重组欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒疫苗株的构建及免疫保护效力

以国内欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒流行株A/swine/Shanghai/1/2014(H1N1)(SH1)为材料,RT-PCR扩增HA和NA基因并将其克隆至PBD载体中,构建HA和NA基因的重组质粒。将HA和NA基因重组质粒及来源于流感病毒高产株PR8的6个内部基因(PB2、PB1、PA、NP、M和NS)重组质粒共转染293T细胞,从而成功构建了重组欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒疫苗株SH/PR8。以相同病毒剂量接种MDCK细胞,检测不同时间点的血凝效价,绘制病毒生长曲线,结果表明,重组病毒SH/PR8相对于原始野生株SH1在MDCK细胞上具有更高的病毒滴度。重组病毒SH/PR8制备的灭活疫苗经过一免和二免小鼠后,检测血清中血凝抑制抗体、中和抗体和IgG抗体,结果显示首免后抗体效价持续升高,4周后抗体效价达到峰值。小鼠攻毒试验结果表明,免疫组体质量下降不明显且未出现死亡,而非免疫组小鼠体质量持续下降并且于攻毒后6d小鼠出现100%死亡。肺脏组织病毒含量滴定以及组织病理学观察结果显示,免疫组能够有效抑制SH1病毒在肺脏中的复制,减轻肺脏病理变化。总之,本研究表明重组SH/PR8疫苗候选株相对于原始毒株SH1在MDCK细胞上具有更高的复制能力,制备的重组灭活疫苗能够诱导机体产生高水平的抗体,能够针对欧洲禽源H1N1亚型猪流感病毒的攻击提供很好的免疫保护。     

古典H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作平台的建立

利用RT-PCR技术扩增古典H1N1亚型猪流感病毒A/Swine/Guangdong/1/2011株的8个目的基因片段,分别克隆至双向转录表达载体p BD上。将8个重组质粒纯化后共转染293T细胞,48 h后收集上清,接种MDCK细胞。当细胞出现明显病变时,收集MDCK细胞上清,其血凝效价为1:64,与原始野生株血凝效价一致;提取拯救病毒的RNA并进行8个目的片段扩增及序列分析,测序结果显示与野生株病毒相同,表明病毒拯救成功。古典H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作平台的成功建立,不仅为探索流感病毒致病机理、感染机制及功能研究奠定了基础,同时也为H1N1亚型猪流感病毒新型疫苗的研制开辟了新的途径。     

宁夏地区H1N1亚型猪流感病毒基因组遗传进化分析

对宁夏地区2011年分离到的5株H1N1亚型猪流感病毒进行了基因组测定和遗传进化分析。结果显示:宁夏地区H1N1亚型猪流感病毒具有多样性,5株分离株可分为3类,其中1株为类人H1N1猪流感病毒,2株为经典猪流感病毒,另外2株为重组猪流感病毒,其PB2、PB1、PA、NP、NS基因来源于北美三元重组猪流感病毒,HA、NA、M基因来源于经典猪流感病毒;HA蛋白裂解位点附近氨基酸分析显示5株H1N1亚型猪流感分离株均为低致病性毒株;序列分析结果显示5株病毒在HA蛋白受体结合位点、抗原位点,以及NA蛋白潜在糖基化位点处氨基酸存在差异,这些差异具有分支特异性。5株病毒在NA和M2蛋白上均未出现与神经氨酸酶抑制剂和金刚烷胺耐药性相关的氨基酸变异,但其中3株病毒的PB2蛋白基因具有哺乳动物适应性变异E627K。     

三源重组H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作平台的建立

利用RT-PCR技术扩增三源重组H1N1亚型猪流感病毒A/Swine/Tianjin/10/2013(H1N1)的8个基因片段,分别克隆至双向转录/表达载体p BD上。将8个重组质粒纯化后共转染293T细胞,收取转染48 h后的细胞上清并接种MDCK细胞,成功拯救出有血凝活性的病毒。全基因序列测定结果表明,拯救病毒与野生病毒的核苷酸序列完全一致。生长曲线的测定结果表明,不同时间点野生毒株与拯救毒株在MDCK细胞上的病毒滴度没有明显差异。三源重组H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作平台的成功建立为进一步开展猪流感病毒的生物学特性研究奠定了基础,同时也为H1N1亚型猪流感疫苗的研制开辟了新的途径。     

