表达伪狂犬病毒gC糖蛋白基因重组腺病毒的构建及其免疫效果研究

通过双酶切将伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)Fa株gC囊膜糖蛋白基因片断亚克隆到5型腺病毒AdMax系统穿梭质粒pDC316中，得到pDC316-gC。用此质粒与腺病毒DNA辅助质粒pBHGloxΔE1,3Cre共转染293细胞,初步成功包装出重组腺病毒Adv-gC。进一步通过PCR鉴定和病毒空斑纯化，得到纯的高效价Adv-gC病毒液。间接免疫荧光实验证明此重组病毒能表达PRV gC蛋白。该病毒经肌肉免疫BALB/c小鼠,结果表明能诱导小鼠产生特异的体液和细胞免疫反应，即针对gC蛋白的总抗体IgG、针对PRV的中和抗体和足垫迟发型超敏反应DTH。攻毒实验表明，此重组病毒能提供100％的免疫保护，而对照组为0%。表达PRV gC基因复制缺陷型重组腺病毒的构建及其免疫效果的初步测试，为研制PRV新型活载体疫苗奠定了基础。     

猪伪狂犬病毒(PRV)桂B株的分离和鉴定

从广西某市猪场采集发病仔猪大脑、肾、脾等混合病料中分离到一株病毒。病毒接种PK细胞和CER细胞均出现典型细胞病变,引起病变细胞形成台胞体,在PK细胞上毒价为TCID5010-5．3／0．1mL。病毒能被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和,血清中和效价为1：316。病毒接种家兔后出现典型伪狂犬病症状。电镜观察到圆形、有囊膜、直径100～180um大小的病毒颗粒。PCR可扩增出特异性217bP的DNA片移。证实我们所分离到的病毒为伪狂犬病病毒,并命名为猪伪狂犬病病毒桂B株。     

表达伪狂犬病毒gC糖蛋白基因重组腺病毒的构建及其免疫效果

通过双酶切将伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)Fa株gC囊膜糖蛋白基因片段亚克隆到5型腺病毒AdMax系统穿梭质粒pDC316中,得到pDC316-gC。用此质粒与腺病毒DNA辅助质粒pBHGloxΔ E1,3Cre共转染293细胞,包装出重组腺病毒Adv-gC。通过PCR鉴定和病毒空斑纯化,得到纯的高效价Adv-gC病毒液。间接免疫荧光实验证明此重组病毒能表达PRV gC蛋白。该病毒经肌注免疫Balb/c小鼠,能诱导小鼠产生特异的体液和细胞免疫反应。攻毒试验表明,此重组病毒能提供100%的免疫保护。     

猪伪狂犬病gE-ELISA鉴别诊断方法的建立及初步应用

摘要: 为了区分伪狂犬病野毒感染猪与糖蛋白E(gE　)基因缺失疫苗免疫猪，利用大肠杆菌(Eschirchia coli　)BL21(DE3)表达伪狂犬病病毒gE糖蛋白，经纯化、变性、复性等处理后将gE蛋白作为抗原建立了伪狂犬病的gE-ELISA鉴别诊断方法。以该方法检测115份已知背景猪血清，结果表明，该方法诊断特异性为94.5%，诊断敏感性为96.7%。以5块不同批次的包被抗原的酶标板检测5份血清，结果显示阳性血清的变异系数均小于10%，表明该方法重复性好。对比国外阻断gE-ELISA同时检测临床356份猪血清，两者阳性符合率为87.44%（195/223），总符合率为92.13%（328/356）。以上结果表明该gE-ELISA特异、敏感且重复性好，可用于猪伪狂犬病的鉴别诊断。     

含GFP报告基因的伪狂犬病病毒上海株gE-gI基因部分缺失株的构建

在伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV)上海株gI基因和gE基因克隆鉴定的基础上，进一步构建了转移载体质粒，为PRV－SH的gE－gI基因部分缺失毒株的构建作准备，将gI和gE基因克隆入pUC18中构建pgEI载体，利用gE基因中的酶切位点缺失掉gE基因5′端363bp，并把录色荧光蛋白（GFP）基因表达盒插入到缺失部分。通过酶切鉴定，表明GFP基因已3插入到pgEI中，构建了含GFP的缺失转移载体pgEI-GFP。用DOTAP试剂将pgEI-GFP转染感染了PRV－SH株的兔肾（RK）细胞，待出现80％以上的细胞病变时收获病毒，并以GFP为标志，通过蚀斑法得到纯化重组病毒，命名为PFDE／DI。     

