苏云金芽孢杆菌几丁质酶基因chiA在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

[目的]研究来源于苏云金芽孢杆菌的几丁质酶基因chiA在枯草芽孢杆菌中的表达情况。[方法]以苏云金芽孢杆菌染色体DNA为模板,PCR扩增获取几丁质酶基因chiA,将其与枯草芽孢杆菌表达载体pHSG连接,构建重组菌,经IPTG诱导后,检测培养液中的几丁质酶活性。[结果]扩增得到几丁质酶基因chiA大小为2.5 kb。构建的重组菌对底物[4-MU-(GlcNAc)3]显示出一定的水解活性,培养液酶活约为2.8 U/ml,而pHSG空质粒转化子在同样条件下其培养液没有明显酶活。该重组酶的最适pH值为6.5,最适反应温度为50℃,与苏云金芽孢杆菌自身产生的几丁质酶性质一致。[结论]几丁质酶基因chiA能在枯草芽孢杆菌中成功表达,表达产物可成功分泌到细胞外。     

铜绿假单胞菌脂肪酶Lipase基因的原核表达

[目的]对铜绿假单胞菌脂肪酶Lipase基因进行原核表达。[方法]利用PCR方法从铜绿假单胞菌基因组DNA中扩增得到脂肪酶基因,测定其核苷酸序列,利用基因重组技术构建脂肪酶基因的原核表达载体,加IPTG至终浓度为1.0 mmol/L诱导蛋白表达4 h,并进行SDS-PAGE电泳。[结果]从铜绿假单胞菌中克隆的脂肪酶基因成熟肽的序列,与NCBI上所递交的铜绿假单胞菌脂肪酶序列同源性很高,达99.36%。成功构建了脂肪酶基因的原核表达载体pET32a-Lip,进一步SDS-PAGE电泳结果显示目的基因得到高效表达。[结论]克隆的铜绿假单胞菌脂肪酶带有自身的信号肽,也可以在大肠杆菌中正常表达,可以用于进一步的研究。     

藜麦种子总黄酮的提取及体外抑菌作用

采用96孔板微量法和牛津杯法研究藜麦种子总黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌的抑制作用。结果表明,藜麦种子总黄酮对供试菌株的抑制效果由大到小顺序为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌,对金黄色葡萄球菌基本没有抑菌作用。最低抑菌浓度值分别为:大肠杆菌32 mg/m L、枯草芽孢杆菌64 mg/m L、白色念珠菌128 mg/m L、铜绿假单胞菌256 mg/m L、金黄色葡萄球菌512 mg/m L。说明藜麦种子总黄酮对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和铜绿假单胞菌有抑菌作用,对金黄色葡萄球菌不敏感。     

顺反子序列bioI-orf2-orf3在枯草芽孢杆菌染色体中的整合

将来源于枯草芽孢杆菌的顺反子序列bioI-orf2-orf3克隆到含氯霉素基因的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pE 3中,并在顺反子序列上游插入一个强麦芽糖启动子Pglv,构建成枯草芽孢杆菌整合载体pLHX8,电转化枯草芽孢杆菌受体菌1A747。从5μg/m l的氯霉素抗性平板上挑取两株转化子,通过基因组PCR鉴定,确定顺反子序列已经整合到枯草芽孢杆菌染色体上。     

顺反子序列bioⅠ-orf 2-orf 3在枯草芽孢杆菌染色体中的整合

将来源于枯草芽孢杆菌的顺反子序列bioⅠ-orf 2-orf 3克隆到含氯霉素基因的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pE 3中,并在顺反子序列上游插入一个强麦芽糖启动子Pglv,构建成枯草芽孢杆菌整合载体pLHX8,电转化枯草芽孢杆菌受体菌1A747.从5μg/ml的氯霉素抗性平板上挑取两株转化子,通过基因组PCR鉴定,确定顺反子序列已经整合到枯草芽孢杆菌染色体上.     

枯草芽孢杆菌分泌载体构建及其对脂肪酶A的分泌表达

[目的]构建含不同信号肽编码序列的枯草芽孢杆菌分泌表达载体,并研究这些载体对脂肪酶A的分泌表达效率。[方法]克隆得到枯草芽孢杆菌168株的脂肪酶A编码基因,同时扩增得到蛋白质NprE、Bpr、YweA的信号肽编码序列,构建了脂肪酶A分泌表达载体pMA5-estA、pMA5-nprE-estA、pMA5-bpr-estA和pMA5-yweA-estA,并转化到枯草芽孢杆菌168株中得到相应的重组分泌表达菌株。[结果]对4株重组表达菌株进行摇瓶培养,所有菌株都实现了脂肪酶A的分泌,20 h后,168（pMA5-bpr-estA）的细胞外脂肪酶A的酶活力达到1.68 U/ml,约占该菌株脂肪酶A总表达量的86%。[结论]枯草芽孢杆菌Bpr信号肽对脂肪酶A具有较高的分泌效率。     