H3N2犬流感病毒PB2 E~(627)K突变对小鼠致病性的影响

甲型流感病毒PB2蛋白627位点突变(E~(627)K)是影响流感病毒宿主适应性和致病性的重要因素之一。本实验室前期研究分离的H3N2亚型犬流感病毒(CIV)GD02株(A/canine/Guangdong/02/2011)PB2蛋白序列的627位点氨基酸为谷氨酸,为研究该病毒株PB2的E~(627)K突变对小鼠致病性的影响,本实验采用反向遗传操作技术获得rGD02,并利用定点突变技术拯救了PB2 627位点发生突变的rGD02-E~(627)K。通过接种小鼠比较rGD02和rGD02-E~(627)K对小鼠致病性的差异,评价PB2 E~(627)K突变对H3N2 CIV致病性的影响。结果显示,rGD02和rGD02-E~(627)K对小鼠均无致死性(MLD50106EID50),对小鼠增重的影响差异均不显著,而且这两株病毒对小鼠的致病性也无明显差异。表明PB2 E~(627)K并未显著影响H3N2 CIV对小鼠的致病性,该研究建立的H3N2 CIV反向遗传操作平台和定点突变技术为该病毒后续的致病机理、基因功能研究及疫苗研制奠定了基础。     

一株欧洲类禽H1N1猪流感病毒的分离鉴定与反向遗传系统的建立

猪流感是猪常见的呼吸道传染病,临床以高热、呼吸困难、咳嗽和衰竭、迅速康复或死亡为特征。猪流感不仅给养猪业造成巨大损失,也严重威胁着人类健康。本研究从发病猪场中分离到1株H1N1亚型猪流感病毒,序列分析结果显示,分离毒株属于欧洲类禽猪流感H1N1亚型病毒。将分离毒株分别接种到MDCK与ST细胞,观察病毒的生长特性,结果显示分离的猪流感病毒在ST细胞中复制能力较强。采用RT-PCR技术分别扩增8个基因片段,克隆到流感病毒反向遗传系统,成功拯救出猪流感病毒毒株,测序结果显示拯救的猪流感病毒与亲本毒序列一致。本研究成功分离的猪流感病毒,以及建立的反向遗传技术为研究欧洲类禽猪流感病毒跨种传播的机制以及研发新型猪流感疫苗株奠定了基础。     

欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒反向遗传操作平台的建立

为了构建猪流感病毒A/swine/Tian Jin/6/2013(H1N1)的反向遗传操作技术平台,通过RT-PCR技术分别扩增了欧洲类禽H1N1亚型猪流感病毒的8个基因片段,并分别连接至双向转录表达载体p BD上。纯化8个重组质粒,共转染到293T细胞。54 h后收集上清,并接种到MDCK细胞。待细胞病变明显时,进行血凝试验检测收集到的上清,测得血凝效价为1∶32。测定拯救病毒的全基因组序列,结果显示,在核苷酸序列上,拯救病毒与野生病毒完全一致。细胞病变情况显示,拯救毒株与野生毒株无明显差别。本研究成功拯救了欧洲类禽H1 N1亚型猪流感病毒,为猪流感病毒的致病机理、基因功能研究以及H1N1亚型猪流感病毒新型疫苗的研发奠定了基础。     

1株禽源猪流感H6N6病毒的反向遗传系统的建立

为建立禽源猪流感病毒A/swine/Guangdong/K6/2010(H6N6)的反向遗传系统,本试验构建了包含有GDK6毒株基因组的8个重组质粒,转染293T细胞后成功拯救出病毒r GDK6。救获病毒与亲本病毒拥有相同基因序列,其抗原性、经HI试验、TCID50试验和小鼠攻毒试验表明,救获病毒的生物学特性与对小鼠的致病性与亲本病毒一致。禽源猪流感H6N6病毒的反向遗传系统的成功建立为进一步研究H6亚型流感病毒的分子致病机理与病毒基因功能及新型疫苗创制提供了技术平台。     

