有多态性。聚类分析结果显示,在遗传相似系数为0.69时,可以将供试越橘种质分成4组。【结论】EST-SSR标记可以用于越橘品种的鉴定与遗传多样性分析。     

梅EST-SSR特征及其对红叶李的可转移性研究

【目的】分析梅EST-SSR特征及其对红叶李的可转移性。【方法】从National Center for Biotechnology Information(NCBI)下载4 589条梅表达序列标签(Expressed Sequence Tag;EST),去除无效碱基后进行拼接和简单重复序列(Simple Sequence Repeat)位点查找;设计引物进行PCR扩增。【结果】获得4 392条unigene,长度为2 420.422kb;搜索到776个SSR位点,分布在650条EST上,出现频率为14.8%。随机设计了15对引物,以4个红叶李品种基因组DNA为模板,进行了PCR扩增,有9对引物可以扩增到清晰稳定的产物,6对多态性引物共检测出20个位点,平均每对引物可以扩增出3.3条多态性片段,平均多态性信息含量(PIC)为0.8。【结论】SSR位点在梅EST序列上分布频率较高,梅EST-SSR在红叶李中具有较高的多态性,可用于红叶李亲缘关系分析和遗传图谱构建等方面的研究。     

草莓EST-SSR标记开发及在品种遗传多样性分析中的应用

 【目的】探讨草莓EST序列中SSR位点的分布规律,开发草莓EST-SSR引物,并分析其在草莓品种遗传多样性研究中的应用。【方法】从NCBI公共数据库下载草莓表达序列标签（expressed sequence tag,EST）55 750条,利用MISA软件查找SSR位点,并利用Primer3.0 Plus软件设计60对引物,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）研究这些SSR引物的PCR扩增特点,并对部分扩增产物进行克隆和测序,以验证其真实性。【结果】55 750条草莓EST序列含有SSR位点的序列1 334条,SSR位点1 490个。其中,二核苷酸、三核苷酸和六核苷酸重复是最主要的SSR类型,分别占36.17%、26.51%和19.87%。60对引物中有42对引物能在20个草莓品种中扩增出理想的PCR产物,其中36对引物扩增条带具有多态性。利用11对验证的EST-SSR引物分析了20个草莓品种的亲缘关系。【结论】草莓EST-SSR标记的开发对于草莓品种鉴定与遗传多样性分析具有重要应用价值。     

基于转录组数据的芦笋EST-SSR标记的开发及通用性分析

【目的】明确芦笋转录组中SSR位点的分布规律，开发高信息量的EST-SSR标记并分析通用性，为天门冬属植物系统进化分析、功能基因挖掘及分子标记辅助育种提供工具。【方法】以笔者课题组前期获得的15个芦笋根系RNA-seq数据为基础，采用MISA软件检索SSR位点、Primer 3.0软件批量设计引物及TB-tools软件批量e-PCR与Primer-blast程序逐一e-PCR相结合的方法剔除非有效引物。通过与基因组序列比对，获取标记所属基因ID、物理位置、潜在功能等信息。随机合成引物50对，以9份芦笋、7份天门冬、5份文竹和3份蓬莱松种质为材料，检测引物有效性、多态性和通用性。【结果】共检索出SSR位点36 590个，分布于30 229条Unigene，发生频率为4.78%，平均间距为9.17 kb。SSR位点非均匀分布于10条染色体，7号染色体数量最多（4 642个），3号染色体密度最高（37.86 SSR/Mb）。SRR位点从单核苷酸至六核苷酸均有分布，以三核苷酸（46.92%）类型最丰富，AG/CT(16.58%)基序最具优势。成功设计EST-SSR引物19 695对，经e-PC...     