应用杆状病毒载体表达狂犬病病毒糖蛋白

本试验利用杆状病毒载体成功地表达狂犬病病毒糖 (G) 蛋白。从转染重组了日本动物用狂犬病病毒疫苗株RC HL株G蛋白基因的转移载体和野生型杆状病毒DNA 的Sf 9 细胞中, 分离出2 个重组杆状病毒克隆。应用印渍法和荧光抗体法(IFA) 从重组杆状病毒感染的Sf 9 细胞检出了狂犬病毒G 蛋白。Sf9 细胞表达的G 蛋白与狂犬病毒RC HL株感染NA 细胞的G蛋白的分子量一致。35 个抗RC HL株G蛋白的单克隆抗体均与重组杆状病毒感染的Sf 9 细胞反应, 表明表达的G蛋白的抗原性没有发生变异。表达的G蛋白主要分布在Sf 9 细胞的膜表面, 形成类似环状的荧光,这种荧光与RC HL株感染的NA 细胞的荧光相同。     

猪伪狂犬病病毒GB株蛋白激酶(PK)基因的克隆及序列分析比较

以伪狂犬病病毒GB株细胞培养物为模板，用PCR方法扩增蛋白激酶(PK)基因，对其进行了克隆、序列测定，并与PRV NIA-3株、Ka株和其他α-疱疹病毒进行了同源性比较。结果显示：所扩增的PK基因片段长1396bp，该片段包含一个开放阅读框(ORF)，长1005bp，编码由334个氨基酸组成的蛋白质。与NIA-3株及Ka株的核苷酸同源性为98．4％和97．5％，基因编码区氨基酸序列的同源性为98．2%和96．4％。具有真核细胞丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶氨基酸亚结构域特征序列，而且α-疱疹病毒PK基因具有一些特征性的、共有的氨基酸序列。为今后研究PK基因的功能和构建PK缺失株奠定了基础。     

PRRSV GP5和M蛋白重组腺病毒对猪的安全性和免疫效力

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) GP5 重组腺病毒(recombinant Adenovirus-GP5,rAd-GP5)和M蛋白重组腺病毒(rAd‐M)分别接种4只30日龄PRRSV阴性断奶健康仔猪，结果为仔猪接种后2周内体温和食欲正常，猪血液、鼻塞、粪便和猪舍环境中重组腺病毒及其野生型腺病毒检测均为阴性。同时，将rAd‐GP5、rAd-M、rAd-GP5+M (rAd-GP5和rAd-M,V/V=1)和PRRSV-Resp弱毒株分别接种4只30日龄PRRSV阴性仔猪，不同时间检测PRRSV抗体，结果为免疫后14和45 d可检出PRRSV ELISA抗体和中和抗体；免疫后60～90 d，rAd-GP5和rAd-M免疫组ELISA抗体滴度均达1∶2400以上，与PRRSV‐Resp弱毒免疫组相似，而中和抗体滴度达1∶6以上，低于PRRSV-Resp弱毒免疫组；rAd-M免疫组ELISA抗体和中和抗体滴度则低于rAd‐GP5免疫组。rAd-GP5和rAd-M混合免疫组ELISA抗体达1∶4800,其中和抗体滴度与其单独免疫组相似。15只仔猪免疫后28 d进行攻毒保护试验，结果为重组腺病毒免疫猪攻毒后3 d平均体温为39.5℃,病毒血症和排毒时间仅为2周，与PRRSV-Resp弱毒免疫组相似，而空白对照组病毒血症和排毒时间至少60 d。攻毒后7～14 d，rAd-GP5和rAd‐M免疫组ELISA抗体和中和抗体水平明显升高。研究表明rAd-GP5和rAd-M重组腺病毒具有较好的安全性，均可诱导猪体产生较好的免疫反应，两者具有明显的协同免疫作用。     

