大豆北方茎溃疡病菌荧光RAA检测方法的建立

本文根据大豆北方茎溃疡病菌与其近似种在序列上的差异,设计了特异性的引物和探针,建立了荧光RAA特异性检测方法,并用大豆上常见的病害及其近似种进行验证。结果表明:供试的菌株,只有大豆北方茎溃疡病菌表现出阳性扩增信号,其他菌株和空白对照均未检测到荧光信号,该方法可以检测到1.0×10³ mL^-1的阳性DNA,完成整个检测只需20 min左右,可以快速、灵敏的完成进出境大豆产品的大豆北方茎溃疡病菌的检测。     

实时荧光PCR检测瓜类蔓枯病菌的方法研究

[目的]建立瓜蔓枯病菌(Didy mella bryoniae)的实时荧光PCR方法,为瓜蔓枯病菌快速分子检测奠定基础.[方法]通过Genebank网上已公布序列,选取瓜蔓枯病菌beta-tubulin(tub2)基因作为目的基因,设计了特异性引物和Taq Man探针,并对该引物和探针的反应条件进行优化.[结果]采用研究所设计的引物和探针对瓜上的其他菌株及近似菌株进行检测,该引物和探针可高度灵敏地检测到瓜蔓枯病菌.采用实时荧光PCR方法,25μL体系中只要有8.9 pg的核酸量就可以被检测到,检测灵敏度达到356 fg/μL,比普通PCR灵敏度高10倍.[结论]采用研究所设计的引物和探针对田间采集的病株和未知样品的检测,验证了引物和Taq Man探针的特异性.     

广西烟草立枯病菌和靶斑病菌菌丝融合群初步分析

为了明确广西烟草立枯病菌和靶斑病菌的菌丝融合群,从广西发病烟草植株上分离了2株烟草立枯病菌菌株和3株靶斑病菌菌株。经形态特征和细胞核染色观察发现,这5株菌株均属于多核立枯丝核菌。依据供试菌株与标准菌株的菌丝融合反应,发现广西烟草立枯病菌和靶斑病菌均包含AG-2和AG-4两个菌丝融合群。进一步分析5个菌株的r DNA-ITS序列,初步明确这2种病原菌包括AG-4 HG-I和AG-2-2 IIIB 两个菌丝融合群,与菌丝融合反应分析结果相吻合。首次在国内从烟草靶斑病组织上分离到AG-2 和AG-4 融合群。     

利用巢式PCR检测玉米细菌性枯萎病菌

利用通用引物扩增了玉米细菌性枯萎病菌及其近似种的转录间隔区并进行了序列测定。通过序列比较,设计了一对玉米细菌性枯萎病菌的专化性引物,并对所有参试菌株进行扩增。结果显示：该对引物能从参试的玉米细菌性枯萎病菌中特异性地扩增出1条299bp的条带,而其他参试菌株没有扩增信号。与扩增细菌ITS区域的通用引物结合使用,建立了检测和鉴定玉米细菌性枯萎病菌的巢式PCR技术,其检测灵敏度可达到4个细菌细胞,可以准确、灵敏地检测和鉴定玉米细菌性枯萎病菌。     

利用巢式PCR检测玉米细菌性枯萎病菌

利用通用引物扩增了玉米细菌性枯萎病菌及其近似种的转录间隔区并进行了序列测定.通过序列比较,设计了一对玉米细菌性枯萎病菌的专化性引物,并对所有参试菌株进行扩增.结果显示:该对引物能从参试的玉米细菌性枯萎病菌中特异性地扩增出1条299 bp的条带,而其他参试菌株没有扩增信号.与扩增细菌ITS区域的通用引物结合使用,建立了检测和鉴定玉米细菌性枯萎病菌的巢式PCR技术,其检测灵敏度可达到4个细菌细胞,可以准确、灵敏地检测和鉴定玉米细菌性枯萎病菌.     

