转病毒移动蛋白及复制酶基因烟草的协生和重组风险分析

 对转化番茄花叶病毒 (ToMV)、烟草花叶病毒 (TMV)移动蛋白 (MP)基因和黄瓜花叶病毒P1株系(CMV P1)部分复制酶基因的 3种转基因烟草 ,分别接种马铃薯X病毒 (PVX)、马铃薯Y病毒 (PVY)、CMVRB株系 (CMV RB)和TMV。症状观察和ELISA测定发现 ,各病毒在转基因烟草和非转基因烟草上的症状及病毒浓度没有显著差异 ,表明这些病毒在转基因烟草上没有协生作用发生。对转化ToMVMP基因和转化CMV P1部分复制酶基因的转基因烟草 ,分别接种TMV和CMV RB ,定期进行生物学、ELISA和免疫捕获反转录PCR(IC RT PCR)检测 ,在 16个月的连续测定中未发现病毒重组现象。     

抗TMV、CMV转基因烟草的初步选育

将烟草花叶病毒复制酶54 KD蛋白基因构建到质粒pSSZ32.54K,导入根癌农杆菌EHA105株系,用农杆菌介导的叶盘法转化含CMV CP基因的纯合系烟草,获得了含CMV CP基因和TMV RepE基因的转基因烟草,以及只含TMV RepE基因的转基因烟草.以繁殖于新鲜普通烟叶片上的TMV为毒源,机械摩擦接种含双基因的烟草和只含CMV CP基因的烟草.接种15 d后,观察植株发病情况,发现转双基因的烟草无花叶症状出现,而对照植株(只含CMV CP基因)出现花叶症状.通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测病毒含量,发现转基因植株体内无病毒积累,而对照植株体内有病毒积累.因此,含RepE基因的烟草对TMV有一定抗性.     

PtWRKY14 基因转化烟草及对 TMV 的抗性影响研究

PtWRKY14 是从毛白杨中获得的WRKY 基因,为研究PtWRKY14 基因对植物抗病性的影响,构建了毛 白杨PtWRKY14 基因的植物表达载体pBI121-W14,通过农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草,PCR 与Southern 杂交 进行转基因烟草鉴定。对获得的转基因烟草植株进行烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV）的接种试验,结果表 明PtWRKY14 基因的转化使烟草对TMV 的抗性增强。荧光定量PCR 检测结果表明,TMV 接种后,转基因烟草中 PtWRKY14 的表达量显著上调,同时转基因烟草中超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD）、过氧化物酶(Peroxidase,POD）、过氧化氢酶(Catalase,CAT）的表达量均高于对照组。因此,PtWRKY14 可能通过上调SOD、POD、 CAT 的表达从而增强植物抗病性。     

烟草种质资源TI203对烟草花叶病的抗性特点

[目的]系统了解烟草种质资源TI203抗烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)的特点,为烟草抗病育种的亲本选择提供更丰富信息.[方法]以烟草种质资源TI203为材料,采用TMV病毒接种、病情调查、病毒外壳蛋白累计量检测、TMV复制水平测定及日灼现象观察等方法,研究TI203对TMV的抗性特异性、TI203接种TMV普通株系(TMV-U1株系)后的症状、病毒复制水平等.[结果]TI203只对TMV表现无症状的抗病特点,接种马铃薯Y病毒(PVY)和黄瓜花叶病毒(CMV)则表现出典型症状.接种TMV-U1株系后14 d,Western blotting检测结果显示,TI203叶片病毒复制水平明显低于对照品种;用表达GFP的TMV侵染性克隆浸润接种发现,TI203对TMV的抗性发生在病毒复制水平.在高温和强日照条件下,TI203生长迅速的中上部叶片会发生日灼现象,且难以恢复.[结论]TI203只对TMV表现无症状,其对TMV的抗性发生在病毒复制水平.     

