用Vero—E6细胞从梅花鹿脑中分离出狂犬病病毒

应用Vero-E6细胞从患狂犬病毒死亡的梅花鹿脑组织中分离出一株狂犬病病毒，经免疫荧光检查，能与狂犬病阳性血清特异性结合。其与人狂犬病阳性血清的结合能被抗狂犬病马血清阻断，所分离毒能通过0．45μm滤膜，超薄切片电镜观察，病毒颗粒清晰可见，为长柱状，Vero-E6细胞培养病毒不致细胞变，在病毒接种第2天，细胞感染率在50％以上，第5天可达90％。     

猪伪狂犬病病毒LA株的分离鉴定

从辽宁省某猪场大批死亡的新生仔猪脑及内脏中分离到多株病毒 ,通过初步验证后选择其中一代表毒株进行了鉴定。该病毒株在PK -1 5细胞上连续传 1 2代均出现典型的细胞病变 ,用适应PK -1 5细胞的病毒接种Vero细胞、猪肾传代细胞IBRS -2及SPF鸡胚成纤维细胞均出现典型的细胞病变。在电镜下可见到典型的伪狂犬病病毒粒子。该病毒对氯仿、乙醚敏感 ,在pH5 0～ 9 0下稳定 ,5 6℃ 3 0分钟即可灭活该病毒。该病毒能被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和。取处理后的病料上清液和传代病毒接种家兔均出现典型的伪狂犬病症状。用所分离病毒提取的DNA及培养病毒液经简单的预处理后作为模板 ,应用特异性引物进行PCR能扩增出伪狂犬病病毒 1 2 40bp的gD基因的特异性片段。结果表明 ,所分离病毒为伪狂犬病病毒 ,并将该毒株命名为猪伪狂犬病病毒LA株。     

猪伪狂犬病毒血清学调查及部分特性的研究

从山东某猪场疑似猪伪狂犬病死亡的仔猪大脑、扁桃体等组织中分离到一株病毒。该病毒接种家兔后，使家兔产生典型的奇痒症状，且能在鸡胚成纤维细胞（CEF）上增殖，并可产生典型的细胞病变（CPE）。CEF细胞接种该病毒后，进行DNA琼脂糖凝胶电泳时，呈现“梯状”条带，说明病毒感染CEF细胞后，使细胞产生“凋亡”现象。综合本病毒的各种特性，初步鉴定为伪狂犬病毒。应用伪狂犬乳胶凝集诊断试剂盒对来自山东6个猪场共100份血清进行了血清学调查。共检出阳性血清25份，血清阳性率达25％。     

猪伪狂犬病血清抗体gE-ELISA检测方法的建立

以纯化的猪伪狂犬病病毒gE蛋白为抗原建立了检测猪伪狂犬病血清抗体的间接gE-ELISA方法。最佳反应条件为，抗原包被浓度为1．7μg／mL，待检测血清1：40稀释。与伪狂犬病阳性血清反应为阳性，与猪瘟、猪细小病毒病、猪繁殖与呼吸综合征（猪蓝耳病）、猪乙型脑炎、猪布氏杆菌病5种疾病阳性血清和猪伪狂犬病gE缺失疫苗接种的猪免疫血清及SPF猪阴性血清均无交叉反应。批间、批内试验变异系数分别不超过5％和9％。用该方法与Ingezim ELISA试剂盒和HerdChek ELISA试剂盒同时对172份血清进行了平行检测，总符合率分别达93．6％和83．7％。试验结果表明：猪伪狂犬病血清抗体间接gE-ELISA检测方法具有较高的敏感性和特异性，且重复性好，可用于猪伪狂犬病野毒感染猪的血清抗体检测。     

猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及其gE基因序列分析

从福建省某猪场疑似伪狂犬病的发病3日龄仔猪的脑、肺脏中分离到1株病毒.该病毒接种家兔出现了典型的伪狂犬病症状,接种PK-15细胞36 h后出现了圆缩、集聚、脱落等典型的细胞病变,猪伪狂犬病病毒阳性血清能特异性中和该分离病毒.根据已发表的伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的序列,设计并合成了一对引物,采用PCR方法可扩增特异性298 bp的DNA片段.测序结果与GenBank中有代表性的6株参考毒株相应基因序列比较,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为95.5%~99%和91.8%~98%.系统进化树结果表明分离株与湖北分离株Ea株亲缘关系最近.     