植物病原细菌的BIOLOG系统鉴定及其多元统计初析

利用Biolog细菌鉴定系统对我国水稻上几种条斑病菌及其相关菌株进行了快速鉴定研究。结果表明16株供试菌株中12株准确鉴定到种或致病变种,有4株鉴定到属。聚类分析显示李氏禾条斑病菌和“稻短条斑病菌”的Biolog代谢指纹相似性高,与小麦黑颖病菌（TAS）亲缘关系较近,而与水稻条斑病菌、稻白叶枯病菌具有明显差异。使用多元统计分析方法对供试菌株的Biolog代谢指纹进行比较研究,通过聚类分析和主成份分析不仅能够区分菌株间的显著差异,而且依据因子权重值可筛选出具有鉴别价值的碳源。     

芝麻茎点枯病菌产生的几种细胞壁降解酶活性分析

测定芝麻茎点枯病菌产生的几种细胞壁降解酶种类及活性大小,为进一步探讨其与寄主的互作机制奠定基础。从不同芝麻产区采集7株茎点枯病菌,液体培养制取粗酶液,离体条件下采用分光光度法测定病原菌分泌的半纤维素酶、木质素降解酶种类及活力大小。结果表明,7个菌株均未检测到锰过氧化物酶,但都能检测到木聚糖酶、木质素过氧化物酶和漆酶,说明7个菌株均能产生半纤维素酶和木质素降解酶,并且同一种酶不同菌株酶活力大小不同,同一菌株的木质素过氧化物酶活力都明显高于漆酶活力,其中,菌株2010003的木聚糖酶综合活力最高,菌株2010028的木质素过氧化物酶和漆酶活力均最高。     

基于gpd基因的大蒜黑腐病菌实时荧光定量PCR鉴定技术

【目的】大蒜黑腐病菌（Embellisia allii (Campanile) Simmons）的检疫鉴定主要采用形态鉴定方法。不仅耗时长,而且大蒜黑腐病菌与本属其他种以及其他属的分生孢子非常相似,极难分辨,需要建立快速、有效的分子诊断方法。研究旨在建立实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)体系以准确、灵敏地鉴定大蒜黑腐病菌。【方法】从NCBI的GenBank数据库中,选取大蒜黑腐病菌和其他大蒜病害以及近似种的3-磷酸甘油脱氢酶（gpd）基因核酸序列数据15种,应用引物设计软件Primer express,根据探针设计原则从理论上选出1条探针和3对引物。根据试验结果对上述引物进行筛选,筛选出能够鉴定出大蒜黑腐病菌的特异性引物对和TaqMan探针。同时对反应体系中复性-延伸温度的反应参数进行优化,设计56、58、60℃ 3个温度梯度;将大蒜黑腐病菌基因组DNA在紫外核酸分析仪上进行定量后进行10倍的梯度稀释,对探针灵敏性进行测试,从而建立大蒜黑腐病菌TaqMan水解探针法qPCR检测体系。【结果】从基于GenBank上的15种gpd基因核酸序列设计的引物和探针中,筛选出能够鉴定大蒜黑腐病菌的特异性引物对Emb21/Emb32和TaqMan探针Emb。在供试的6种菌株中,只有靶标菌大蒜黑腐病菌利用该引物对和探针能够被特异性的检测到阳性,空白对照和其他参试菌均没有荧光信号的增加,检测为阴性。复性-延伸温度反应参数优化中,△Rn荧光信号增加值在58℃时达最大,56、60℃荧光信号增加值降低,经过多次重复试验,确定最佳的复性-延伸温度为58℃。灵敏度测试中,大蒜黑腐病菌DNA浓度稀释到140 pg时,所得的图形较好;当体系中模板浓度稀释到14 pg时,所得的图形较差。最终DNA检测灵敏度为140 pg。应用该引物和探针建立的qPCR检测方法能够从供试的菌株中特异性地检出大蒜黑腐病菌。【结论】建立了大蒜黑腐病菌TaqMan探针法qPCR检测体系,该检测技术能够从供试的6种病原菌中特异性检测出大蒜黑腐病菌,检测灵敏度可达140 pg。建立的基于gpd基因的大蒜黑腐病菌qPCR方法具有高度的特异性和灵敏度,适合口岸大蒜黑腐病菌的快速检测。     