苋色藜NDR1基因抗病毒特性初步研究

以抗病毒植物苋色藜为材料,克隆拟南芥NDR1的同源基因,确定其亚细胞定位及该基因表达和抗病毒特性分析,为转基因抗病育种奠定技术基础。根据苋色藜转录组测序分析结果,采用RT\|PCR克隆获得两个与拟南芥同源的NDR1基因,分别命名为CaNDR1a和CaNDR1b,并通过实时定量PCR分析病毒侵染后基因的表达情况;构建植物瞬时表达载体,发现CaNDR1a和CaNDR1b定位于细胞膜;构建CaNDR1a和CaNDR1b植物表达载体,遗传转化获得转基因烟草,经酶联免疫吸附测定（ELISA）分析T1代植株对烟草花叶病毒（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）的抗性。生物信息学分析揭示CaNDR1a和CaNDR1b是NDR1的同源基因。CaNDR1a和CaNDR1b在苋色藜接种TMV和CMV后显著上调表达。CaNDR1a和CaNDR1b定位于细胞膜上,并且病毒对CaNDR1a和CaNDR1b的胞内定位没有影响。ELISA结果显示部分转基因株系对TMV和CMV的抗性增加。初步表明CaNDR1a和CaNDR1b是拟南芥NDR1的功能性同源基因,参与植物对病毒的内源免疫反应。     

转截短hpalXoo基因烟草抗病防御酶活性分析

[目的]探讨转截短hpalXoo基因烟草中与抗病性有关的5种防御酶系的活性变化.[方法]以转截短hpalXoo基因烟草A6-1和对应的非转基因烟草Xanthi叶片为材料,接种烟草花叶病毒（TMV）,测定苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）的活性.[结果]未接TMV时,转截短hpalXoo基因烟草中POD、PPO和CAT酶活性均高于未转基因对照品种,而SOD和PAL活性与未转基因烟草无显著差异.接种TMV后,转截短hpalXoo基因烟草中5种防御酶活性均显著增加,且高于未转基因烟草,并维持在一个较高的水平.[结论]截短的hpalXoo基因在烟草中表达能显著提高其抗病防御酶活性水平.     

ChIFN-α基因在烟草中的表达及转基因烟草对TMV的抗性

动物α干扰素具有高效广谱的抗病毒作用,通过农杆菌介导法将35S驱动的干扰素基因ChIFN-α转化烟草,Southern杂交和Western杂交进行目的基因的转化、表达检测,重组蛋白的数量通过ELISA测定,对获得的转基因烟草植株进行TMV接种实验,结果表明ChIFN-α基因的转化赋予了转基因烟草对TMV的抗性,进一步的荧光定量PCR差异表达检测结果表明,该抗性可能与转基因烟草体内防卫基因PR-la、抗病N基因和信号转导MAPK基因受到上调表达有关。     

hrpZPsg12转基因烟草及其抗性评价

【目的】将来源于大豆细菌性斑点病菌(Pseudomonas syringae pv.glycinea)Psg12菌株的hrpZPsg12基因导入烟草"云烟87",对转化植株进行烟草普通花叶病毒(TMV)、烟草马铃薯Y病毒(PVY)和烟草野火病菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci)的抗病性鉴定,为培育多抗烟草新品系奠定基础。【方法】采用农杆菌介导法,将hrpZPsg12基因转入烟草"云烟87"中,对T0和T1代转基因植株进行PCR检测、Southern杂交,并对T1代转基因植株的抗病性进行评价。【结果】hrpZPsg12基因成功转入"云烟87"中,PCR检测表明共获得7株T0代阳性植株、35株T1代阳性植株。对T1代PCR阳性植株进行Southern检测,表明外源目的基因hrpZPsg12已经整合进烟草基因组中,并可在转基因后代植株中稳定遗传。抗病性测定表明,T1代转基因烟草对TMV和PVY表现高抗,对烟草野火病表现中抗。【结论】获得了高抗TMV和PVY及中抗烟草野火病菌的转hrpZPsg12基因植株20和15株。     

