致病疫霉坏死基因PcF/SCR.1的克隆及功能分析

PcF(Phytophthora cactorum-fragaria)蛋白是一类只存在于疫霉属(Phytophthora)中的重要致病因子。致病疫霉(Phytophthora infestans)基因组学研究预测出了20个PcF/SCR(small cysteine-rich)-like基因,但其对寄主植物的致坏死功能尚未被证实。本研究选取其中编码蛋白被预测具有4个二硫键的基因PcF/SCR.1(GenBank:XM_002902885),对其进行基因克隆和致坏死功能分析。利用RT-PCR获得336 nt的全长cDNA,将其连入表达载体pBI121后,转化农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404,注射接种本生烟(Nicotiana benthamiana),观察叶片症状。在注射接种后5 d时叶片开始出现黄化,7 d时叶片出现严重皱缩和坏死症状,初步表明该基因具有致坏死功能。序列比对分析表明,PcF/SCR.1基因编码的蛋白具有与PcF蛋白相类似的3个二硫键(C89和C99,C68和C100,C73和C104)和1个仅存在于PcF/SCR.1的潜在二硫键(C88和C110),推测其在维持蛋白结构功能方面发挥重要作用。为深入了解PcF/SCR.1基因的致坏死功能,利用试剂盒定点突变该基因编码蛋白的第99、100、104和110位上的半胱氨酸,构建缺失二硫键突变体的重组质粒,并在本生烟中进行瞬时表达。仅突变110位半胱氨酸,或者同时突变99位和110位两个位点的半胱氨酸时,PcF/SCR.1基因的致坏死功能并没有受到影响;当半胱氨酸的突变个数增加到3个(C99/100/110A)或者4个(C99/100/104/110A)时,接种烟草叶片没有出现坏死症状,表明二硫键在该基因的致坏死功能中具有重要作用。为进一步了解PcF/SCR.1基因在致病疫霉侵染马铃薯(Solanum tuberosum)过程中的表达模式,利用荧光定量RT-PCR分析其在不同侵染时期表达量的变化,结果显示,该基因在整个侵染过程中均有不同程度的上调,而且在接种48 h时表达量达到最高值,说明该基因可作为毒素因子在病菌侵染马铃薯叶片的整个过程中都起作用,而且主要作用可能是在侵染后期(48 h)通过分泌大量的毒素蛋白来破坏寄主的防御系统进而促进自身的定殖。对PcF/SCR.1基因致坏死功能的研究,有助于深入了解该基因在致病过程中的作用及机制,为PcF/SCR-like家族其他基因的功能研究提供参考。     

致病疫霉NLP家族基因PITG_10839的克隆和功能分析

【目的】分析致病疫霉（Phytophthora infestans）NLP（Necrosis- and ethylene-inducing like proteins）家族基因PITG_10839的致坏死功能及所编码蛋白的活性位点对其功能的影响。【方法】以PITG_10839作为研究对象,选inf1作为正对照,以致病疫霉菌株HK09-19的总RNA为模板,通过RT-PCR获得基因的cDNA全长序列。将所得cDNA与表达载体pBI121连接,构建所选基因的重组表达载体,并采用冻融法将其转入农杆菌LBA4404中。利用农杆菌介导的瞬时表达体系在本生烟（Nicotiana benthamiana）中对PITG_10839的表达和功能进行分析。利用over-lap PCR方法定点突变基因PITG_10839的活性位点,同时构建活性位点突变后的重组表达质粒,并通过农杆菌注射接种本生烟来研究各活性位点在基因坏死功能中所起的作用。通过荧光定量PCR分析致病疫霉游动孢子侵染马铃薯叶片后不同时期PITG_10839的表达模式。【结果】获得了PITG_10839和inf1的全长cDNA,分别为405及357 nt。同时,成功构建了PITG_10839和inf1的真核表达载体pBI121-10839和pBI121-inf1,并成功转入农杆菌。将含有重组质粒pBI121-10839的农杆菌注射接种本生烟,5 d后接种叶片开始逐渐黄化,7 d后叶片出现典型的皱缩坏死症状。然而含有对照重组质粒pBI121-inf1的农杆菌在注射接种3 d后,本生烟叶片便开始出现萎蔫,5 d时则出现坏死症状,7 d时坏死症状严重。进一步对PITG_10839编码蛋白的活性位点进行突变,发现D9A、E22A和D20A 3个氨基酸位点的突变使基因PITG_10839所编码蛋白的致坏死功能丧失,叶片仅出现轻微的黄化现象,然而H17A位点氨基酸的突变对该基因的致坏死功能没有影响,注射接种7 d后,仍然可以使本生烟叶片出现皱缩坏死的症状。同时,荧光定量PCR表明,致病疫霉游动孢子接种后不同侵染阶段PITG_10839的表达呈现出了不同水平的增加。接种后12 h至36 h,表达量变化水平稳定,增加了20倍左右;48 h时其表达量急剧上升至350倍左右;随后表达量开始下降,但仍高于接种36 h时的表达水平。【结论】致病疫霉NLP家族基因PITG_10839具有致使烟草叶片坏死的功能,并确定了影响该基因所编码蛋白致坏死功能的氨基酸活性位点。     