应用TaqMan MGB探针检测美澳型核果褐腐病菌

以美澳型核果褐腐病菌的6个菌株以及核果褐腐病菌一个和欧洲种仁果褐腐病菌这两种近似种为研究对象,通过对ITS区序列的比对分析,设计了美澳型核果褐腐病菌的TaqMan MGB实时荧光PCR引物和探针,建立了美澳型核果褐腐病菌的TaqMan MGB实时荧光PCR检测方法.设计了这3种近似种的通用引物和探针,用于检测过程中进行质量控制.     

根癌农杆菌介导荸荠秆枯病菌转化体系构建及突变体筛选

【目的】建立农杆菌介导荸荠秆枯病菌(Cylindrosporium eleocharidis)的遗传转化体系,构建该病菌的突变体库并进行突变体筛选,为荸荠秆枯病病原菌的分子机理研究提供参考依据。【方法】运用农杆菌介导的真菌转化方法,将含有绿色荧光蛋白(GFP)的双元载体pEX4转化至荸荠秆枯病菌野生型菌株Ceh中,利用PCR、Southern blotting杂交和荧光显微镜检测等技术验证转化子。通过单因子变量[共培养基中的乙酰丁香酮(AS)、农杆菌诱导时间、病原菌孢子浓度、IM诱导培养基pH、共培养时间和共培养介质]试验,优化农杆菌遗传转化体系,并建立该病菌突变体库,分析突变体的形态变异和致病性。【结果】获得的最佳遗传转化条件为:共培养基中AS浓度为300μmol/L,农杆菌诱导时间6 h,真菌孢子浓度为10~7个/mL,诱导培养基pH 5.6,共培养时间72 h,共培养介质为硝酸纤维素膜。在该优化条件下,农杆菌遗传转化体系转化效率达600～700个转化子/10~7个孢子。随机挑取转化子进行PCR检测均为阳性,T-DNA单拷贝插入率达77.8%,荧光显微镜均可检测到荧光信号。【结论】成功构建了农杆菌介导的荸荠秆枯病病原菌遗传转化体系和T-DNA插入突变体库,并筛选获得表型和致病性缺陷突变体,可用于指导荸荠秆枯病菌基因功能和病菌与寄主互作研究。     

马铃薯疮痂病菌(Streptomyces scabies)的血清学检测

以马铃薯疮痂病菌RB5(Streptomyces scabies)的菌丝-孢子为抗原免疫家兔,制备了抗血清AsRB5,并采用琼脂双扩散和酶联免疫吸附试验对抗血清进行特异性测定,结果表明,供试的10 株马铃薯疮痂病菌,1 株玫瑰黄链霉菌和1株玫瑰暗黄链霉菌与AsRB5 反应为阳性,其他15 株疮痂链霉菌与AsRB5 反应为阴性,作为对照的棉花黄萎病菌、立枯病菌、炭疽病菌与AsRB5 反应为阴性。以上结果表明,使用抗血清AsRB5 检测马铃薯疮痂病菌,基本上可以将其鉴定到种的水平上。但不能对同种内菌株进一步区分或进行多样性评价,并且这种鉴定与其地理来源及寄主无关。     

西瓜细菌性果斑病菌Taq Man探针实时荧光PCR检测鉴定方法的建立

根据西瓜细菌性果斑病菌（Acidovorax avenae subsp．citrulli）与相关细菌16SrDNA序列差异，设计出对西瓜细菌性果斑病菌具有稳定点突变特异性探针Aac—probe，利用该探针对23种供试菌株进行了实时荧光PCR检测实验。结果表明，只有西瓜细菌性果斑病菌能检测到荧光增强信号，其它细菌无荧光增强信号。该方法特异性强，灵敏度高，重复性好，可有效地应用于西瓜细菌性果斑病菌的检测。     