运送鹅源新城疫病毒DNA疫苗的减毒沙门氏菌及其免疫原性

根据GenBank中发表的新城疫病毒融合蛋白(F)基因序列,设计一对引物,通过RT-PCR扩增出鹅源新城疫病毒分离株JS5F基因,约1700bp,测序确认后,将其克隆入真核表达载体pVAX1,得到候选DNA疫苗pVAX1-F0将pVAX1-F转化减毒鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)X4550,获得运送DNA疫苗的重组沙门氏菌X4550(pVAX1-F).以2×108CFU/只的剂量两次免疫CD1小鼠,免疫小鼠可以检测到特异性针对NDVF蛋白的血清抗体应答,X4550(pVAX1-F)免疫组抗体水平显著高于X4550(pVAX1)组(P＜0.05),表明该运送DNA疫苗的减毒沙门氏菌系统在体内能够成功释放所携带的质粒,并能够刺激机体产生免疫应答.     

多重连接探针扩增(MLPA)技术同时检测五种病毒的研究

现有的动物疫病诊断技术多是针对单一病原进行的,而动物疫病的流行却出现了多种病毒混合感染,现有诊断技术不能很好地满足国境口岸快速、高通量检疫的需求,动物疫病多重检测新技术的研究近来已经成为动物疫情监测、疫病控制领域关注的焦点。本研究利用多重连接探针扩增(MLPA)技术特异、敏感、高通量等技术优势,以猪流感病毒(SIV)、伪狂犬病病毒(PRV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪传染性胃肠炎(TGEV)和猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)为研究对象,分别设计了这5种病毒的MLPA探针,将这5种探针混合,建立了可以同时检测这5种病毒的MLPA扩增方法。方法特异性试验表明,针对每种病毒的探针都只能扩增出其对应的病毒模板,其余病毒模板的扩增都是阴性结果;而且,5种探针混合物都只能从单个目的病毒中扩增出单一的特异性条带,而猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的扩增均为阴性。敏感性试验结果表明,5重MLPA扩增的最低检测限可以达到单个病毒核酸3000~6000个拷贝。本研究建立的5种病毒MLPA检测方法在国内外首次实现一次采样,一次分析,检测5种猪病的目的,该技术特异性强,敏感性高,加之其多重性检测优势,有望成为未来疫病检测的新方向。     

两株广西伪狂犬病病毒的分离鉴定

从广西不同地方的发病仔猪脑内分离到两株病毒,分别命名为Ｂ株和Ｗ株。用这两株病毒分别接种家兔,产生的症状和病变与伪狂犬病病毒强毒ＭｉｎＡ株相似。将两株病毒在乳兔肾细胞和ＣＥＲ细胞上连续传代,均稳定地出现与ＭｉｎＡ株相同的细胞病变（ＣＰＥ）。在ＣＥＲ细胞上进行微量血清和试验,ＭｉｎＡ株的抗血清能完全中和Ｂ株和Ｗ株对细胞的致病变作用,表明两个毒株与ＰｒＶ强毒具有相似的抗原性。电镜下观察Ｂ株和Ｗ株病毒粒子     

姬松茸多糖提取工艺的优化

对姬松茸子实体多糖提取的工艺条件中的多糖提取温度、提取时间、浸提液pH值3因子的最优化组合问题进行了定量研究,建立了具有良好预测性能的姬松茸多糖提取条件的模型,并利用回归模型对工艺条件的最优化组合,对各单因子要素的多糖得率及其交互作用进行了探讨。试验表明,当浸提温度为100℃、浸提时间为3h、浸提液pH值为6.3时多糖得率处于较高水平     

