AA肉鸡补体C3d基因cDNA的克隆及鉴定

为获得鸡C3d基因的cDNA,从鸡肝细胞提取总RNA,通过RT-PCR扩增出C3d基因的cDNA,脂糖凝胶电泳鉴定后直接克隆到pMD18-T载体,构建C3d-pMD18-T重组质粒,转化大肠杆菌,酶切鉴定后进行序列测定。通过琼脂糖凝胶电泳证明有1.0 kb左右的PCR扩增片段,序列测定表明为C3d基因的cDNA。通过RT-PCR法从鸡肝细胞RNA中成功地扩增到鸡C3d基因的cDNA,为进一步构建基于C3d基因内佐剂的疫苗奠定了基础。     

鸡Mx基因全长cDNA序列的克隆及分析

以Poly(I)-Poly(C)诱导鸡成纤维细胞Mx基因的表达,提取总RNA,RT-PCR扩增出全长Mx cDNA,扩增产物克隆入pMD19-T Simple载体中进行序列测定。结果表明:与GenBank公布的鸡Mx cDNA序列相比,其同源性达99.9%,为进一步研究鸡Mx基因的抗病毒活性和作用机理奠定了基础。     

银狐Gdf8基因cDNA的克隆与序列分析

根据已报道的犬科狗的Gdf8基因cDNA编码序列设计一对引物,利用RT—PCR技术扩增银狐的Gdf8基因cDNA的编码序列,将PCR产物连接到质粒pMD18-T载体上,然后转化到JM109大肠杆茵中,得到阳性克隆,同时进行序列的测定和分析。测序结果与已报道的Gdf8基因cDNA编码序列的大小相同,为1128bp。该序列与狗的同源性为99．2％,仅有9个核苷酸差异,推断的氨基酸序列仅有3个差异。     

鸡卵清蛋白5''端调控区的克隆和序列分析

通过PCR技术从产蛋鸡输卵管基因组中扩增出1．1kb的鸡卵清蛋白5’调控区，将其克隆入pMD18-T载体的多克隆位点(命名为pOV)，经酶切鉴定和序列测定可作为调控序列来启动外源基因的表达。为下一步构建其调控外源基因的质粒表达载体作准备。     

绵羊角蛋白中间丝基因KIF1.2的克隆及序列分析

为了分析南疆地方品种羊和田羊毛囊角蛋白中间丝KIFI.2基因,以和田羊为实验动物,从绵阳毛囊中提取总RNA,利用反转录获得的cDNA第一链为模板,通过PCR扩增KIF1.2基因,插入pMD18-T克隆载体中经限制性内切酶双酶切和PCR检测双重鉴定并测定序列.结果,扩增出序列长度为1215 bp的基因片段,测序结果与GenBank上已公布的序列同源性为99％.该实验研究将为进一步通过基因和蛋白的调节来改良南疆地方品种羊和田羊羊毛品质提供必要的理论依据.     

五指山小型猪生长激素释放激素受体基因的cDNA克隆及序列分析

[目的]克隆五指山小型猪生长激素释放激素（GHRH）受体基因的cDNA,并对其进行序列分析。[方法]以五指山小型猪耳组织提取的基因纽RNA为模板,根据已报道的猪GHRHRcDNA序列设计3对引物,用RT—PCR方法进行cDNA扩增。PCR产物经回收纯化后,与pMD18-T连接并转化大肠杆菌DH5a,转化产物经PCR和双酶切鉴定后筛选出阳性克隆,阳性克隆经LB液体培养基培养鉴定后测序。[结果]成功获得了五指山小型猪GHRH受体基因的cDNA,该片段长1577bp,编码423个氨基酸。BLAST分析结果表明,该片段与猪GHRH受体基因仅有23个碱基的差异,同源性为98％;而两者GHRH受体基因均由423个氨基酸组成,序列同源性为96％。[结论]该研究为进一步揭示五指山小型猪的矮小机理提供了理论依据。     

气肿疽梭菌鞭毛基因克隆载体的构建

根据GenBank中发表的气肿疽鞭毛蛋白的结构基因FliA(C)的序列,从中截取抗原表位部分基因序列,设计合成1对引物,引物的5`和3`端分别加入了BamHⅠ和XhoⅠ2个酶切位点。通过降落PCR法扩增合成长度为429bp的目的基因片段。将PCR产物克隆于pMD18-T simple载体,之后将其转入大肠杆菌DH 5α感受态细胞筛选阳性克隆。提取扩增后的重组质粒pMD18-T-FliA(C)并进行PCR鉴定、酶切鉴定及序列测定。结果表明:扩增的目的基因与GenBank登录的ATCC10092菌株序列同源性为99%,4个碱基不同,仅有1个氨基酸不同。测出的基因序列发表于GenBank,登录号为KF712490。试验证明用降落PCR方法能方便、快速、准确的获得目的基因片段。本试验成功构建了重组克隆载体pMD18-T-FliA(C),为气肿疽鞭毛蛋白的表达载体构建及鞭毛蛋白亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

