牛源整合素β_1亚基的克隆及表达载体的构建

参照已公布整合素β1亚基的基因组序列,设计并合成了对克隆引物,以RT-PCR方法从牛肺组织扩增出约2 400 bp的β1基因,经回收纯化连入PGEM-T载体,测序.依照测序结果设计1对原核表达引物,1对真核表达引物,分别以克隆载体PGEMβ1为模板扩增目的片段,经相应的EcoR I、XhoI和EcoR I、XbaI酶切纯化后,在T4DNA连接酶的作用下,定向亚克隆到原核表达载体pET-28a和真核表达载体pCDNA3.1zero(+)中,PCR、酶切鉴定及序列测定表明,成功构建了β1亚基原核表达载体pETβ1及真核表达载体pCDNAβ1.     

版纳微型猪近交系性别决定基因（SRY）原核表达载体的构建及蛋白高效表达

 为了构建版纳微型猪近交系SRY的原核表达载体pET 32a(+) SRY,并通过诱导使其在大肠杆菌中获得高效表达,研究采用添加限制性内切酶位点的引物特异性扩增SRY,连入pMD19 T simple载体,转化入大肠杆菌DH5α,克隆后提取pMD19 T SRY阳性重组质粒,使用相同的内切酶同时对pMD19 T SRY质粒和原核表达pET 32a（+）载体进行酶切,连接后使SRY定向克隆到pET 32a(+)表达载体中。经PCR、酶切和测序鉴定后,重组质粒转化大肠杆菌感受态DH5α,提取质粒后再次转化大肠杆菌Rosetta（DE3）,用不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,并通过15% SDS PAGE鉴定。结果显示,不同浓度IPTG诱导的SRY均在大肠杆菌中进行了高效特异性融合表达。     

犬瘟热病毒H基因原核表达质粒的构建

为H蛋白进一步表达作为诊断用抗原、建立特异的犬瘟热病毒(CDV)抗体检测方法及CDV的预防奠定基础,以已构建含有犬瘟热病毒H基因的pMD18-H质粒为模板,利用合成的特异性引物进行PCR扩增,得到1824bp的目的DNA片段,将所得H基因克隆至经相同双酶切处理后的pET32a(+)原核表达载体中,获得重组质粒pET32...     

犬细小病毒VP_2基因原核表达载体的构建与分析

从犬细小病毒/犬瘟热进口二联苗中提取犬细小病毒基因组DNA,以此为模板进行PCR扩增,PCR产物经BamH I和XhoI双酶切后,克隆至pET22b(+)质粒的相应位点上,构建了原核表达载体pET22b/VP2.重组质粒经限制性内切酶酶切和核苷酸序列分析表明,VP2基因已正确克隆到pET22b(+)载体上,从而成功地构建了pET22b/VP2表达载体.     

稻褐飞虱羧酸酯酶基因的克隆与表达

以稻褐飞虱的cDNA为模板,进行PCR扩增,获得约1 900 bp的DNA片段.通过T-A克隆,将PCR产物插入pMD18-T载体中.再以此重组载体为模板,以羧酸酯酶成熟蛋白基因(cae-M)的特异性引物进行PCR扩增.将cae-M扩增产物和pET28a分别用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,酶切产物纯化后在T4连接酶作用连接成重组表达载体pET28a-cae-M.将pET28a-cae-M转化BL21(DE3),经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约62 kD外源蛋白带.蛋白质印迹分析表明,该外源蛋白与6×His融合表达.     

犬瘟热病毒N基因原核表达质粒的构建

为了对N蛋白表达作为诊断用抗原、检测犬瘟热病毒(CDV)特异性抗体提供参考依据,以已构建的含犬瘟热病毒N基因的pMD18-N质粒为模板,利用特异性引物进行PCR扩增,得到1572 by的N基因开放阅读框,将所得N基因克隆至经相同双酶切处理后的pET32a(+)原核表达载体中,获得重组质粒pET32a(+)-N,并转化至...     