多抗PVY、TMV和CMV转基因烟草的培育

 【目的】利用RNA介导抗性培育抗多种植物病毒的转基因烟草。【方法】分别以马铃薯Y病毒（PVY）、烟草花叶病毒（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）全长衣壳蛋白（CP）基因为模板,通过设计PCR引物和亚克隆获得PVY CP 3′端长度100 bp、TMV CP 3′端长度100 bp和CMV CP 3′端长度200 bp的cDNA片段并拼接成嵌合基因,并以此为模板构建反向重复结构嵌合基因的植物表达载体pRHPTC。将pRHPTC通过冻融法导入农杆菌LBA4404,采用叶盘法转化烟草NC89,然后测定转基因烟草对3种病毒的抗性。【结果】经卡那霉素筛选和PCR检测,共获得276株转基因烟草。Southern和Northern blot分析表明,外源基因以不同拷贝数整合于烟草基因组中;不同转基因植株中病毒RNA的积累量存在显著差异。抗病性检测显示：23%左右的转基因植株表现出对3种病毒侵染的抗性。对转基因植株扩繁后代和T1代的抗性分析表明：多病毒抗性表现稳定。【结论】利用RNA介导的抗病毒基因工程可获得同时抗多种病毒的转基因烟草,其抗病性在T0代扩繁植株和T1代植株中得到稳定遗传。     

抗烟草花叶病毒(TMV)转基因烟草的初步选育

 病毒病是云南烤烟生产上的重要病害,目前尚无有效的防治手段,本研究试图采用植物基因工程技术,将TMV54KD蛋白基因转人云南烤烟栽培品种,获得抗TMV的转基因植株,减少由TMV危害造成的重大经济损失,用携带植物抗病毒基因表达载体的根癌农杆菌LBA4404菌株转化云南烤烟栽培品种红花大金元,获得了大量转基因植株,戴体质粒上含有卡那霉素抗性标记基因(NPTII)和CaMV35s启动子控制的烟草花叶病毒(TMV) 54KD蛋白基因,烟草叶片与携带载体质粒的根癌农杆菌共培养后,将其转移到含50μg/ml卡那霉素(Km)的MS+2.0mg/m16-BA+0.1mg/LNAA培养基上培养筛选,2-3周后分化出芽,切下小芽转移到含50μg/ml卡那霉素的MS+0.2mg/ml NAA的培养上进一步培养基筛选并使转化体生根,再对生根植株叶片进行Km抗性鉴定,结果表明,Km抗性标记基因(NPTII)在烤烟植株中已得以表达,间接证明TMV54KD蛋白基因已整合到烤烟植株的基因组中,抗性鉴定结果表明,转基因植株对TMV摩擦接种表现出明显抗性,选择抗性植株,单株收种子,以对其后代抗性的遗传稳定性研究.     

NtMAP70基因在烟草抗马铃薯Y病毒过程中的作用

为了探明微管结合蛋白70(MAP70)在抗马铃薯Y病毒(PVY)中的作用机制,克隆了烟草Nt MAP70基因的全长,并进行了生物信息学分析.利用实时荧光定量PCR研究了该基因在烟草不同时期和不同部位中的表达水平,结果表明,NtMAP70在烟草的各个生长期均有表达,且在根中的表达量最高.构建了基于双生病毒卫星诱导的烟草Nt MAP70的沉默载体,以中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)为辅助病毒在烟草中沉默了该基因.与对照相比,在Nt MAP70基因沉默的烟草中PVY侵染速率明显减缓,病毒含量显著降低.     