H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体IPMA检测方法的建立

本试验旨在建立一种针对检测抗H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验（immunoperoxidase monolayer assay,IPMA）筛选方法。通过优化MDCK细胞接毒量、细胞接毒后培养时间、封闭液的种类和工作浓度、工作时间等各个反应条件,并对建立的IPMA筛选方法的特异性、敏感性和重复性进行评价。结果显示,建立的IPMA检测方法的最优反应条件为MDCK细胞接毒10^2.63 TCID₅₀/100 μL H1N1亚型猪流感病毒,37℃培养24 h,含3‰ H₂O₂的甲醇室温固定15 min,5%脱脂乳37℃封闭2 h,50 μL杂交瘤细胞上清作为一抗,37℃孵育2 h,羊抗鼠HRP-IgG二抗37℃孵育1 h。所建立的IPMA方法能特异性地检测H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体,与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）和猪瘟病毒（CSFV）阳性血清不发生交叉反应;其敏感性检测结果显示,可检测1：3 200的HI=2^-9标准H1N1猪阳性血清;批间和批内重复性试验结果较好。综上所述,本试验成功建立了抗H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体的IPMA检测方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性好,为生产鉴定H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体提供了一种简便、实用、有效的检测手段。     

H9N2禽流感病毒PB2蛋白627位点突变对小鼠肺脏RIP3、Slit2和Robo4表达和分布的影响

PB2蛋白627位点被证实是决定甲型流感病毒宿主范围和致病性的关键因子，为深入探究H9N2禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)及其PB2蛋白627位点突变株对BALB/C小鼠肺脏RIP3、Slit2和Robo4基因表达和组织分布的影响，该研究使用H9N2 AIV(V_K627E)和该毒株PB2蛋白627位点突变株(rV_K627E)感染BALB/C小鼠，分别在攻毒后第1、3、5、6 d采集肺组织，通过qRT-PCR和免疫组织化学技术对RIP3、Slit2和Robo4基因在小鼠肺组织中的特异性表达和分布进行研究。结果显示，攻毒组小鼠肺脏RIP3的表达量与对照组相比显著上升，同时V_K627E组RIP3的表达量显著高于rV_K627E组；Slit2和Robo4的表达量在攻毒后第1 d明显低于对照组，之后r VK627E组的表达量与对照组和V_K627E组相比显著上升。免疫组织化学检测结果显示，RIP3蛋白主要分布在小鼠肺泡壁上皮细胞以及肺动脉血管内皮细胞，呈弱阳性...     

禽源H9N2亚型猪流感病毒反向遗传操作技术平台的建立

利用RT-PCR技术扩增了禽源H9N2亚型猪流感病毒A/Swine/Guangxi/7/2007(H9N2)的8个目的基因片段,分别克隆至pBD双向转录表达载体。将8个重组质粒纯化后共转染293T细胞,54 h后收集上清,接种MDCK细胞。当拯救的病毒在MDCK细胞上增殖至第3代时,收集的细胞上清经检测具有血凝效价。经过测序分析,确定获救病毒的8个基因片段序列与野生株完全一致,表明病毒拯救成功。禽源H9N2亚型猪流感病毒反向遗传操作技术平台的成功建立为探索猪流感病毒致病机理、传播机制与基因功能研究奠定了基础。     

破解“H7N9禽流感病毒获得对哺乳动物致病力增强突变”之谜

禽流感病毒(AIV)是重要的人兽共患病原。禽类是AIV的自然宿主,病毒需要获得一系列突变才能跨越禽类-哺乳动物种间屏障、在哺乳动物体内复制。早在1993年科学家就发现AIV在哺乳动物细胞中复制时会在PB2蛋白上获得E627K突变,随后的研究证明这一突变在增强AIV对人及其他哺乳动物致病和传播能力中发挥关键作用。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所陈化兰院士团队前期研究发现PB2/E627K突变增强了H7N9 AIV对人的致病力和在人之间的传播能力。该团队最新的研究揭开了26年一直未能揭示的“PB2/E627K突变之谜”,相关结果近期发表在mBio(Liang L et al.,2019,10(3):e01162-19)。     