梨EST-SSR标记的开发及其在梨品种遗传多样性分析中的应用评价

 【目的】分析梨EST中SSR位点分布规律,开发梨EST-SSR引物,探讨EST-SSR用于梨品种遗传差异研究的可行性。【方法】从NCBI公共数据库中下载梨表达序列标签(expressed sequence tag,EST)1 293条,利用MISA软件对其进行SSR位点查找,将符合条件的序列选出,利用Primer3.0 Plus软件设计48对引物,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)研究这些SSR引物的PCR扩增特点,并对部分扩增产物克隆与测序,以验证其真实性。【结果】1 293条梨的EST序列中含有SSR位点的序列为82条,SSR位点92个。二核苷酸、三核苷酸和六核苷酸重复是最主要的SSR类型,分别占48.91%、17.39%和17.39%。48对引物中有31对引物能扩增出理想的PCR 产物,其中27对引物扩增条带具有多态性。同时发现11对引物中,有83.87%的片段具有相应的SSR位点。聚类结果表明,梨被明显地区分成东方梨和西方梨两大群,分类效果明显。【结论】梨EST-SSR标记开发效率较高,是梨SSR标记开发的重要措施,对于梨品种的鉴定与遗传多样性分析具有重要应用价值。     

尖镰孢EST-SSR信息分析及分子标记建立

【目的】探讨尖镰孢（Fusarium oxysporum）表达序列标签（expressed sequence tag,EST）序列中简单重复序列（simple sequence repeat,SSR）位点的分布特点,开发尖镰孢EST-SSR引物,为镰孢菌遗传多样性分析提供技术支持。【方法】从NCBI公共数据库下载尖镰孢EST 9 304条,利用SSRIT软件查找SSR位点,Primer Premier 5.0软件设计EST-SSR引物,用非变性聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳分离SSR-PCR扩增产物,并选用能够扩增出与预期产物大小一致且具有多态性的引物,对23株尖镰孢菌株进行SSR遗传多样性分析。【结果】在尖镰孢EST序列中,共搜索到92个SSR位点,分布于90条EST序列中,出现频率为1.0%。其中二核苷酸重复类型是最主要的SSR类型,占总SSR的比例为59.78%。其次为三核苷酸与五核苷酸重复类型,占总SSR的比例分别为17.39%、11.96%。出现频率最高的基序是（AC/GT）（0.51%）。设计合成的30对引物中有20对（66.7%）能够有效扩增,其中14对引物（46.7%）能够扩增出与预期产物大小一致且具有多态性的产物。尖镰孢的遗传多样性分析结果表明,利用筛选出的14对引物扩增出62条条带,其中多态性条带59条,多态性位点比例为95.2%,平均每对引物可扩增4.2条。供试菌株间的遗传相似系数为0.487-0.933,平均为0.686。供试菌株间存在明显的遗传分化。聚类分析结果表明,当遗传相似系数为0.781时,除14号菌株外,所有菌株均根据寄主来源划分为不同的SSR类群。【结论】基于尖镰孢EST序列开发SSR标记是一种简便有效的方法,研究开发的14对引物可用于尖镰孢的遗传多样性分析。     

文冠果转录组SSR特征分析及EST-SSR标记开发

【目的】利用高通量测序技术分析文冠果转录组中SSR位点分布类型与特征,并设计开发EST-SSR标记,为文冠果的遗传多样性分析提供标记资源。【方法】利用MISA软件筛选文冠果51 867条unigenes中的SSR(2~6bp)位点,统计分析SSR位点的分布特征、发生频率和平均分布距离。利用Prime 3在线软件随机设计合成60对EST-SSR标记,用我国7个省份的16份文冠果材料对所设计的标记进行多态性筛选;用Popgene 32软件分析标记的等位基因数(NA)、观测杂合度(HO)、期望杂合度(HE)和多态性信息含量(PIC)等。【结果】从文冠果unigenes中筛选出6 707个SSR位点,其平均发生频率为12.93%,平均分布距离5.38kb,平均长度17.30bp,其中2、3核苷酸重复单元的发生频率分别为6.24%和4.93%。设计的60对标记中有47对能扩增出与目的片段长短相符的产物,其中14对多态性较高,共扩增到52个等位基因,HO和HE分别为0~0.813和0.353~0.762,PIC为0.283~0.701。【结论】文冠果转录组SSR重复单元以2、3核苷酸重复为主;新开发的14个EST-SSR标记可作为文冠果种质资源多样性分析的标记资源。     