新疆双峰驼C3d基因cDNA的克隆与序列分析

【目的】克隆骆驼补体C3d基因,分析序列特征,为其佐剂效应研究提供依据。【方法】利用Trizol试剂,从骆驼肝脏组织提取总RNA,并反转录获得cDNA。设计C3d特异引物,应用PCR技术扩增C3d序列,构建到pMD18-T载体。将重组质粒转入感受态菌株并双酶切鉴定。使用ClustW,DNAstar, Swiss-Model软件对构建的重组C3d基因序列进行同源性比对,建立系统进化树并对其二级和三级结构进行预测和分析。【结果】采用骆驼C3d特异引物,PCR扩增获得大小为909 bp的骆驼补体C3d基因。构建至T载体并转入大肠杆菌,获得阳性转化克隆。克隆的新疆双峰驼C3d序列与骆驼科C3d基因之间的同源性在97%以上,与牛和猪C3d基因同源性为88%,与兔和人的C3d基因同源性为83%。对骆驼C3d蛋白采用Swiss-Model软件进行序列分析,预测该蛋白质的二级结构主要由α-螺旋和β-折叠组成,该蛋白可能具有良好的免疫原性和免疫结合活性。【结论】C3d基因在进化中较为保守,在骆驼免疫中可以采用亲缘关系较近的其他动物来源的C3d作为分子佐剂从而增强骆驼免疫效果。     

鸡传染性支气管炎病毒M基因真核表达载体的构建及免疫效力研究

从GenBank上下载鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H120型标准株M基因的标准序列,以此标准序列为模板设计合成一对引物。从IBV尿囊液中提取总RNA,采用PCR技术扩增出M基因,将扩增出的目的片段克隆至pMD18-T载体上获得pMD18-IBV-M质粒,通过亚克隆将目的基因连接到经过改造的pEGFP-C1-SCP-SEC载体上,成功构建真核表达质粒pC1-IBV-M。通过间接免疫荧光试验验证了构建的真核载体能在真核细胞内表达,通过动物免疫试验来检测该真核表达载体对动物的免疫保护情况。     

人促凋亡蛋白基因bax的克隆与原核表达

以人促凋亡蛋白基因bax全长转录本eDNA为模板,经PCR扩增得到bax基因,将其克隆到pMD18-T,并构建原核表达质粒栽体pGEX-4T-1-Bax,转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达.PCR扩增、双酶切鉴定他测序结果均显示bax基因已被成功克隆到表达载体中,表这产物经SDS-PAGE检测,证实为GST-Bax融合蛋白.     

牛瑟氏泰勒虫热休克蛋白基因的克隆与序列分析

从病牛血液中提取总RNA,根据GenBank上发表的牛瑟氏泰勒虫HSP70基因序列设计合成1对引物,通过RT—PCR技术扩增出牛瑟氏泰勒虫HSP70基因,并将该基因克隆到pMD18-TSimple载体上,经PCR鉴定和EcoR工、Sal工双酶切鉴定为阳性的重组质粒测定及分析结果表明,该片段长1966bp,编码620个氨基酸残基．同源性分析表明,该序列与牛瑟氏泰勒虫HSP70基因同源性为95．78％．     

水牛垂体催乳素cDNA的克隆与序列分析

根据GenBank中报道的几种哺乳动物催乳素（PRL）基因序列，设计1对特异性引物。从广西本地水牛脑垂体中提取总RNA，利用RT—PCR技术扩增水牛PRLeDNA全序列，并连接到pMD18-T载体，经PCR和酶切鉴定的阳性克隆进行测序，测定结果表明：该eDNA开放阅读框（ORF），长度为690bp，编码氨基酸为229个，其中前19个氨基酸为信号肽。用NCBI上的Blast功能将测序结果同GenBank已发表的序列进行比对，具有很高的同源性，其中与牛属动物同源性最高，达98．4％，证明所克隆的序列为水牛PRLeDNA全序列，已提交到GenBank（登陆号：EF054878）。本研究成功克隆水牛PRLeDNA全序列，为下一步构建原核表达载体、表达体外蛋白，以及进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