五种杀菌剂对马铃薯晚疫病菌孢子萌发的抑制作用

测定河北双吉75%代森锰锌水分散粒剂、河北双吉80%代森锰锌可湿性粉剂、美国陶氏80%代森锰锌可湿性粉剂、25%双炔酰菌胺悬浮剂和68.75%氟菌·霜霉威悬浮剂5种杀菌剂对马铃薯晚疫病菌[Phytophthora infestans(Mont.)de Bary]孢子囊直接萌发、间接萌发(释放游动孢子)及游动孢子萌发的抑制作用。结果表明,5种杀菌剂对孢子囊直接萌发的抑制效果均比较好,而对孢子囊间接萌发和游动孢子萌发的抑制效果各不相同。其中,河北双吉75%代森锰锌水分散粒剂和河北双吉80%代森锰锌可湿性粉剂对孢子囊直接和间接萌发的抑制效果最显著,浓度在5μg/m L以上时抑制率均为100%。美国陶氏80%代森锰锌可湿性粉剂和25%双炔酰菌胺悬浮剂,浓度在20μg/m L时几乎能完全抑制孢子囊的直接萌发或间接萌发,68.75%氟菌·霜霉威悬浮剂对孢子囊间接萌发的抑制作用相对较差。游动孢子的萌发对5种药剂较为敏感,1μg/m L的药剂浓度就能使游动孢子萌发得到显著抑制。     

致病疫霉 NLP 家族基因 PiNLP30的克隆、原核表达及蛋白质纯化

为了制备致病疫霉 NLP 家族中 PiNLP30蛋白的多克隆抗体,根据 GenBank 中 PiNLP30的cDNA 序列及原核表达载体 pET28b 中的多克隆位点设计引物,对 PiNLP30基因进行 RT PCR 扩增和重组质粒 pET28b PiNLP30的构建,将重组质粒在大肠杆菌 BL21（DE3）表达体系中进行诱导表达,通过 SDS PAGE 检测蛋白质表达,并利用镍琼脂糖亲和层析进行蛋白质纯化。克隆和序列分析显示,该基因 cDNA 全长714 bp,编码237个氨基酸。该基因编码蛋白质是一个主要由不规则卷曲组成的亲水蛋白,含有一段19个氨基酸的信号肽序列。预测蛋白质分子量为26·6 kD,等电点5·49。经PCR、酶切及测序验证,成功构建了原核表达载体 pET28b PiNLP30,使用0·6 mmol/L IPTG 于37℃下诱导6 h 后蛋白质大量表达,表达的蛋白质主要以包涵体形式存在。经镍琼脂糖亲和层析进行纯化,获得了纯化的 PiNLP30蛋白,其质量浓度约为0·3 mg/mL。