雄性不育东方百合转录组SSR信息分析及其分子标记开发

【目的】对东方百合雄性不育系开展转录组测序分析,开发SSR分子标记,为东方百合雄性不育系遗传多样性研究奠定基础。【方法】利用MISA软件对筛选得到的1 Kb以上的Unigene做SSR分析,利用Primer3.0设计引物,随机选择71对引物进行多态性扩增。【结果】共获得135 483条Unigene,筛选得到12 391个SSR位点(占总Unigene的9.15%);其中SSR位点中主导类型为单核苷酸重复,占总SSR的63.94%;其次是二核苷酸重复,其出现频率为20.65%。通过Primer3.0设计得到11 948对SSR引物,随机选择71对SSR引物对24种不同来源的东方百合可育品种及雄性不育系进行多态性验证分析,结果显示在22对可扩增产物的SSR引物中,引物表现稳定可重复的多态性,各个位点的等位基因介于3～8个,平均等位基因数5个,多态信息含量PIC平均值0.5048、观测杂合度Ho平均值0.1977、期望杂合度He平均值0.4533。【结论】研究表明通过对东方百合雄性不育系转录组分析可获得较高频率的SSR位点且类型丰富,为东方百合雄性不育系遗传多样性分析和遗传图谱构建提供了候选标记。     

火龙果转录组SSR的信息分析及其分子标记开发

为火龙果种质资源的遗传多样性评价及品种分子鉴定提供参考,利用MISA软件对获得的Unigene进行筛选,以确定火龙果转录组的SSR位点及分布,进而利用Primer 3.0软件设计SSR引物,并利用PCR扩增筛选SSR多态性引物,根据SSR扩增产物的多态性,利用UPGMA方法对15个火龙果种质材料进行聚类分析。结果表明:在碱基序列总长度为54.975Mb的79 658条Unigene中,筛选得到16 523个SSR位点,分布于13 493条Unigene序列上,SSR位点的出现频率为20.74%,平均每3.33kb出现1个SSR位点;SSR的主要类型是单核苷酸重复、二核苷酸重复和三核苷酸重复,其占比分别为59.58%、26.53%和12.93%;随机筛选获得的37对引物经PCR扩增,有23对引物可扩增出清晰条带,11对引物在15个火龙果种质材料中表现出多态性;UPGMA聚类分析将15个火龙果种质材料分为4类,其中,果肉为紫红色或粉红色的贵州紫红龙、贵州红肉-1和台湾红水晶等8个火龙果种质材料聚为Ⅰ类,果肉为红色或粉红色的贵州红龙、云南红肉-2和云南粉肉3个种质材料聚为Ⅱ类,果肉为白色的云南白肉-1、云南白肉-2和贵州野生白肉3个种质材料聚为Ⅲ类,果肉为紫红色的台湾黑龙火龙果种质材料单独为Ⅳ类。     

牡丹转录组SSR信息分析及其分子标记开发

利用Misa软件对牡丹转录组数据进行SSR信息分析和分子标记开发,并通过PCR扩增进行引物多态性分析。结果显示,对牡丹转录组测序获得的131 265条Unigene进行筛选,共获得44 181个SSR位点,分布于38 316条Unigene中,SSR的发生频率和平均分布距离分别为29.19%和2.23 kb。单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸为优势重复类型,分别占SSR总数的75.19%、15.02%和6.88%。依据转录组中的SSR信息序列,随机合成60对引物在16份牡丹品种中进行多态性扩增,其中15对引物表现出多态性,各个位点的等位基因数为4～13个,平均等位基因数8.13个,观测杂合度(H_o)、期望杂合度(H_e)、香农多样性指数(I)、多态信息含量(PIC)的平均值分别是0.757 8、0.790 3、1.718 6和0.730 8。     