葡萄内生细菌菌株Zyx-3生理生化特性及抑菌能力测定

以分离自葡萄叶片内生细菌菌株Zyx-3为研究对象,依据其形态特征、生理生化特性等初步确定了其分类地位,并采用平板对峙法测定了其对14种植物病原真菌的抑菌能力。结果表明,Zyx-3菌体杆状,中生芽孢,革兰氏染色阳性;菌株具有运动性和需氧性,可以使明胶液化、淀粉水解,接触酶反应阳性,具有耐盐性,可在10%NaCl培养液中生长。根据其形态特征及生理生化特性,初步确定其为芽孢杆菌（Bacillus spp.）。该菌株对玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici）、苹果腐烂病菌（Valsa mali）、马铃薯立枯丝核病菌（Rhizoefonia solani）、半夏早疫病菌（Alternaria sonali）、苹果轮纹病菌（Physalospora piricola）、葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）和葡萄白腐病菌（Coniothyrium diplodiella）、茄子菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）等14种供试植物病原真菌均有不同程度的抑制作用,抑菌谱广。     

华南地区17个农作物病原真菌菌株间拮抗作用的初步研究

 通过PDA平板对峙试验研究了华南地区17种农作物病原真菌菌株之间的共生关系和拮抗关系,结果表明菌丝对峙生长可分为5种类型。稻小黑菌核病菌株与大部分供试菌株有明显的拮抗作用,稻黑粒病新月弯孢霉菌株与大部分供试菌株不能共生,花生冠腐病菌株的菌丝能覆盖大部分供试菌株的菌落,茶云纹叶枯病菌株、桑炭疽病菌株和柚子炭疽病菌株的菌落有明显的区别。     

西甜瓜蔓枯病菌致病力测定与品种抗病性分析

【目的】研究不同西、甜瓜蔓枯病菌株的致病力差异和不同西、甜瓜品种的抗病性,为指导广西西、甜瓜生产提供科学依据。【方法】采用离体叶片接种法对104个西、甜瓜蔓枯病菌株进行致病力差异分析,并对14个西、甜瓜品种进行抗病性测定。【结果】不同蔓枯病菌菌株致病力存在差异,104个菌株中强致病力菌株、中等致病力菌株和弱致病力菌株分别占31.73%、57.69%和10.58%。不同西、甜瓜品种对同一蔓枯病菌菌株的感病性也存在差异,强致病力菌株WTMK-76对不同西、甜瓜品种病情指数为38.14~86.92,中致病力菌株BHMK-59对不同西、甜瓜品种病情指数为26.88~76.40。10个西瓜品种中以绿美人的抗病性最强,黑美人次之;4个甜瓜品种中以广蜜1号的抗病性最强。【结论】不同的蔓枯病菌菌株致病力存在差异,但菌株致病力强弱与菌株分布的地理位置无关;不同西、甜瓜品种抗病力也存在差异,其中以绿美人、黑美人和广蜜1号的抗病性最强,这3个西、甜瓜品种可在广西推广种植。     

山东省保护地土壤黄瓜菌核病拮抗细菌的分离与鉴定

利用点接法从山东省9个地市的保护地黄瓜菌核病病株根际土壤中初步筛选到21株拮抗细菌,其分布率与田间发病率呈正相关,经平板对峙培养复筛出4株对黄瓜菌核病菌具有强烈抑制作用的细菌。该4个菌株均具有明显的抑菌宽带,其中菌株BSH-4对黄瓜菌核病菌的抑制率最高为91.1%,抑菌带宽度为18.5mm;4个菌株对黄瓜猝倒病菌、蔓枯病菌、枯萎病菌和立枯病菌,番茄早疫病菌、辣椒疫病病菌、茄子绵疫病菌等7种常见蔬菜土传病害的致病菌均表现出不同程度的抑制作用。根据菌株的菌体形态、培养性状、生理生化特性等指标,初步确定4菌株中1株为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa),1株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),2株为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。     