猪伪狂犬病病毒的分离和鉴定

从病猪脑部分离到1株病毒.该病毒接种Balb/c小鼠出现神经症状,病死率为60% ,接种PK-15细胞出现拉网病变.伪狂犬病阳性血清能特异性的中和该分离毒.根据基因库(GenBank)的PRV gE基因设计的引物能扩增出特异性片段,证实该病毒为伪狂犬病病毒.     

猪伪狂犬病毒CC株的分离与鉴定

从吉林省长春市某猪场送检的一头发热、流涎、肌肉痉挛、角弓反张的9日龄仔猪中分离到一株病毒。该病毒能在猪肾细胞(PK-15),仓鼠肾细胞(BHK-21)和非洲绿猴肾细胞(Vero)增殖并产生典型的细胞病变(CPE),从流行病学,临床症状和病理变化均与伪狂犬病相似,该病毒能被伪狂犬病毒阳性血清中和,电镜观察可见椭圆形、直径为110-180nm典型疤疹病毒粒子,用该病毒接种家免和小白鼠均出现典型的伪狂犬病症状。经鉴定,证明此病毒确为伪狂犬病病毒(PRV),并将该病毒命名为PRVCC株。     

云南省红河州猪伪狂犬病病原分离鉴定

从云南省红河州猪繁殖障碍症较为严重的部分地区大批死亡的新生仔猪和流产胎儿的脑及内脏中分离到了2株病毒。该病毒株在猪肾传代细胞PK-15和兔肾传代细胞RK-6上连传9代均出现典型细胞病变;病毒测定在PK-15细胞上的半数感染量为10-7.3/0.1ml;该病毒能被PRV标准阳性血清中和;病毒接种家兔和小白鼠均出现典型的伪狂犬病症状。从细胞分离物中提取DNA作为模板,应用PRV特异性引物,进行聚合酶链式反应扩增,两株毒株均出现长约262bp的目标扩增条带,与阳性对照一致。结果表明,所分离病毒为伪狂犬病病毒,并将该毒株命名为猪PRV/HH06株和PRV/HH09株。     

猪伪狂犬病病毒鲁A株的分离鉴定

从山东省某些猪场疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑及内脏中分离到多株病毒，对其中一代表毒株进行了全面鉴定。该分离毒株在兔肾原代细胞(RK)上和鸡胚成纤维细胞(CEF)上连传5代．均出现典型细胞病变．再接种于RK-13细胞、BHK-21细胞、Vero细胞、PK15细胞和143TK细胞，均出现典型细胞病变；在RK-13细胞上的TCID50为10^-0.52/0．1mL；在电镜下可见到典型的伪狂犬病病毒粒子；对氯仿、乙醚敏感，56℃30min灭活；能被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和；病毒接种于家兔和小鼠，均出现典型伪狂犬病症状与病变；提取所分离病毒的DNA作为模板。应用特异性引物，以PCR方法可扩增出伪狂犬病病毒gD基因中272～534nt之间262bp长的特异性片段。上述结果证明，所分离病毒为猪伪狂犬病病毒，并将其命名为猪伪狂犬病病毒鲁A株。     

猪伪狂犬病病毒和鹦鹉热衣原体分离与鉴定

本文报道重庆某集约化种猪场爆发流产、死产胎儿中伪狂犬病毒（RB9901）和鹦鹉热衣原体（CR99株）分离鉴定结果，伪狂犬病病毒RB9901株能引起MDBK细胞典型细胞病变，被伪狂犬病病毒Fa株标准阳性血清中和，能引起家兔奇痒及死亡。鹦鹉热衣原体CR99株在鸡胚卵黄囊中生长良好，对青霉素敏感，对磺胺嘧啶不敏感，能引起妊娠豚鼠注产。     

猪伪狂犬病病毒LA株的分离鉴定

从辽宁省某猪场大批死亡的新生仔猪脑及内脏中分离到多株病毒，通过初步验证后选择其中一代表毒株进行了鉴定。该病毒株在PK-15细胞上连续传12代均出现典型的细胞病变，用适应PK-15细胞的病毒接种Veto细胞、猪肾传代细胞IBRS-2及SPF鸡胚成纤维细胞均出现典型的细胞病变。在电镜下可见到典型的伪狂犬病病毒粒子。该病毒对氯仿、乙醚敏感，在pH5．0-9．0下稳定，56℃30分钟即可灭活该病毒。该病毒能被伪狂犬病病毒标准阳性．血清中和。取处理后的病料上清液和传代病毒接种家兔均出现典型的伪狂犬病症状。用所分离病毒提取的DNA及培养病毒液经简单的预处理后作为模板，应用特异性引物进行PCR能扩增出伪狂犬病病毒1240bp的gD基因的特异性片段。结果表明，所分离病毒为伪狂犬病病毒，并将该毒株命名为猪伪狂犬病病毒IA株。     