山区型和田羊毛囊KAP1.1基因表达载体构建及生物信息学分析

为了分析山区型和田羊毛囊角蛋白关联蛋白(Keratin associated protein, KAP1.1)基因对绵羊羊毛产量与品质的影响。以山区型和田羊皮肤毛囊为试验材料,提取总RNA,反转录获得cDNA,PCR扩增毛囊KAP1.1基因,插入pMD18-T载体,构建pMD18-T-KAP1.1克隆质粒,双酶切鉴定后构建pEGFP-N l-KAP1.1真核表达重组质粒,做PCR、双酶切鉴定后送公司测序,并进行生物信息学分析。结果表明:成功构建了pEGFP-N l-KAP1.1真核表达重组质粒,获得了山区型和田羊毛囊KAP1.1基因编码序列,片段全长为519 bp,编码172个氨基酸。与GenBank中美利奴绵羊序列比对,碱基序列同源性达98.85%,氨基酸序列同源性达97.09%。说明试验成功构建了毛囊KAP1.1真核表达载体,并获知了山区型和田羊KAP 1.1基因与蛋白序列。     

H5N1亚型禽流感病毒核蛋白基因的克隆及分子进化分析

用RT—PCR法，以1株H5N1。亚型禽流感病毒RNA为模板，扩增了NP全基因cDNA。将NP cDNA克隆于pMD18-T载体，并对其进行测序。测序结果表明：所克隆的NP基因全长1542bp，该核苷酸的片段包含了核蛋白完整阅读框架，其中编码区为1497个核苷酸，编码498个氨基酸。将其序列与6株A型流感病毒NP基因序列进行比较，各毒株之间NP基因核苷酸序列同源性为92．5％～95．9％，编码的氨基酸同源性为97．0％～98．4％。通过分子进化分析揭示了各毒株间的亲源关系。     

犬白细胞介素-21基因的扩增和测序

无菌抽取犬外周血,分离单核细胞,经PHA刺激后收集细胞,使用Trizol提取细胞总RNA;利用自行设计的引物,反转录合成cDNA第1条链,PCR扩增出长约441 bp的白细胞介素-21(IL-21)基因带。经纯化回收,将基因克隆至pMD18-T,筛选阳性克隆测序证明扩增的cDNA的序列与已报道的序列相一致。     

鸡γ干扰素在酵母中的分泌表达

根据GenBank已发表的鸡γ干扰素（ChIFN-γ）eDNA基因序列设计一对引物,以ConA刺激8h后的鸡全血淋巴细胞提取的总RNA为模板．通过RT—PCR方法克隆出ChIFN-γ基因,将其连接到pMD18-T载体上获得阳性重组质粒。测序结果表明,该ChIFN-γ与GenBank上发表的ChIFN-γ序列的同源性可达99．6％,其含有1个495bp的开放性阅读框架,编码164个氨基酸。通过KpnⅠ和NotⅠ两个酶切位点将该基因插入酵母表达载体（pPICZa—A）,并将该重组酵母ChIFN-γ载体线性化,通过电转化使ChIFN-γ基因整合到酵母（X-33）基因组上,经甲醇诱导后,成功表达出ChIFN-γ。利用Western—blotting分析测定表达的ChIFN-γ蛋白的活性。结果表明,本试验得到的重组酵母ChIFN-γ是具有反应原性的蛋白。     

山羊痘病毒TK基因的克隆与序列分析

设计特异性引物并应用PCR方法扩增山羊痘病毒QL、LD、Y、B株TK基因序列片段,将其克隆至pMD 18-T载体,构建重组质粒pMD18-T-TK.再将该重组质粒转化DH5α感受态细胞进行培养,对通过PCR、酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定.TK基因核苷酸和氨基酸同源性分析表明,4株测序毒株TK基因与参考毒株的同源性均为96.6%～100%,说明羊痘病毒TK基因具有高度的保守性.     

油菜菌核病菌激发子基因SsXYN克隆及表达载体构建

以核盘菌菌株NGA4提取的总RNA为模版,利用RT-PCR技术扩增获得SsXYN基因的全长cDNA片段,将其克隆到pMD19-T载体上,菌落PCR、酶切鉴定和cDNA测序结果表明成功克隆了核盘菌SsXYN基因。从pMD19-T:SsXYN载体上,用BamH I和Sal I双酶切切下目的基因片段,将该基因片段连接到原核表达载体pET32a中。菌落PCR和酶切鉴定结果显示成功构建了表达载体pET32a:SsXYN。利用热击法将该重组表达载体导入大肠杆菌BL21,获得携带SsXYN基因的大肠杆菌菌株,为进一步研究激发子诱发植物抗病性机理奠定了基础。     

鹅细小病毒野毒的分离及VP3基因的克隆及序列分析

试验对吉林省农安县某鹅场发现的疑似鹅细小病毒病进行了野毒的分离与鉴定,并以鹅细小病毒标准毒B株染色体DNA为模板,对VP3成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增,获得了1603bp的DNA片段。通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pMD18-T克隆载体。经鉴定证实,成功地构建了pMD18-T-VP3克隆载体。序列分析结果表明,该基因序列与鹅细小病毒标准毒B株的VP3成熟蛋白基因序列同源性为98%。