植物恢复措施对鸡西矿区废弃地土壤养分的影响

以黑龙江省鸡西市矿区废弃地为研究区,对不同矿区废弃地的土壤养分元素进行含量分析。结果表明：应用植物恢复措施后的基质土壤各养分指标绝大多数要大大高于原废弃地土壤和经过自然恢复的土壤,说明该措施对石墨尾矿、矸石发电厂粉煤灰废弃地和平排矸石山土壤养分改善效果明显;其中石墨尾矿除全磷外,各种养分指标与林地土壤差距较大,而旱柳对石墨尾矿土壤的改善效果最好,其有机质含量为37．28g／kg,是残渣的2．6倍;种植大果沙棘对粉煤灰废弃地土壤养分的积累效果明显,有机质含量为48．25g／kg,是残渣的1．5倍;植物恢复措施使平排矸石山的土壤养分积累速度加快,已接近林地,混交种植兴安落叶松和家榆总体恢复效果最好,有机质含量分别为193．42和151．46g／kg,是自然恢复条件下的8．9和7倍。建议引入优势种群（如松科等）以加快演替速度,使矿区废弃地更快地恢复到原始状态。     

烘焙对生物质热解产物特性的影响

烘焙可有效地降低生物质中的水分和氧,对其热解过程有显著的影响。该文主要研究了烘焙温度（200,230,260,290℃）对生物质热解过程及产物特性的影响行为及影响机制;研究发现烘焙能改善热解产物的品质,随着烘焙温度的升高,热解合成气中CO含量由48%逐渐减少到34%,CH4和H2增加,其中H2含量最大增加了77.4%,而液体产物中,乙酸和水分含量逐渐减小,水分含量最大减少了42.8%,而酚类产物的含量明显增加,有利于生物油品质的提高。该研究为烘焙技术的发展和生物质高效热化学转化提供科学参考。     

青海省耕地资源开发利用分析及对策研究

分析论述了青海省耕地资源开发利用的现状、特点和问题。在此基础上,提出了对青海省耕地资源进行研究的框架体系和思路,同时基于GIS/RS技术设计了相关的技术路线。最后依据所做设计对青海省耕地资源开发利用做了初步分析,并进行了相关的对策研究分析。     

济南山丘区土壤侵蚀潜在危险度景观格局分析

土壤侵蚀潜在危险度景观格局的形成及其变化是自然的和人为的多种因素相互作用的结果 ,运用景观生态学原理 ,通过分析景观斑块的类型、数量、面积大小和空间组合状况 ,揭示出济南市山丘区的土壤侵蚀潜在危险度分布特征及空间变异规律     

稀释介质种类对豆乳蛋白胶体粒子zeta电位测定效果的影响

蛋白粒子zeta电位是衡量豆乳体系稳定性的一个重要指标,而在电位分析前常采用稀释介质对豆乳进行预处理。为了确保zeta电位测定的准确性和科学性,必须选择合适的稀释介质。因此,该研究采用去离子水、豆乳超滤液两种稀释介质分别对豆乳进行稀释,并比较了这2种稀释介质对zeta电位、粒径分布、pH值以及电导率的影响。结果表明,若以去离子水为稀释介质,zeta电位的绝对值会随着稀释倍数的升高而显著增加（*P<0.05）,这主要是由于豆乳蛋白胶体粒子发生解聚导致粒径减小,而pH值的升高和电导率的降低则说明豆乳的离子强度显著降低。相比之下,选用豆乳超滤液稀释豆乳时,体系的 zeta 电位、粒径分布、pH值以及电导率都未随稀释倍数的增加而改变（*P>0.05）,说明此法能够较好地维持豆乳蛋白粒子的荷电稳定性。由此可知,豆乳超滤液可做为豆乳zeta电位测定的理想稀释介质。     

氟对小鼠生精细胞凋亡的影响及锌的保护作用

为观察氟对成年雄性小鼠生精细胞凋亡的影响及锌的保护作用,通过腹腔注射氟化钠建立氟中毒动物模型及锌保护实验。采用石蜡切片、苏木精-伊红染色(HE染色)、末端原位标记(TUNEL)及琼脂糖凝胶电泳的方法检测小鼠生精细胞的凋亡情况。结果显示:(1)氟感染组无论是低剂量组(NaF10 mg/kg)或是高剂量组(NaF 20 mg/kg)生精细胞都发生了明显的凋亡。生精细胞凋亡主要发生在精母细胞和精原细胞,凋亡指数与对照组差异极显著(P<0.05)。(2)无论是高剂量锌(ZnSO430 mg/kg)和低剂量锌(ZnSO415 mg/kg)都可以使凋亡指数明显降低,高剂量锌组的凋亡指数与对照组差异不显著(P>0.05)。