黄瓜菊苣假单胞菌叶斑病内生拮抗细菌的鉴定及促生作用

从湖南、云南、海南等地采集的健康黄瓜植株中分离得到189株内生细菌,从中筛选的内生细菌Y–10对黄瓜叶斑病病原菌菊苣假单胞菌(Pseudonwnas cichorii)的抑菌半径达16 mm,拮抗效果最好,经形态学、生理生化特性及16S rDNA和rpoA双基因联合建树分析,被鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus su...     

富贵子内生真菌的分离及抗菌活性物质产生菌的鉴定

从药用植物富贵子植株中分离出内生真菌,以大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)为指示菌,采用内生真菌发酵液法进行抗菌活性筛选,并通过ITS-rRNA测序的方法进行菌株鉴定。结果表明:从富贵子中分离纯化得到的43株内生真菌中,有63%的菌株表现出不同程度的抑菌活性,其中有3株菌株对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、铜绿假单胞杆菌均有抗性,分别命名为FGZ5、FGZ8、FGZ13,经形态学及分子生物学鉴定,FGZ5属镰刀菌属,与NCBI数据库中尖孢镰刀菌相似性为100%,FGZ8、FGZ13属毛壳菌属,FGZ 8与NCBI数据库中金黄毛壳菌相似性为99%,FGZ13与NCBI数据库中角毛壳菌相似性为100%。其中,毛壳菌已有报道对多种植物病害有生防作用,可作为农业生防菌株进一步开发和利用。     

枯草芽孢杆菌生物素操纵元的初步改造

为了克服生物素生物合成中的抑制作用,提高生物素操纵元基因本底水平的表达,分别构建了整合表达载体pGJj01和pGJj02,通过双交叉整合的方式先后将线性化的pGJj01和pGJj02整合到枯草芽孢杆菌AS1094的染色体上,构建了枯草芽孢杆菌GJZ01,用强启动子P43-1替换掉生物素操纵元自身的启动子Pbiotin,并在bioB和bioI基因间加入强终止子和强启动子P43-2。经PCR和Southern检测表明,整合构建正确。试验可为下一步研究生物素操纵元基因表达提供良好的宿主菌素材。     

四种常见粽叶提取物的抑菌活性与稳定性

为系统比较荷叶、箬叶、芦苇叶、槲叶这4种常见粽叶的超声提取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肠炎沙门氏菌等食物致病菌的抑菌活性与稳定性,测定了抑菌圈直径、最低抑菌浓度（MIC）、最小杀菌浓度（MBC）与细胞膜渗透性,以及热稳定性、pH值稳定性与紫外照射稳定性。结果表明,在4种提取物中,荷叶、芦苇叶提取物的抑菌圈直径较大,对枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、肠炎沙门氏菌的抑菌圈直径几乎均明显（P<0.05）大于山梨酸钾、苯甲酸钠。荷叶提取物对所有致病菌的MIC与MBC最小;4种提取物对枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的MIC最小,对枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的MBC相同;浓度达到0.5倍MIC值及以上的提取液浓度可显著（P<0.05）改变微生物的细胞膜通透性。这4种粽叶提取物可有效抑制致病菌的生长,并具有紫外照射稳定性与热稳定性,在pH值5~7的弱酸性与中性条件下的抑菌作用稳定。     

枯草芽孢杆菌XF1菌株中XFsacA基因的克隆及功能验证

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis XF1是从土壤中分离的一株利用蔗糖快、能高效防治根肿病的专利菌株.为探明其高效的蔗糖代谢机制,用PCR从该菌中扩增到蔗糖代谢关键基因蔗糖-6-磷酸水解酶基因(XFsacA基因),其编码的蛋白质氨基酸序列与枯草芽孢杆菌B168菌株中的XFsacA基因有97%的相似性,且发生了12个氨基酸突变.将该基因中约1.4 kb的编码框序列连接到表达载体pQE30上,构建了重组表达质粒pQE30-XFsacA,该质粒转入到不能利用蔗糖的Escherichia coli BL21中,后者能在以蔗糖为唯一碳源的M9无机离子培养基中正常生长,并表达出了一条约54 000蛋白条带.结果预示XFsacA基因氨基酸序列的替代可能是XF1高效利用蔗糖的基础,同时XFsacA基因的克隆与其在E.coli中的表达研究,为利用蔗糖发酵的工程E.coli构建奠定了基础.     