利用芥菜转录组信息挖掘SSR标记及用于种质分析

【目的】为开发高效的芥菜Brassicajuncea.分子标记。【方法】本研究通过对芥菜转录组测序的信息搜索SSR位点并分析其分布特点,应用Primer 3.0软件设计SSR引物,随机选择50对引物扩增44份芥菜种质,检测其多态性。【结果】芥菜转录组测序共获得55 636条unigene,全部序列有48 193 376 bp;有7 834条unigene包含SSR的序列,从中鉴定出9 526个SSR位点,其中有1 371条序列包含1个以上SSR,复合SSR有572个,SSR发生频率为14.08%。优势重复基序为三核苷酸和二核苷酸,分别占总SSR的51.12%和41.91%。二核苷酸重复基元中以AG/CT为优势重复基元,占总位点的34.74%,三核苷酸重复基元以AAG/CTT为主,占总位点的18.30%。共设计出21 282对SSR引物,随机选择50对引物进行PCR扩增,其中41对扩增出清晰可重复的预期条带,17对(占34%)在44份芥菜种质中表现出多态性。应用UPGMA得到将44份供试材料分为4大类聚类图,可准确地体现了芥菜种质材料的关系。【结论】根据芥菜转录组数据能开发出类型丰富、效率较高的SSR标记,为芥菜亲缘关系分析和遗传图谱构建等提供更可靠的标记。     

蒙农红豆草花瓣转录组微卫星SSR特征分析

【目的】对蒙农红豆草花瓣转录组微卫星SSR特征进行分析，为开发新的分子标记及探明各类性状的遗传机制研究奠定基础。【方法】以蒙农红豆草突变群体中浅色花瓣和紫红色花瓣（对照）为试验材料，通过Illumina HiSeq^TM 2000对其进行高通量测序和组装，利用MISA软件对其所有Unigene进行SSR搜索，并对SSR分布及其序列特征进行分析。【结果】在蒙农红豆草转录组数据中共获得53 009条Unigene，其中6 202条Unigene上分布了8 175个SSR位点，每5.86 kb就有1个SSR位点；重复基元数量以三核苷酸为主（49.13%），二核苷酸次之（22.07%）；在284种重复基元中以AG/CT类型最高（16.16%），其次为AAG/CTT（14.30%）；三核苷酸基元重复次数种类最多（11种），二核苷酸次之（10种）。随着基元重复次数的增加，核苷酸数量减少。蒙农红豆草SSR长度为12～441 bp，主要集中在12～24 bp，其中具有高度多态性潜能的SSR（长度≥20 bp）有3 130条（38.29%）。【结论】蒙农红豆草SSR位点出现频率高、基元类型丰富、分布密度大、多态性潜能高，在红豆草基因定位和分子标记辅助育种等方面具有较大的应用价值。     

基于RNA-seq数据的栽培种花生SSR位点鉴定和标记开发

【目的】鉴定花生RNA-seq数据中的SSR位点,明确转录组中SSR位点的分布和结构特点,开发与花生基因相关联的SSR标记,为花生重要功能基因的挖掘、等位变异研究和分子标记辅助育种奠定基础。【方法】根据栽培种花生全生育期中22种不同类型的组织RNA-Seq数据,使用MISA软件分析SSR位点分布及特征,采用Primer 3设计基因关联的SSR引物,并利用电子PCR软件对引物的质量进行检测,随机合成38对引物,进行多态性检测。【结果】从52 280条转录本中共鉴定19 143个SSR位点,分布于14 084条转录本,发生频率为26.94%。重复单元类型为单核苷酸—五核苷酸,以单核苷酸和三核苷酸为重复单元的SSR位点数最多,分别占位点总数的39.24%和38.40%。各重复单元优势基序类型分别为A/T、AG/CT、AAG/CTT、AAAG/CTTT和AACAC/GTGTT,占所在重复单元中的比例分别为97.62%、72.01%、30.96%、24.59%和16.67%。重复单元的重复次数为5—47次,单个SSR位点的长度的分布范围为10—47 bp,基序长度主要集中在10—14 bp;复合SSR位点的长度范围为21—249 bp,以31—40 bp为主。鉴定的SSR位点中共有13 477个SSR位点可以进行引物设计,其中5 020条转录本序列对应到特定的基因,共包含5 859个可进行引物设计的SSR位点,这些SSR位点在A基因组和B基因组共20条染色体上不均匀分布,其中B03染色体上SSR位点最多,为484个。对特定基因SSR引物进行电子PCR检测,在A.duranensis、A.ipaensis、A.hypogaea基因组中有效扩增位点分别为4 468、4 929和10 188个,有效引物数分别为3 968（67.74%）、4 232（72.25%）和5 174（88.33%）对,在A. hypogaea基因组中,SSR引物扩增位点主要以2个位点为主,其中,有1 477对引物单位点扩增。根据SSR引物扩增位点在栽培种花生基因组中的位置信息绘制了SSR位点的物理图谱。在38对SSR引物中,共有35对（92.1%）SSR引物可以扩增出清晰的条带,其中,有11对（28.9%）SSR引物在2个品种间扩增出差异条带。【结论】鉴定了13 477个可进行标记开发的SSR位点,开发、检测了5 859个基因相关SSR标记,在栽培种花生基因组中具有较高的扩增效率,并构建了基因相关SSR位点的物理图谱。     

