融合蛋白C3d提高新城疫灭活苗的免疫原性

补体C3d是补体系统（complement system,CS）中补体c3的最终裂解产物。本试验利用RT—PCR技术从从肉鸡肝脏总RNA中扩增C3dcDNA,测序证实为C3d基因。然后将其连接至表达载体pET-32a（＋）,转化E．coliBL21（DE3）,1％IPTG诱导表达。SDS-PAGE、Western-blotting证实目的蛋白为C3d。亲和层析分离C3d融合蛋白,与纯化新城疫病毒（Lasota株）经戊二醛连接后免疫SPF鸡。血凝抑制试验（HI）检测新城疫抗体水平,MTT法检测胸腺T淋巴细胞转化率。结果表明C3d融合蛋白能够提高特异性抗体水平以及细胞免疫水平,本研究为进一步研究、利用鸡补体C3d奠定了基础。     

鸡SIgA的纯化鉴定及免疫小鼠效果的观察

为了探索鸡分泌型免疫球蛋白A(SIgA)分离、纯化及鉴定方法,以新鲜的鸡胆汁为材料,采用硫酸铵盐析法从鸡胆汁中粗提纯鸡SIgA,应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定和纯化SIgA重链,用纯化的鸡SIgA重链蛋白免疫Balb/C小鼠。结果表明,SIgA重链分子量为67~70kD,轻链为26~28kD。免疫Balb/C小鼠抗血清针对SIgA重链的间接ELISA效价可达1∶16000。为进一步研究SIgA生物学特性、单克隆抗体制备和黏膜免疫状况检测提供了技术支持。     

H9亚型禽流感病毒间接免疫荧光检测方法的建立与比较

将禽流感病毒(AIV)接种犬肾上皮细胞(MDCK),24h后以鸡抗禽流感抗体和兔抗鸡荧光抗体进行间接免疫荧光试验(IFA),结果于细胞核、细胞质内观察到特异性的荧光。利用96孔细胞板培养MDCK细胞,以间接免疫荧光作为判定指标对禽流感病毒进行毒力测定,并与禽流感病毒通用荧光反转录-聚合酶链反应(荧光RT-PCR)检测方法进行比较。结果表明间接IFA、荧光RT-PCR对同一样品检测的最高稀释度分别为10-5.25TCID50和10-6,Ct<30,两种方法对禽流感病毒的检测敏感性均很高。但由于荧光RT-PCR仅对抽提的RNA进行检测,而间接IFA是对禽流感活病毒进行检测,因此在临床样品检测和动物产品检疫中间接IFA更具准确性和实用性。     

副鸡禽杆菌单因子血清的制备与应用

利用副鸡禽杆菌的A、B和C3个血清型的参考菌株Hpg-8、CCM6075和Hpg-68分别制备相应的抗血清,然后对抗血清进行交叉吸收试验,得到A型、B型和C型3种单因子血清,不同血清型的单因子血清不与其他血清型菌株发生凝集。利用这3种单因子血清对临床上分离到的6株副鸡禽杆菌进行血清型的鉴定,结果表明6株地方分离株均为血清A型。     

AA肉鸡补体C3d基因cDNA的克隆及鉴定

为获得鸡C3d基因的cDNA,从鸡肝细胞提取总RNA,通过RT-PCR扩增出C3d基因的cDNA,脂糖凝胶电泳鉴定后直接克隆到pMD18-T载体,构建C3d-pMD18-T重组质粒,转化大肠杆菌,酶切鉴定后进行序列测定。通过琼脂糖凝胶电泳证明有1.0 kb左右的PCR扩增片段,序列测定表明为C3d基因的cDNA。通过RT-PCR法从鸡肝细胞RNA中成功地扩增到鸡C3d基因的cDNA,为进一步构建基于C3d基因内佐剂的疫苗奠定了基础。     