两株H1亚型猪流感病毒对猪的致病能力分析

为研究H1亚型猪流感病毒分离株A/Swine/Guangdong/SS1/2012(H1N1,SS1)和A/Swine/Guangdong/YJ28/2014(H1N2,YJ28)的致病力,本研究对2株病毒基因组进行分析,并将2株病毒分别通过滴鼻途径感染仔猪后观察临床症状,在攻毒后4 d与7 d迫杀实验猪采集脏器样品,检测脏器病毒滴度,进行肺病理切片观察和免疫组化实验,比较2株猪流感病毒对猪的致病能力和排毒情况。遗传进化结果显示,SS1分离株8个节段均属于欧亚类禽分支,YJ28为欧亚类禽、pdm/09和人季节性流感的新型重组病毒。动物实验结果显示,两株猪流感病毒均能够在猪只上复制,临床症状均不明显。鼻拭子排毒检测结果显示,YJ28组猪排毒仅持续至感染后第6 d,但SS1组猪在整个实验周期均能检测到排毒。实验猪脏器病毒检测和病理切片结果显示,SS1组相比于YJ28组脏器病毒滴度更高,且造成更严重的肺部病理损伤。本实验分离株SS1相比YJ28在PB2基因出现D~(701)N突变,这或许是SS1比YJ28具有更强致病能力和更长排毒周期的原因。本研究结果为H1N1和H1N2猪流感病毒对猪的致病能力和排毒情况提供实验依据。     

H1N2亚型猪流感病毒反向遗传操作系统的建立

利用RT-PCR技术扩增猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/07（H1N2）的8个基因片段,分别克隆至双向转录表达载体PBD上,构建出8个能在哺乳细胞中复制和表达的质粒。将8个质粒共转染293T细胞,收取转染48 h时的细胞上清并接种9～11日龄SPF鸡胚,成功拯救出有血凝活性的病毒。经序列测定,确定拯救病毒的8个基因片段均来自猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/07（H1N2）基因组。H1N2亚型猪流感病毒反向遗传操作系统的成功建立为猪流感病毒致病机理、传播机制及病毒基因功能的研究奠定了基础;同时,为H1N2亚型猪流感新型疫苗的研制开辟了新的途径。     

H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体IPMA检测方法的建立

本试验旨在建立一种针对检测抗H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验(immunoperoxidase monolayer assay,IPMA)筛选方法。通过优化MDCK细胞接毒量、细胞接毒后培养时间、封闭液的种类和工作浓度、工作时间等各个反应条件,并对建立的IPMA筛选方法的特异性、敏感性和重复性进行评价。结果显示,建立的IPMA检测方法的最优反应条件为MDCK细胞接毒10~(2.63) TCID_(50)/100μL H1N1亚型猪流感病毒,37℃培养24 h,含3‰H_2O_2的甲醇室温固定15 min,5%脱脂乳37℃封闭2 h,50μL杂交瘤细胞上清作为一抗,37℃孵育2 h,羊抗鼠HRP-IgG二抗37℃孵育1 h。所建立的IPMA方法能特异性地检测H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体,与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪瘟病毒(CSFV)阳性血清不发生交叉反应;其敏感性检测结果显示,可检测1∶3 200的HI=2~(-9)标准H1N1猪阳性血清;批间和批内重复性试验结果较好。综上所述,本试验成功建立了抗H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体的IPMA检测方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性好,为生产鉴定H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体提供了一种简便、实用、有效的检测手段。     

一株新型三源重配H1N2亚型猪流感病毒的进化分析及对小鼠的感染性研究

为了研究我国广西地区流行的猪流感病毒分子特征和感染性,本研究对分离自广西临床健康猪群中的H1N2亚型猪流感病毒(SIV)A/swine/Guangxi/238/2018(H1N2)(简称GX238株)进行了分子进化分析和致病性研究。扩增该病毒株8个基因节段后进行分子进化分析,结果显示其8个节段均与2015年～2016年在美国分离的H1N2亚型SIV有高度同源性(98.9%～99.7%),其中HA基因可能来自于2009年之前的人季节性H1N1亚型流感病毒,PB2、PB1、PA、NP、NA和NS可能来自北美三重配H1N2亚型SIV,M基因可能来自H1N1/2009。以10~6EID_(50)SIV GX238株病毒鼻腔感染BALB/c小鼠后记录小鼠的体质量变化及死亡情况,感染后第3 d检测小鼠各脏器病毒复制情况。结果显示,感染组小鼠体质量与PBS对照组小鼠相比有明显下降趋势,感染小鼠40%死亡;在小鼠肺脏和鼻甲中病毒滴度分别达6.3 Log_(10)EID_(50)/mL、4.8 Log_(10)EID_(50)/mL,表明该病毒对小鼠表现出中等的致病力。本研究结果表明输入型SIV持续对我国猪群造成威胁,凸显了在世界范围内开展猪流感监测的必要性。     