烟草花叶病毒移动蛋白基因转化烟草及在转基因烟草中的表达

根据烟草花叶病毒蚕豆株系（TMV-B）的已知序列合成引物，经PCR扩增获得TMV-B的移动蛋白（MP）基因。该基因测序验证后，分别以正、反向克隆到植物表达载体pBI121中，并置于CaMV35S启动子控制之下，通过三亲交配及叶盘转化，将MP基因导入烟草。经卡那霉素抗性筛选，PCR扩增，Southern点杂交,Northern点杂交及Westernblot检测，获得了正义表达MP基因及反义表达MP基因的转基因烟草，分别命名为pTMP（+）烟草和pTMP（-）烟草。     

烟草转GroEL基因抗双生病毒的研究

双生病毒是全球性的重要植物病毒,为提高植物对此病毒的抗性,分离了烟粉虱体内GroEL基因,将其连接到棉花韧皮部特异启动子PGHNBS下游,构建到植物表达载体PBI121上,采用农杆菌介导法转化烟草,获得抗性苗.对抗性植株进行PCR、RT-PCR和病毒侵染检测,结果表明:GroEL基因已经整合到烟草基因组中,并且在转录水平上表达.病毒侵染检测结果显示转基因烟草植株中没有检测到病毒,证明韧皮部特异表达GroEL基因抗双生病毒是可行的.     

茶树咖啡碱合成酶基因cDNA在烟草中的表达

为了在烟草中合成咖啡碱,将咖啡碱合成酶(Tea caffeine synthase,TCS)基因cDNA全序列克隆到双元载体pBI121中,通过农杆菌叶盘转化法将TCS基因成功转入烟草,结果得到72株转基因烟草植株。对其中3株转基因植株进行PCR检测和PCR-Southern检测,证实TCS基因已整合到基因组中;RT-PCR和Northern分析显示,TCS在这些植株中均能正常转录。用从转基因植株中提取的粗酶液进行体外酶促反应,能催化7-甲基黄嘌呤和可可碱向咖啡碱的转变,由此表明,转基因烟草植株中能产生具有正常生物学活性的TCS,但从3株转基因烟草中均未检测到咖啡碱。     

MAP30基因转化烟草的研究

通过转基因技术,利用农杆菌介导法,将pBIMAP30植物表达载体转化烟草,Kan筛选抗性苗,选择植株健壮、根系发达的抗性植株,提取叶片DNA进行PCR鉴定,获得阳性转基因烟草.采用RT-PCR方法证实MAP30基因能够在转录水平上正常表达.该研究为探讨具有药用价值的植物资源奠定理论基础,并为获得抗病毒、抗肿瘤功能性药物蛋白的植物新品系研发提供一定的技术支持     

苦豆子凝集素基因植物表达载体的构建及其对烟草的转化

[目的]了解苦豆子凝集素基因(SAL)的功能,将该基因构建到植物表达载体并转化烟草,获得转基因植株.[方法]利用RT-PCR技术,提取苦豆子总RNA进行反转录得到cDNA,通过PCR扩增得到苦豆子凝集素基因SAL,并将其克隆到植物表达载体pCAMBIA1301上,产生重组质粒pCAMBIA1301-SAL.采用农杆菌介导法将重组质粒转化烟草,并进行分析鉴定.[结果]构建了植物表达载体pCAMBIA1301-SAL,转化烟草后经筛选获得76株转基因植株,经抗性筛选及PCR和RT-PCR鉴定,其中27株显示为阳性植株.[结论]苦豆子凝集素基因已经在烟草中成功表达,为进一步研究验证转基因烟草的抗病效果奠定了基础.     

转烟草花叶病毒复制酶基因烟草的病毒抗性研究

对用根瘤农杆菌双质粒法导入烟草花叶病毒复制酶基因的转基因烟草后代的研究表明：转基因烟草抗烟草花叶病毒和马铃薯Ｘ病毒,但感染马铃薯Ｙ病毒,抗病毒的转基因烟草存在某种机制限制着病毒在植株内的转移,转烟草花叶病毒复制酶基因烟草植株内不产生该复制酶,其抗病毒的确切机制有等进一步研究。