AA肉鸡补体C3d基因eDNA的克隆及鉴定

为获得鸡C3d基因的eDNA,从鸡肝细胞提取总RNA,通过RT—PCR扩增出C3d基因的eDNA,脂糖凝胶电泳鉴定后直接克隆到pMD18-T载体,构建C3d—pMD18-T重组质粒,转化大肠杆菌,酶切鉴定后进行序列测定。通过琼脂糖凝胶电泳证明有1．0kb左右的PCR扩增片段,序列测定表明为C3d基因的cDNA。通过RT—PCR法从鸡肝细胞RNA中成功地扩增到鸡C3d基因的cDNA,为进一步构建基于C3d基因内佐剂的疫苗奠定了基础。     

鸡传染性喉气管炎病毒的分离鉴定

[目的]证实江都市存在鸡传染性喉气管炎。[方法]以江都市5只发病鸡的喉、气管粘膜及其分泌物为病料,采用鸡胚传代的方法从中分离出1株病毒（ILTV—JD07）,对分离毒株进行了理化特性检验、毒价测定、中和试验、琼脂免疫扩散试验、PCR扩增及电泳检测等。[结果]鸡胚接种病料后48h胚体活性减弱,3—8d内死亡6枚,解剖死胚可见其绒毛尿囊膜（CAM）增厚,取病变CAM传至第4代接种鸡胚,鸡胚集中于接种后3—5d内死亡;第4代分离毒的毒价基本稳定在10^5.77EID50／0．2ml,分离毒毒株可被鸡传染性喉气管炎（ILT）标准阳性血清中和,中和价为1：54;参考株ILT／13与分离株ILTV-JD07均可扩增出1条183bp的DNA条带。[结论]江都市存在鸡传染性喉气管炎。     

副鸡嗜血杆菌的分离与鉴定

[目的]对1例鸡传染性鼻炎疑似病例进行病原菌的分离与鉴定。[方法]从安徽省某鸡场发生的以脸面肿胀、流泪和产蛋下降为临床特征的病鸡上呼吸道分泌物中分离细菌,并进行染色、镜检、菌落形态观察,并利用"卫星现象"和PCR等方法进行鉴定。[结果]成功分离到1株副鸡嗜血杆菌,经鉴定为C型副鸡嗜血杆菌。动物回归试验表明,该分离株能引起典型的鸡传染性鼻炎,对鸡具有较强的致病力。[结论]该研究可为鸡传染性鼻炎的预防与控制提供依据。     

兴义矮脚鸡生长激素受体基因内含子2的多态性

为合理利用兴义矮脚鸡的遗传资源,利用PCR-RFLP技术对兴义矮脚鸡生长激素受体(GHR)基因内含子2的多态性进行了研究。结果表明,兴义矮脚鸡GHR基因内含子2 Hind-Ⅲ位点表现出多态性,具有B、C 2个等位基因。公鸡中检测到BB、CC和BC 3种基因型,在母鸡群中仅检测到BB、CC 2种基因型,未检测到杂合型BC。     

一株禽腺病毒4型病毒分离与鉴定

为了对某肉鸡场暴发的疾病进行确诊,对送检的病死鸡进行解剖、细菌分离和荧光PCR检测,并进一步进行鸡胚半数致死量(ELD₅₀)、动物回归试验和组织灭活疫苗研制。结果显示：病死鸡剖检可见肝脏肿大、出血,心包胶冻样积液,肾脏肿大,病料未分离到细菌。PCR检测禽腺病毒4型(FAV4)阳性,用处理液进行病毒分离,成功分离到一株FAV4病毒,扩增所分离病毒hexon基因部分序列,测序结果与GenBank上的FAV4 hexon基因(登录号：EF554403)相似性为100%。分离病毒盲传3代,测定的ELD₅₀为104.5/0.2 mL,以0.2 mL·只^-1的剂量胸部肌肉注射30日龄SPF鸡5只,4 d内鸡只全部死亡,病变与临床剖检病死鸡相似。取病死鸡肝脏制备组织灭活疫苗,免疫SPF鸡,能抵抗所分离FAV4病毒攻击。研究成功分离鉴定出一株FAV4病毒,并进行初步研究,丰富了毒种库,为FAV4病毒疫苗研制奠定了基础。     