金黄色葡萄球菌FnBP配体结合区基因的克隆及其原核表达

[目的]克隆金黄色葡萄球菌FnBP配体结合区基因,并构建原核表达载体,进行原核表达：方法]设计引物,采用PCR方法扩增FnBP配体结合区基因,BA克隆后,构建了克隆质粒pMD18-FnBP。用BarnHI和EcoRI双酶切pMD18-FnBP和pET28a（＋）,将纯化的基因FnBP亚克隆至pET28a（＋）,构建重组表达质粒pET28a-FnBP,并将其转化至大肠杆茼感受态B121（DF3）中,IPTG诱导表达,并对表达产物进行分析。[结果]PCR扩增出1条约370hp的目的片段,表达产物经SDS-PAGE分析,在30kDa处出现了与目的蛋白一致的外源蛋白带．Westem blot分析表明该蛋白具有金黄色葡萄球菌的抗原性。[结论]已成功构建了FnBP配体结合区基因,并在原核细胞中表达。     

梁平柚葡萄糖基转移酶基因的克隆及原核表达

基于GenBank公布的葡萄糖基转移酶(LGT)基因的核苷酸序列,设计并合成特异性引物,以梁平柚成年树幼叶总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增葡萄糖基转移酶基因,将该基因片段克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,构建了该基因的融合表达载体pET28a-CmLGT,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中.经1.0mmol/LIPTG诱导表达获得大小约为62Kd的目的融合蛋白.     

盐生植物盐穗木HcPS_H基因大肠杆菌表达载体的构建

[目的]构建盐穗木HcPS_H基因的大肠杆菌表达载体。[方法]以质粒pGEM-T-HcPS_H为模板,HcPS_H-pET28a-F、HcPS_H-pET28a-R为引物进行PCR扩增,获得两端含酶切位点的HcPS_H基因目的片段。将该目的片段与大肠杆菌表达载体pET-28a通过T4DNA连接酶连接,并转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,得到重组子克隆,抽质粒进行测序鉴定。[结果]扩增出HcPS_H基因片段长度为441 bp,将其连接到大肠杆菌表达载体pET-28a上后,得到重组子质粒,经PCR检测、双酶切验证及测序鉴定,表明成功构建原核表达载体。[结论]该研究成功构建了盐穗木HcPS_H基因的大肠杆菌表达载体,为进一步进行该基因功能的研究奠定了基础。     

致病疫霉 NLP 家族基因 PiNLP30的克隆、原核表达及蛋白质纯化

为了制备致病疫霉 NLP 家族中 PiNLP30蛋白的多克隆抗体,根据 GenBank 中 PiNLP30的cDNA 序列及原核表达载体 pET28b 中的多克隆位点设计引物,对 PiNLP30基因进行 RT PCR 扩增和重组质粒 pET28b PiNLP30的构建,将重组质粒在大肠杆菌 BL21（DE3）表达体系中进行诱导表达,通过 SDS PAGE 检测蛋白质表达,并利用镍琼脂糖亲和层析进行蛋白质纯化。克隆和序列分析显示,该基因 cDNA 全长714 bp,编码237个氨基酸。该基因编码蛋白质是一个主要由不规则卷曲组成的亲水蛋白,含有一段19个氨基酸的信号肽序列。预测蛋白质分子量为26·6 kD,等电点5·49。经PCR、酶切及测序验证,成功构建了原核表达载体 pET28b PiNLP30,使用0·6 mmol/L IPTG 于37℃下诱导6 h 后蛋白质大量表达,表达的蛋白质主要以包涵体形式存在。经镍琼脂糖亲和层析进行纯化,获得了纯化的 PiNLP30蛋白,其质量浓度约为0·3 mg/mL。     

绿色荧光蛋白基因原核表达质粒pET32a-AcGFP1的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