应用微量中和试验进行猪伪狂犬病血清学调查

应用细胞培养微量中和试验（固定病毒稀释血清法）对来自２４个猪场共４２６份血清进行了猪伪狂犬病血清学调查。共检出阳性血清１７１份,血清阳性率达４０．１％,出现血清阳性的猪场有２０个,占所检测猪场的８３．３％,说明伪狂犬病在我省及我国流行相当严重。对其中５０份血清的中和指数（固定血清稀释病毒法）进行了检测,结果中和效价大于１∶２血清的中和指数都在１０２．５以上。     

一例猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及综合防治措施

无菌采集疑似猪伪狂犬病病猪脑组织,进行病毒的分离鉴定。经PCR检测为阳性的病料接种PK-15细胞进行病毒分离,将所分病毒暂命名为SC株。蚀斑实验测定病毒滴度,并采用PCR和琼扩实验对其进行进一步鉴定。结果:PRV阳性病料接种PK-15细胞,传至第5代后产生稳定细胞病变,主要表现为细胞变圆、变亮、聚堆且可见典型的空斑,而对照组细胞贴壁生长良好;基于PRV gE基因的PCR检测,扩增产物为378 bp,与预期目的条带一致;用病毒蚀斑技术测定该分离株的滴度为2.65×104 PFU/mL;琼扩实验显示病毒原液至32倍稀释后均能与PRV阳性血清形成可见沉淀线。以上结果均表明所送检病猪为PRV阳性,据此为猪场提出综合防治措施。     

间接ELISA检测猪伪狂犬病血清抗体

用猪肾传代细胞IBRS－2增殖猪伪狂犬病病毒（PRV）鄂A株，病毒培养上清液经硫酸铵沉淀、聚乙二醇（Mr20000）浓缩后作为包被抗原。用纯化的猪血清IgG免疫家兔，HRP村记撮的兔抗猪IgG，制备出高效价的酶标抗体，酶标抗体工作浓度为1：50000；经各种条件的选择，建立了检测猪伪狂犬病血清抗体的间接ELISA。所建立的间接ELISA抗原包被浓度为39.2mg/L，血清最佳稀释度为1：20，与猪细小病毒、猪、O型口蹄疫、猪衣原体标准阳性血清呈阴性反应，与标准阴性血清和临床未感染PRV的猪血清呈阴性反应；与猪伪狂犬病标准阳性血清、免疫猪血清和临床发病猪血清呈明显的阳性反应；与美国进口的PRV抗体检测ELISA诊断试剂盒检测结果比较，45份猪血清的阴、阳性检出符合率均为100％。表明建立的间接ELISA具有敏感性高、特异性强、重复性好的优点，可用于猪伪狂犬病血清抗体的定性和定量检测。     

应用微量中和试验进行猪伪狂犬病血清学调查

应用细胞培养微量中和试验（固定病毒稀释血清法）对来自２４个猪场共４２６份血清进行了猪伪狂犬病血清学调查,共检出阳性血清１７１份,血清阳性率达４０．１％,出现血清阳性的猪场有２０个,占所检测猪场的８３．３％,说明伪狂犬病在我省及我国流行相当严重,对其中５０份血清中的中和指数（固定血清稀释病毒法）进行了检测,结果中和效价大于１：２血清的中和指数都在１０＾２．５以上。     

规模化猪场猪圆环病毒2型感染的实验室诊断

为了确诊贵州省某规模化猪场保育仔猪异常死亡原因,从怀孕母猪、产房母猪、后备母猪、种公猪、哺乳仔猪、保育仔猪6个猪群采集90份血清样本采用ELISA方法分别进行血清抗体检测,并对采集的90份血清样本和1份病死猪淋巴结组织采用荧光PCR方法进行病原学检测。结果:6个猪群综合的猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、伪狂犬病病毒g B蛋白、伪狂犬病病毒g E蛋白血清抗体阳性率分别为87.78%、70.00%、88.89%、4.44%;猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、伪狂犬病病毒病原核酸检测显示阴性,猪圆环病毒2型病原核酸检测淋巴结组织样本显示阳性。试验结果表明,引起该猪场保育仔猪死亡的原因为猪圆环病毒2型感染。同时,怀孕母猪群出现了伪狂犬病病毒g E蛋白抗体阳性,提示怀孕母猪群可能存在猪伪狂犬病野毒感染。     