逆转录病毒法制备转基因鸡的方法分析

随着生物制药业的迅速发展,转基因鸡已逐渐成为生物领域研究的热点之一。为建立和优化逆转录病毒法制备转基因鸡技术平台,以pHIT-Myc3为载体,以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为标记基因,采用共转染法包装泛嗜性VSV-G假逆转录病毒,浓缩后分别体外侵染鸡胚胎成肌细胞和体内胚盘下腔接种新生种蛋并孵化出雏。分别抽提成肌细胞、孵化5d的全胚和新生雏鸡不同脏器的基因组DNA进行PCR鉴定分析,结果分别在细胞和5d全胚胎及新生雏鸡的胸腺和皮肤中检测到了标记基因EGFP的存在,表明逆转录病毒法成功制备出转基因鸡,同时转基因鸡技术平台中的方法技术条件也得到了有效优化,为转基因鸡的进一步研究提供参考。     

太白七药红毛七化学成分研究

[目的]研究太白七药红毛七的化学成分,为其药效成分及作用机理的深入研究奠定基础。[方法]采用硅胶柱色谱、SephadexLH-20、重结晶等方法进行分离纯化,依据理化性质和波谱数据进行结构鉴定。[结果]从红毛七石油醚及乙酸乙酯萃取相中分离得到9个纯品化合物,分别为棕榈酸(Ⅰ)、α-菠菜甾醇(Ⅱ)、α-菠甾醇-β-D-葡萄糖苷(Ⅲ)、β-豆甾醇(Ⅳ)、16α,23,28-三羟基-齐墩果-12-烯-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(Ⅴ)、16α-羟基-齐墩果-12-烯-28-酸-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(Ⅵ)、常春藤皂苷元-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(Ⅶ)、葳严仙皂苷元-3-O-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(Ⅷ)、常春藤皂苷元-3-O-β-D-葡萄吡喃糖-(1→2)-α-L-阿拉伯吡喃糖苷(Ⅸ);化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ均为首次从该属植物中分离得到。[结论]该方法可用于研究太白七药红毛七的化学成分,为太白山产红毛七的进一步开发利用提供依据。     

新疆双峰驼C3d基因cDNA的克隆与序列分析

【目的】克隆骆驼补体C3d基因,分析序列特征,为其佐剂效应研究提供依据。【方法】利用Trizol试剂,从骆驼肝脏组织提取总RNA,并反转录获得cDNA。设计C3d特异引物,应用PCR技术扩增C3d序列,构建到pMD18-T载体。将重组质粒转入感受态菌株并双酶切鉴定。使用ClustW,DNAstar, Swiss-Model软件对构建的重组C3d基因序列进行同源性比对,建立系统进化树并对其二级和三级结构进行预测和分析。【结果】采用骆驼C3d特异引物,PCR扩增获得大小为909 bp的骆驼补体C3d基因。构建至T载体并转入大肠杆菌,获得阳性转化克隆。克隆的新疆双峰驼C3d序列与骆驼科C3d基因之间的同源性在97%以上,与牛和猪C3d基因同源性为88%,与兔和人的C3d基因同源性为83%。对骆驼C3d蛋白采用Swiss-Model软件进行序列分析,预测该蛋白质的二级结构主要由α-螺旋和β-折叠组成,该蛋白可能具有良好的免疫原性和免疫结合活性。【结论】C3d基因在进化中较为保守,在骆驼免疫中可以采用亲缘关系较近的其他动物来源的C3d作为分子佐剂从而增强骆驼免疫效果。     