 为了构建绿色荧光蛋白AcGFP1基因的原核表达载体pET32a AcGFP1,并诱导使其在大肠杆菌中高效表达,本研究以pIRES AcGFP1质粒为模板,采用PCR技术特异性扩增绿色荧光蛋白AcGFP1基因,通过酶切和连接使其与原核表达载体pET32a（+）构成重组子,经PCR、酶切和测序鉴定后,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta（DE3）,用不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达绿色荧光蛋白,经15% SDS PAGE鉴定,结果显示：重组质粒pET32a AcGFP1中的AcGFP1序列与Clontech公司的pIRES AcGFP1质粒的AcGFP1序列完全一致,表明本实验已成功构建了含有绿色荧光蛋白基因AcGFP1的原核表达质粒。此外,pET32a AcGFP1转化Rosetta（DE3）,经不同浓度的IPTG诱导,SDS PAGE检测均获得高效表达,为今后构建pET32a(+) TAT AcGFP1融合表达载体以及深入研究TAT的细胞膜穿透作用的机制奠定基础。     

金黄色葡萄球菌FnBP配体结合区基因的克隆及其原核表达(英文)

[Objective] The study aimed to clone the FnBP ligand binding gene of Staphylococcus aureus and run prokaryotic expression by constructing a prokaryotic expression vector. [Method] The gene encoding FnBP ligand binding gene was amplified from S.aureus chromosomal DNA by PCR technique. After T-A cloning, plasmid pMD18- FnBP was constructed. pMD18- FnBP and pET28a(+)were digested by BamH Ⅰ and EcoR Ⅰ double enzymes, then the purified FnBP ligand binding gene was subcloned into the expression vector pET28a(+), and the prokaryotic expression vector pET28a-FnBP was thus constructed. The constructed plasmid pET28a-FnBP was transformed into Escherichia coli BL21(DE3) competent cells. The bacterium was induced by IPTG and the expressed products were analyzed by SDS-PAGE and Western blot. [Result] The gene fragment with the length of 370 bp was amplified by PCR approach. One approximately 30 kD exogenous protein was observed in SDS-PAGE analysis. Western blot analysis indicates the protein has antigenicity of S.aureus. [Conclusion] The FnBP ligand binding gene of S.aureus was successfully cloned and expressed in prokaryotic cells.     

OsMAPK4基因的原核表达及蛋白纯化

构建OsMAPK4基因的原核表达载体,对表达产物进行鉴定和纯化,为转OsMAPK4基因植株后期的Western Blot检测提供抗原。用PCR方法从本实验室已构建的植物表达载体pUM4上扩增OsMAPK4基因,将其克隆至pET32b原核表达载体,构建重组载体pET32b-MAPK4。转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE分析。用Ni-NTA亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,用Western Blot进行蛋白鉴定。结果表明,原核表达载体构建正确;SDS-PAGE分析及Western Blot鉴定中,均出现了与DNAMAN预测的43.6 ku大小一致的蛋白条带;得到纯化蛋白。成功构建了OsMAPK4基因的原核表达载体,得到纯化蛋白,为转OsMAPK4基因水稻植株体内蛋白表达活性的检测提供了抗原。     

猪肠球菌溶血素cylA基因原核表达载体的构建

以猪致病性粪肠球菌染色体DNA为模板,PCR扩增溶血素cylA基因,相应酶切后,克隆到原核表达载体pET32a中,构建pET32a-cylA重组质粒,并将pET32a-cylA质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)。经HindⅢ、XhoI双酶切及测序鉴定,并与已发表的肠球菌溶血素cylA基因序列比较,同源性达99.8%。表明成功构建猪肠球菌溶血素cylA基因的重组表达质粒,为制备单抗、开发疫苗及其致病机制研究奠定了基础。     

鹦鹉幼雏病毒结构蛋白VP1基因的克隆及原核表达

采用湖北省云梦县患鹦鹉幼雏病死亡的虎皮鹦鹉体内分离得到的鹦鹉幼雏病毒(budgerigar fledgling disease virus，BFDV)，应用PCR方法获得BFDV主要结构蛋白基因(VP1)，克隆到pMD18-T载体，构建重组质粒pMD18T-VP1并进行测序，结果显示，结构蛋白基因(VP1)与BFDV欧美分离株的同源性为96％～99％，表明VP1是BFDV保守基因；将VP1亚克隆到原核表达载体pET32( )b，构建重组质粒pET32( )b-VP1，转化菌株BL21(DE3)，诱导表达，经SDS-PAGE和Westem-blot分析，克隆在his-tag下游的结构蛋白基因获得了高效融合表达，表达的融合蛋白分子量约为55 kD。为建立快速、灵敏的鹦鹉幼雏病毒血清学检测方法以及研制基因工程疫苗提供了科学依据。     