大蒜转录组简单重复序列标记分析与分子标记开发

为探明大蒜转录组简单重复序列标记(SSR)的特征,开发适合大蒜育种的SSR引物,利用MISA软件对大蒜转录组序列进行SSR位点检测与信息分析,并通过PCR扩增检测引物的有效性和多态性。结果表明:大蒜转录组测序获得444 865条unigenes,共鉴定出141 132个SSR位点,发生频率为23.02%,平均每3.45 kb出现一个SSR位点。单核苷酸和二核苷酸为SSR位点中优势类型,分别占总SSR的68.02%和24.12%;SSR位点共有82种重复基序,以AT和ATAT数量较多,占总SSR位点的65.02%和12.37%。利用Primer 3.0共设计出125 616对SSR引物,在随机选取的14对引物中有12对引物能够有效扩增,其中6对引物在35份大蒜资源中表现出多态性,扩增共得到26条多态性条带,每对引物平均产生4.33个条带。UPGMA分析显示,在遗传相似系数0.756 9处,35份大蒜资源可被分成5大类群。综上所述,利用大蒜转录组数据进行SSR分子标记开发能够获得较高频率的SSR位点,且开发的SSR标记可用性强。     

基于RNA-seq数据的栽培种花生SSR位点鉴定和标记开发

【目的】鉴定花生RNA-seq数据中的SSR位点,明确转录组中SSR位点的分布和结构特点,开发与花生基因相关联的SSR标记,为花生重要功能基因的挖掘、等位变异研究和分子标记辅助育种奠定基础。【方法】根据栽培种花生全生育期中22种不同类型的组织RNA-Seq数据,使用MISA软件分析SSR位点分布及特征,采用Primer3设计基因关联的SSR引物,并利用电子PCR软件对引物的质量进行检测,随机合成38对引物,进行多态性检测。【结果】从52 280条转录本中共鉴定19 143个SSR位点,分布于14 084条转录本,发生频率为26.94%。重复单元类型为单核苷酸—五核苷酸,以单核苷酸和三核苷酸为重复单元的SSR位点数最多,分别占位点总数的39.24%和38.40%。各重复单元优势基序类型分别为A/T、AG/CT、AAG/CTT、AAAG/CTTT和AACAC/GTGTT,占所在重复单元中的比例分别为97.62%、72.01%、30.96%、24.59%和16.67%。重复单元的重复次数为5—47次,单个SSR位点的长度的分布范围为10—47 bp,基序长度主要集中在10—14 bp;复合SSR位点的长度范围为21—249 bp,以31—40 bp为主。鉴定的SSR位点中共有13 477个SSR位点可以进行引物设计,其中5 020条转录本序列对应到特定的基因,共包含5 859个可进行引物设计的SSR位点,这些SSR位点在A基因组和B基因组共20条染色体上不均匀分布,其中B03染色体上SSR位点最多,为484个。对特定基因SSR引物进行电子PCR检测,在A.duranensis、A.ipaensis、A.hypogaea基因组中有效扩增位点分别为4 468、4 929和10 188个,有效引物数分别为3 968(67.74%)、4 232(72.25%)和5 174(88.33%)对,在A. hypogaea基因组中,SSR引物扩增位点主要以2个位点为主,其中,有1 477对引物单位点扩增。根据SSR引物扩增位点在栽培种花生基因组中的位置信息绘制了SSR位点的物理图谱。在38对SSR引物中,共有35对(92.1%)SSR引物可以扩增出清晰的条带,其中,有11对(28.9%)SSR引物在2个品种间扩增出差异条带。【结论】鉴定了13 477个可进行标记开发的SSR位点,开发、检测了5 859个基因相关SSR标记,在栽培种花生基因组中具有较高的扩增效率,并构建了基因相关SSR位点的物理图谱。