鸡血清IgG纯化方法研究

[目的]为了获得高纯度鸡免疫球蛋白(Ig),并保持其生物学活性。[方法]比较几种纯化鸡血清免疫球蛋白(IgG)的方法。用饱和硫酸铵(NH4)2SO4沉淀法或乙醇沉淀法提取鸡血清IgG,经透析除盐,将初提物过sephadexG-200柱进一步分离IgG,经免疫电泳和SDS-PAGE电泳进行纯度鉴定。[结果]结果表明:在该试验条件下,(NH4)2SO4盐析和乙醇沉淀法获得的鸡IgG经sephadexG200柱分离获得高纯度的鸡IgG。[结论]该研究为找到较好的纯化鸡血清IgG方法提供了试验依据。     

FAT/CD36融合蛋白的表达及其对鸡腹脂沉积的特异性调控

 【目的】脂肪酸转位酶（fatty acid translocase,FAT/CD36）是介导脂肪酸跨膜转运和脂肪细胞聚脂的重要载体蛋白。本试验采用主动免疫法研究FAT/CD36在鸡脂肪沉积调控中的作用。【方法】将FAT/CD36膜外区抗原表位基因片段克隆入表达载体pET-32a(+),并转化在大肠杆菌BL21（DE3）,构建FAT/CD36融合蛋白表达载体。主动免疫试验选取22日龄黄羽肉鸡60只,按公、母各随机分为2组,共4组。公鸡和母鸡的试验组分别在第34、49、和63天肌肉注射1 mg重组鸡FAT/CD36融合蛋白,以牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）为对照。【结果】重组菌表达分子量约为29 kD的鸡FAT/CD36融合蛋白,在0.1 mmol?L-1 IPTG诱导6 h后,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的32%。表达产物主要以包涵体的形式存在,经纯化并透析复性后得到高纯度的FAT/CD36融合蛋白。主动免疫后,公鸡和母鸡试验组的血清抗FAT/CD36抗体水平逐渐升高,并在首次免疫后显著高于各自对照组。主动免疫FAT/CD36能特异性降低公鸡的腹脂率,但对母鸡无显著性影响。试验组与对照组皮下脂肪厚度差异不显著。【结论】FAT/CD36对鸡脂肪调控具有典型的性别特异性和部位差异。试验结果为进一步阐明禽类脂肪组织特异性沉积的分子机制提供理论依据。     

Cytotoxic effects of leukocyres triggered by complement bound to target cells

Chromium-51-labeled chicken erythrocytes (E), treated with rabbit anti-Forssman antibody (A) and the first four (C1-4) or the first seven (C1-7) components of human complement (C), released isotope upon exposure to human leukocytes. Isotope release from EACJ-7 cells proceeded more rapidly and was more extensive than that from EACI-3 cells. Lysis of these cells was suppressed by pretreatment of leukocytes with antimycinA. Monocyte-enriched leukocyte preparations affected both types of target cell-complement intermediates, whereas purified lymphocytes lysed EACI-7 cells but not EACI-3 cells.     