一株类禽型H1N1亚型猪流感病毒的反向遗传系统的建立

为建立H1N1亚型猪流感病毒A/swine/Jiangsu/40/2011(JS40)的反向遗传系统,本研究分别构建了JS40株8个基因节段的重组质粒,经转染293T和MDCK混合细胞,拯救出病毒R-JS40。序列测定结果表明,救获病毒与亲本病毒的核苷酸序列一致,无氨基酸变异,可以稳定传代;抗原性未发生变化;对小鼠的致病性结果显示R-JS40与JS40对小鼠的组织嗜性以及在肺脏中复制的病毒滴度基本一致。以上结果表明R-JS40保持了亲本病毒JS40的生物学特性,该病毒反向遗传操作系统的建立,为进一步开展病毒的致病分子基础以及新型疫苗的研制提供有效的技术平台。     

表达Strep-tag的重组H5N6亚型禽流感病毒反向遗传操作系统的建立

为构建携带Strep标签的禽流感病毒(Avian infl uenza virus,AIV)A/Goose/Hunan/109/2014(H5N6,HN109)反向遗传操作系统,RT-PCR扩增AIV HN109株8个基因片段,分别连接至p BD双向转录表达载体。通过点突变技术将NS1基因的77~84位的氨基酸替换成Strep-tag。将8个重组质粒共转染293T细胞,48 h后收取细胞上清接种至9~11日龄SPF鸡胚,并检测血凝效价。结果显示,本研究成功拯救病毒株r HN109-NS1-Strep。r HN109-NS1-Strep的8个基因片段序列与亲本毒素HN109株一致;r HN109-NS1-Strep与亲本毒HN109株在MDCK细胞上复制水平相似,在小鼠体内病毒复制能力相似。结果表明,本研究已成功构建携带Strep-tag的H5N6亚型禽流感病毒反向遗传操作系统,为研究该病毒的分子致病机理、传播机制及新型疫苗的研制奠定了基础。     

6株H9N2禽流感病毒分子进化及对小鼠的致病性

2009年从山东不同地区的规模化肉鸡场中分离到6株H9N2亚型流感病毒,对其分子特征进行分析,发现6株病毒可以分为2个不同的基因型,并且其中一个基因型是CK/SH/F/98（H9N2）和CK/SH/Y2/2008（H9N2）的重组病毒。为阐明H9N2流感病毒对哺乳动物致病性,分别以106 EID50剂量攻毒6周龄BALB/c雌性小鼠,6株病毒都能在小鼠肺脏中复制,而且2株病毒能在攻毒7d后引起小鼠死亡。结果表明,H9N2亚型流感病毒对哺乳动物毒力有增强趋势。     

一株猪流感病毒A/swine/Shanghai/01/2019(H1N1)的分离鉴定及遗传进化分析

为鉴定上海地区猪流感病毒的流行株及其分子生物学特征,本研究从上海地区养殖场采集疑似流感症状的猪咽拭子样品40份,采用套式PCR结合鸡胚分离鉴定方法,从中分离到1株H1N1亚型猪流感病毒(SIV),命名为A/swine/Shanghai/01/2019(H1N1)。经全基因组测定和遗传进化分析结果显示该分离株的8个基因节段与欧亚类禽H1N1 SIV同源性最高,其PB2、PB1、PA基因节段可能来源于A/swine/Jiangsu/49/2012(H1N1)病毒,NA、NP和M基因节段可能来源于A/swine/Shanghai/3/2014(H1N1)病毒。该分离病毒的HA蛋白裂解位点为PSIQSR↓GLFGAI,为低致病性流感病毒的分子特征。该分离株NA蛋白未出现与神经氨酸酶抑制剂相关的氨基酸突变,M2蛋白S~(31)N突变表明该病毒可能对金刚烷胺类药物具有一定的耐药性。PA蛋白~(224)S和PB2蛋白~(701)N突变提示该分离株对哺乳动物的适应性增强,可能导致其致病性增强,需要加强对此类SIV的监测。结合近年来的监测表明,上海地区猪群中H1N1亚型SIV持续存在,需要持续跟踪监测SIV变异趋势。本研究为防控猪流感提供实验依据。