玉米大斑病菌STK1原核表达载体的构建及其表达

【目的】构建玉米大斑病菌STK1原核表达载体并进行表达,以期得到带有His标签的目的蛋白。【方法】根据GenBank中STK1(AY849317)的cDNA序列及原核表达载体pET28a(+)中的多克隆位点设计引物,进行STK1的克隆和原核表达载体的构建。将重组载体在原核表达体系中进行表达。通过SDS-PAGE电泳鉴定蛋白的表达,并利用Western blot技术验证该蛋白是否为目的蛋白。【结果】STK1在大肠杆菌中的表达主要以包涵体形式存在;蛋白的分子量约为40.8kD;经1mmol·L-1 IPTG在37℃下诱导,9h后蛋白产量达到最高;经Western blot检测该表达产物具有His-6抗原性。【结论】玉米大斑病菌MAPK信号转导途径中的STK1在大肠杆菌中获得了表达,为今后STK1蛋白的多克隆抗体制备及功能研究奠定基础。     

番茄黄化曲叶病毒CP基因的原核表达载体构建选择

[目的]筛选出目的蛋白能够高效表达的重组质粒。[方法]利用原核表达载体pET-32a(+)和pET-28a(+)成功构建了番茄黄化曲叶病毒(Tomato Yellow Leaf Curl Virus,TYLCV)外壳蛋白(Coat Protein,CP)基因的重组质粒p32a-CP和p28a-CP,并通过PCR和双酶切鉴定了序列连接的正确性;再分别将2个载体转化至BL21(DE3)中,采用不同浓度的IPTG对其进行诱导表达,并进行SDS-PAGE电泳检测。[结果]测序结果显示TYLCV-CP基因已定向插入p32a-CP和p28a-CP中;SDS-PAGE电泳结果显示分子量约为50 kD的目的蛋白在重组载体p32a-CP中得到了高效表达,而在重组载体p28a-CP中未表达。[结论]为下一步的抗体制备及TYLCV的免疫学检测奠定了基础。     

大肠杆菌NrfA蛋白表达、纯化及多克隆抗体的制备

[目的]克隆大肠杆菌NrfA基因,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体,制备相应的多克隆抗体并对其进行鉴定。[方法]以大肠杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到NrfA基因编码区,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体;经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白;再免疫新西兰雄兔,制备多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体的效价,Western Blotting检测抗体的特异性。[结果]构建的表达载体pET-28a(+)-NrfA在大肠杆菌中诱导后可高效表达NrfA蛋白;免疫获得的多克隆抗体用ELISA检测,其效价为1∶204 900;经Western Blotting分析,抗体的特异性较好。[结论]成功克隆大肠杆菌的NrfA基因,并构建了其表达载体,制备的NrfA多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性,为研究细菌有关NrfA奠定了基础。     

猪伪狂犬病病毒GZ-Z1株gE基因原核表达质粒的构建

为给猪伪狂犬病病毒的诊断及防治提供科学依据,参考GenBank中猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因序列,设计1对特异性引物,以PRV GZ-Z1株DNA为模板,进行gE基因的PCR扩增,扩增产物与pMD18-T载体连接、鉴定正确后,再亚克隆至pET32a(+)原核表达载体中,经鉴定后测序。结果表明:目的片段为PRV gE基因完整开放阅读框,大小1 734bp,编码577个氨基酸,在pET32a(+)载体中位置正确,表明,pET32a-gE原核表达质粒构建成功。该基因与国内外其他18株PRV的gE基因推导氨基酸序列同源性为94.8%～98.6%;与国外分离株属同一个进化分支,遗传关系相对较近;而与国内Fa、Min、GDSH等毒株亲缘关系较远。