新疆焉耆县不同动物源耐药沙门氏菌的MLST分析

为了解新疆焉耆县不同动物源沙门氏菌（Salmonella）对临床常用抗菌药物耐药和携带耐药基因的情况，以及不同动物源耐药沙门氏菌之间的亲缘关系，从新疆焉耆县几个规模化养殖场分别采集鸡、牛、猪及羊肛拭子样；对样品中分离出的沙门氏菌运用琼脂稀释法进行13种抗菌药物的最小抑菌浓度测定；并对耐药菌株通过PCR方法进行相关耐药基因的检测；采用MLST方法分析不同动物源耐药沙门氏菌之间的亲缘关系。结果显示：①分离鸡源沙门氏菌110株（27.5%；110/400），牛源沙门氏菌63株（64.9%；63/97），猪源沙门氏菌40株（10.0%；40/400），羊源沙门氏菌17株（6.8%；17/250）。②牛源沙门氏菌对氨苄西林、卡那霉素以及氟苯尼考这3种抗菌药物的耐药率均在50.0%以上，以7耐（33.3%）为主；猪源沙门氏菌对四环素的耐药率高于本地区其他动物源菌，多药耐药结果显示在0耐~7耐均有分布。③牛源沙门氏菌和羊源沙门氏菌中blaTEM、blaOXA、oqxA、oqxB、aac(6′)-Ib-cr、ant(3″)-Ia、aadA2和tetB基因的携带率高于鸡源和猪源沙门氏菌的携带率，但blaCMY-2、qnrB、qnrS和tetA这4种耐药基因仅在猪源沙门氏菌中检出。④筛选出8株多药耐药且携带多种耐药基因的沙门氏菌，MLST分析发现8株菌的ST型均为ST34，进化树分析显示它们之间存在较近的亲缘关系。结果表明，焉耆县被检养殖场的动物粪便中均分离出沙门氏菌，且对13种不同抗菌药物表现出不同程度的耐药，存在多种耐药基因共存的情况，不同动物源耐药沙门氏菌间存在克隆传播的机制。     

固始鸡脐带间充质干细胞原代培养及其诱导分化潜能研究

为了研究固始鸡脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs）的生物学特性和诱导分化,对其进行原代培养及定向诱导分化研究。选取14日龄固始鸡鸡胚的脐带组织,剥离脐带动、静脉,将华通胶部分剪成1 mm³大小,采用胶原酶消化法分离细胞并进行原代培养,观察细胞形态,绘制P3、P9、P15代生长曲线并测定群体倍增时间及克隆形成能力。结果表明,固始鸡UCMSCs形态为长梭形,生长趋势符合Logistic生长曲线规律,呈典型的S形;免疫荧光和RT-PCR结果显示,固始鸡UCMSCs表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD166等间充质干细胞表面标记物基因,但不表达原始造血祖细胞标志物CD34和泛白细胞标志物CD45;经特异性染色和RT-PCR表明,体外诱导固始鸡UCMSCs可分化为脂肪、成骨和成软骨细胞。从固始鸡脐带华通胶中分离所获得的UCMSCs具有良好的体外增殖能力和分化潜能,与从其他物种体内分离的UCMSCs具有相似的生物学特征,它们的多项分化能力预示着细胞移植的应用前景,可为再生医学和组织工程学提供新的潜在种子细胞。     

鸡胚胎期糖酵解关键酶mRNA的动态变化规律

在白色莱航鸡孵化第13d~21d期间,每天随机选取7个-8个胚胎,从中随机选取3个胚胎,分别采肝脏和骨骼肌样品(n=3),用Primer Express2.0(Applied Biosystem)和BLAST(NCBI)软件设计引物,从采取的肝脏和骨骼肌样品中分离出总RNA,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)法,合成cDNA。并应用限制性内切酶产物琼脂糖凝胶电泳法和核酸序列分析法对其进行同源性分析和鉴定目的片段。分别对其肝脏和骨骼肌中葡萄糖激酶、己糖激酶-I和己糖激酶-II的mRNA进行定量分析,旨在了解鸡胚胎发育过程中糖酵解关键酶的mRNA表达规律。结果表明:在孵化期的第13d~21d,鸡胚胎肝脏中葡萄糖激酶、己糖激酶-I和己糖激酶-II的mRNA含量均高于骨骼肌中的含量,但差异不显著(p>0.05)。孵化第17d时肝脏中葡萄糖激酶mRNA的含量明显减少(p<0.05),之后缓慢增加,到第21d时其含量仍低于第13d~15d时的含量;肝脏中己糖激酶-I mRNA在孵化第15d明显减少,之后缓慢增加,到孵化第19d时与第13d的含量接近;在孵化第13d~17d期间,肝脏中己糖激酶-II mRNA含量基本没有变化,到孵化第19d时略有升高,但差异均无显著(p>0.05)。骨骼肌中的3个关键酶的mRNA表达,在整个胚胎发育期均无明显的变化(p>0.05)。