大蒜叶枯病菌毒素产生条件的研究

为了筛选大蒜叶枯病菌培养的最佳产毒条件,从田间发病的大蒜叶片上分离、鉴定得到大蒜叶枯病菌菌株,利用大葱种子发芽法研究培养条件(培养基、培养温度、光照、振荡、培养基pH值、培养时间)对大蒜叶枯病菌菌株产毒能力的影响。结果表明,大蒜叶枯病菌的最佳产毒培养条件为:Czapek-Dox液体培养基、培养温度24℃、培养基pH值6.0~7.0、连续黑暗振荡培养,在以上条件下培养20 d时大蒜叶枯病菌产生粗毒素的毒性最强。     

免疫捕捉PCR和经典PCR方法检测水稻细菌性谷枯病菌灵敏性比较

将免疫吸附富集(ISE)和经典PCR结合以提高水稻细菌性谷枯病的检测效率,并且利用多克隆抗体技术成功地获得了4种抗血清,即抗Burkholderia glumae全菌体血清ASBg14,ASBg32,ASBg26和ASBg04,ODD法测定该4种抗血清的效价均达到1∶32以上,利用凝聚法测定的所有抗血清的效价也均达到了1∶5 120 以上,通过两种方法结合测定效价均显示为合格抗体。通过对4种抗血清的专化性进行研究,结果显示ASBg14和ASBg32专化性较高,抗血清ASBg26 和ASBg04专化性不是很理想。用直接PCR技术和免疫捕捉PCR技术检测谷枯病菌,结果表明,所有谷枯病菌都能产生500 bp左右的特异性片段,非谷枯病菌的8个菌株均无特异性片段产生。两种检测方法的灵敏度比较发现,直接PCR技术能检测到1×105 cfu·mL-1左右的悬浮液,免疫捕捉PCR技术能检测到103 cfu·mL-1 左右悬浮液,免疫捕捉PCR比直接PCR灵敏性提高102倍。检测人工接种的病稻种实验中,直接PCR技术能检测到2粒及以上带菌种子制得浸悬液,而免疫捕捉PCR技术仅1粒带菌种子即可。     

应用实时荧光PCR检测甜菜霜霉病菌

【目的】建立用于快速检测甜菜霜霉病菌Peronospora farinosa f．sp．betea Byford的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR检测方法。【方法】根据已报道的P．farinosa f．sp．Betea Byford及近似种28S rDNA序列同源性比对结果,设计用于检测甜菜霜霉病菌的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR检测引物。利用所建立的方法对包括P． farinosa f．sp．Betea在内的6种甜菜上的病原菌和5种其他霜霉病菌基因组DNA及12份甜菜种子样品进行检测,验证该方法的检测特异性、灵敏度及实用性。【结果】所建立的检测方法仅对甜菜霜霉病菌得到阳性扩增,其它参照菌株及阴性对照均无荧光信号扩增,准确排除了甜菜上其他5种病菌的干扰,其检测灵敏度显示最低限量为100 fg病菌DNA,应用该方法对不同来源的12份甜菜种子样品进行检测,田间监测结果一致。【结论】所建立的荧光检测方法能够对甜菜霜霉病菌进行快速筛查,为甜菜霜霉病菌的早期诊断和防控提供了一种技术手段。     

人参锈腐病拮抗生防菌的筛选与鉴定

从人参根际土壤中筛选到具有拮抗人参锈腐病菌(Cylindrocarpon destructans)生物活性的生防菌3株,其中菌株BS015和菌株HN01为细菌,抑菌圈直径分别为22.8mm和21.9mm.菌株Tri41为木霉菌,抑菌率达76.6%.对人参几种常见病原菌进行了抑菌试验,结果表明:对人参根腐病菌(Fusarium solani)、人参立枯病菌(Rhizoctonia solani)、人参黑斑病菌(Alternaria panax)、人参菌核病菌(Sclerotinia schinseng)均有一定的抑菌效果.结合16S rDNA分子鉴定和形态鉴定对3株菌株进行了鉴定.结果表明:菌株BS015为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),菌株HN01为多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa),菌株Tri41为哈茨木霉(Trichdema harzianum).