铜绿假单胞菌脂肪酶Lipase基因的原核表达(英文)

[Objective] The aim of this study was to investigate the prokaryotic expression of pseudomonas aeruginosa Lipase gene.[Method]Lipase gene was amplified by PCR from the genome DNA of pseudomonas aeruginosa,and its nucleotide sequence was determined.The prokaryotic expression vector of Lipase gene was constructed by the gene recombination technique.The protein expression was induced for 4 hours by IPTG with the final concentration of 1.0 mmol/L,and then SDS-PAGE electrophoresis was analyzed.[Result]The sequence of mature peptides in Lipase gene cloned from pseudomonas aeruginosa had a 99.36% homology with that of pseudomonas aeruginosa lipase submitted in NCBI,so the prokaryotic expression vector of Lipase gene pET32a-Lip was successfully constructed.Furthermore,the results of SDS-PAGE electrophoresis showed that the target gene was expressed highly and effectively.[Conclusion]The cloned pseudomonas aeruginosa lipase with its signal peptide could be normally expressed in E.coli and also used for further study.     

枯草芽孢杆菌apr基因的克隆和表达

通过PCR技术克隆枯草芽孢杆菌蛋白酶apr基因,并分别对该基因和编码蛋白进行同源性比较和酶学性质分析。结果表明,apr基因序列全长1509bp,编码503个氨基酸,同源性100%;克隆到表达质粒pET-22b(+)后,将重组质粒经热激转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,蛋白分子质量为55ku。测定酶活为19500U·mL-1。该基因克隆和表达的成功对于制备大豆抗氧化肽具有实际应用价值,对进一步深入研究其生物学和酶学机制具有重要意义。     

口蹄疫3D蛋白N端T细胞表位重组蛋白的表达、纯化及鉴定

为获得具有抗原性的口蹄疫病毒(FMDV)3D蛋白N端T细胞表位的重组表达蛋白,根据FMDV3D蛋白前115位氨基酸序列,设计优化并人工合成相应的核酸序列,将其克隆至pET-28a中,构建原核表达质粒pET28a-115,并将重组质粒转化至BL21(DE3)细胞。经IPTG诱导后,收集菌液进行SDS-PAGE和Western-bolt鉴定,结果显示,在16kD处有一条明显的蛋白表达条带。对表达产物进行可溶性分析,结果表达蛋白50%为可溶性蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化后获得了较高浓度和纯度的目的蛋白。研究结果表明,含FMDV 3D蛋白前115位氨基酸的重组蛋白在大肠杆菌中得到了高效可溶性表达,并具有较好的抗原活性,为开发口蹄疫诊断试剂和基因工程疫苗奠定了基础。     

纳豆芽胞杆菌KX株纳豆激酶基因的克隆及序列分析

设计引物进行PCR反应,从纳豆芽孢杆菌基因组DNA中扩增和克隆纳豆激酶基因.序列分析表明,所克隆的纳豆激酶基因序列全长1 473 bp,其中阅读框架1 143 bp,阅读框架以GTG为起始密码子,编码包括信号肽、前导肽、成熟肽在内的381个氨基酸;表达产物为前纳豆激酶原,其中N端29个氨基酸组成信号肽,随后的77个氨基酸组成前导肽,最后的275个氨基酸组成成熟肽.     

猪口蹄疫O型合成肽疫苗抗原多肽的串联表达及活性鉴定

为获得含合成肽疫苗抗原多肽的重组表达蛋白,根据猪口蹄疫O型合成肽疫苗中抗原多肽的氨基酸序列,使用大肠杆菌偏好性密码子人工合成该抗原多肽的双拷贝基因序列,并克隆至表达载体pET32a中,构建原核表达质粒pET32a - P2.将重组质粒转化BL21 (DE3),经IPTG诱导表达,收集诱导的菌液进行SDS - PAGE电...     

Bt基因介导的大豆抗蚜虫表达载体的构建

[目的]构建用于大豆抗蚜虫研究的Bt基因介导的Cry1Ac植物表达载体。[方法]以含有Cry1Ac的质粒pRH201为模板进行PCR扩增,将PCR产物克隆至载体质粒pBS中,将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α,并对重组质粒进行酶切和测序鉴定。经验证的Cry1A基因扩增产物双酶切后与pBI121载体连接转化,挑取重组子pBIC121进行BamHⅠ／SnaBⅠ双酶切鉴定。[结果]从pRH201质粒中扩增获得长约3．5kb的Cry1Ac基因序列,对重组质粒pBSCRY的插入片段进行测定,确定了CrylAc片段的全长为3534bp,共编码1176个氨基酸。[结论]构建了Cry1A基因的植物表达载体,为大豆抗蚜虫转基因研究奠定了基础。