一例猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及综合防治措施

无菌采集疑似猪伪狂犬病病猪脑组织,进行病毒的分离鉴定。经PCR检测为阳性的病料接种PK-15细胞进行病毒分离,将所分病毒暂命名为SC株。蚀斑实验测定病毒滴度,并采用PCR和琼扩实验对其进行进一步鉴定。结果:PRV阳性病料接种PK-15细胞,传至第5代后产生稳定细胞病变,主要表现为细胞变圆、变亮、聚堆且可见典型的空斑,而对照组细胞贴壁生长良好;基于PRV gE基因的PCR检测,扩增产物为378 bp,与预期目的条带一致;用病毒蚀斑技术测定该分离株的滴度为2.65×10~4PFU/mL;琼扩实验显示病毒原液至32倍稀释后均能与PRV阳性血清形成可见沉淀线。以上结果均表明所送检病猪为PRV阳性,据此为猪场提出综合防治措施。     

检测猪细小病毒血清抗体乳胶凝集试验方法的建立及初步应用

将猪细小病毒在IBRS-2细胞上同步培养增殖,待出现细胞病变后,反复冻融,收获病毒液,用甲醛灭活。随后用经硫酸胺沉淀、透析后浓缩的细小病毒液进行方阵滴定,选择致敏乳胶的最佳条件,制成细小病毒乳胶凝集试验（LAT）抗原。抗原与细小病毒阳性血清反应出现肉眼可见的凝集颗粒,而与生理盐水、PBS、犊牛血清、猪瘟、衣原体、口蹄疫、伪狂犬病、弓形体及萎缩性鼻炎等阳性血清不出现凝集现象。用所建立的细小病毒乳胶凝集试验（LAT）与血凝抑制试验检测了203份猪血清,其中血凝抑制抗体阳性为161份,阴性为42份,阳性率为79.31％;乳胶凝集抗体阳性为150份,阴性为53份,阳性率为73.89％,两种方法阳性符合率为93.16％,经统计学检验P＞0.05,两者差异不显著。结果表明,乳胶凝集试验可以作为临床上大量血样进行血凝抑制试验前的初筛,具有简便、准确的优点,在检测细小病毒（PPV）抗体上具有较好的应用前景。     

鼬獾群体中狂犬病中和抗体调查与分析

采用荧光抗体病毒中和试验（FAVN）即固定病毒一稀释血清的中和试验方法,对从我国浙江、江西、安徽和广东地区采集的外观健康鼬獾的215份血清进行了狂犬病中和抗体的检测。结果显示,鼬獾体内存在比例较高（38％）的狂犬病中和抗体,但是自不同地区或群体采集的血清样品,狂犬病中和抗体阳性率不同,有些群体样品中完全没有抗体,有些群体样品中狂犬病中和抗体阳性比例100％,但是中和抗体的水平普遍不高,说明鼬獾种群感染狂犬病几率较高,并可能存在狂犬病的一过性或隐性感染。     

应用斑点-ELISA检测猪伪狂犬病

应用混合纤维素酯微孔滤膜作固相支持物进行斑点-ELISA(Dot-ELISA),对1337头份猪血清作了猪伪狂犬病血清抗体的检测。应用猪伪狂犬病高免血清和自然感染阳性血清作阻断试验,证明了本实验的特异性。猪瘟高免血清、猪细小病毒阳性血清、猪轮状病毒阳性血清、猪流行性腹泻阳性血清及未注过苗的健康猪血清均为阴性。与常规的病毒血清中和试验(NT)进行比较,Dot-ELISA阳性检出率为28.19％(53/188),NT阳性检出率为20.74％(39/188),前者的敏感性显著地高于后者。本法的优点是操作简便、省时、快速,不需特殊仪器设备,可用肉眼判定,诊断膜与试验标本膜可长期保存,适于基层单位的诊断和流行病学调查。