犬瘟热病毒F蛋白基因片段的克隆与表达及其表达产物抗原性的初步鉴定

本研究采用RT-PCR法扩增出犬瘟热病毒标准疫苗株的融合蛋白基因(F基因)片段约1499 bp,克隆到pMD18-T载体,酶切鉴定后用一对特异性的引物扩增约732 bp的F蛋白基因片段。并把该基因定向克隆到原核表达载体pET-28a( )中,转化到宿主菌BL21(DE3)后进行了表达并纯化了该表达产物,Western印迹显示表达产物有良好的抗原性。     

陆地棉锌指蛋白(GZFP)的原核表达

采用大肠杆菌表达体系来获得陆地棉锌指蛋白(GZFP)的融合蛋白.以pMD18-GZFP质粒为模板,用PCR方法扩增获得GZFP基因的编码区序列,将其克隆到表达载体pET28b(+)中,转化宿主菌BL21(DE3),成功地构建了陆地棉GZFP基因原核表达载体pET-GZFP、经IPTG诱导、SDS-PAGE电泳分析和蛋白质杂交检测表明,陆地棉GZFP以融合蛋白的形式在大肠杆菌中得到大量表达.     

海洋双RNA病毒(MABV)VP5基因的克隆与表达

从海洋双RNA病毒(MABV)基因组中克隆到VP5基因,将其连接到6×His融合表达载体pET-28a(+)上,在大肠杆菌中表达,并对其表达条件进行了优化.研究结果表明,在温度为28℃、IPTG浓度为0.1 mmol·L-1时,表达的融合蛋白相对最高,占细菌总蛋白的7.3%.     

红笛鲷SR-BI基因的原核表达及条件优化

根据GenBank上登录的红笛鲷SR-BI基因设计引物,采用RT-PCR方法扩增该基因胞外段序列,然后将该基因胞外段序列定向克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,将重组质粒转入大肠杆菌BL21进行IPTG诱导表达,并对重组表达菌株的表达条件进行优化.结果显示,成功构建了原核表达载体pET28a-SR-BI,并能在大肠杆菌BL21中表达,表达的融合蛋白分子量为50.0ku.融合蛋白的最佳诱导表达温度、IPTG浓度和时间分别为16℃、0.05mmol/L和8h.研究结果为进一步研究SR-BI的功能奠定了基础.     

柔嫩艾美耳球虫F2杂交株Rhomboid基因在大肠杆菌中的表达

根据ET-Rhomboid基因开放阅读框,插入有利于表达的酶切位点设计引物,以虫体DNA为模板扩增并克隆了ET-Rhomboid基因,并将该基因与PET-28a(+)质粒载体连接,构建成了原核表达载体PET-ET-Rhomboid.将构建好的表达质粒转入大肠杆菌DE3,经IFTG诱导表达后,用SDS-PAGE检测表达产物,用蛋白印迹(Western blotting)检测其反应原性.结果表明:含重组质粒的工程菌有明显的表达产物为31 kD的融合蛋白,与推测的融合蛋白的分子量吻合,蛋白印迹检测具有反应原性.     

蜡梅α-半乳糖苷酶基因的克隆和表达分析

从蜡梅中克隆α-半乳糖苷酶基因,通过对其酶学性质及基因表达分析,为研究蜡梅的低温适应的分子机理提供参考.通过PCR扩增获得α-半乳糖苷酶基金(CpGAL),构建了该基因的原核表达载体pET28a-CpGAL并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,诱导表达并分离纯化得到融合蛋白.利用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测CpGAL基因在腊梅不同发育时期的表达差异.     

新疆多浪羊IL-1β基因原核表达载体的构建与表达

【目的】构建新疆多浪羊IL-1β基因编码区的原核表达载体,在大肠杆菌中进行诱导表达,为进一步研究IL-1β蛋白的结构功能奠定基础。【方法】从含质粒pMD-18T-IL-1β的大肠杆菌DH5α中获取IL-1β基因,与pET-28b质粒DNA连接,构建原核表达载体pET-28b-IL-1β。先将其转化到克隆载体E.coli DH5α感受态细胞中大量拷贝,经菌液PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定后,提取pET-28b-IL-1β质粒转化到表达载体E.coli BL21(DE3)中,再次进行菌液PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定。将阳性单克隆接种于LB液体培养基,以终浓度为1mmol/L IPTG进行诱导,用SDS-PAGE电泳检测IL-1β蛋白的表达及存在形式,通过Western blotting验证表达产物是否为目的蛋白。【结果】成功构建了新疆多浪羊IL-1β基因的原核表达载体pET-28b-IL-1β,该载体经诱导后表达出融合蛋白,分子质量为32.4ku,主要以包涵体的形式表达;经Western blotting检测,带有6×His标签的融合蛋白有很好的反应原性。【结论】成功构建了新疆多浪羊IL-1β基因的原核表达载体pET-28b-IL-1β,其在大肠杆菌BL21(DE3)中经诱导后表达出分子质量约为32.4ku的IL-1β融合蛋白。     

拟南芥AtCOR15a抗寒基因原核表达载体的构建及蛋白表达

[目的]通过RT-PCR获得拟南芥AtCOR15a基因的ORF全长,经酶切、连接,以pET-28a(+)为原核表达载体.构建成pET28a-COR15a的重组表达载体,研究该基因在大肠杆菌中的表达情况,为进一步研究该基因的功能奠定基础.[方法]根据拟南芥AtCOR15a基因序列设计特异引物,利用RT-PCR的方法扩增目的基因,构建原核表达载体pET28a-COR15a,并将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷( IPTG)诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,验证其蛋白表达量,并对其体系进行优化.[结果]AtCOR15a在大肠杆菌中成功表达,在37℃条件下诱导表达量最大,而30和16℃条件下蛋白表达量降低,IPTG浓度0.2～1.0 mmol/L对蛋白的表达量影响不大,并没有明显差异.但通过在不同诱导时间取样分析,结果发现加入IPTG后诱导5 h蛋白表达量最大,而8 h后逐渐降低.[结论]构建的原核表达载体在大肠杆菌中能高效表达,AtCOR15a融合蛋白分子量大约为19 kD,为进一步研究该基因的功能奠定了基础.     

近交五指山小型猪SLA-DQA基因的克隆及在大肠杆菌的原核表达

采用RT-PCR方法扩增五指山猪SLA-DQA基因cDNA,克隆入测序载体,测序结果与Gene Bank(登陆号:AY243104)的序列相同,大小为768 bp,该基因编码255个氨基酸残基和一个终止密码,预计蛋白分子量为28 kD.将这个基因克隆到原核表达载体PET-28a(+)中,经酶切、PCR扩增和测序分析确证其正确,插入到表达载体中,阅读框是正确的,从而构建成重组表达载体PET-28a(+)-DQA.重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达,对表达的蛋白用SDS-PAGE电泳分析,结果表明得到了与预计分子量相同的蛋白.     

真核表达载体pCDNA3-CaBP-D28k的构建及细胞表达

构建钙结合蛋白D28k(calbindin-D28k,CaBP-D28k)真核表达载体,并证实了其在真核细胞COS-1中的表达情况,为进一步研究该重组载体在动物体内的表达奠定了基础。通过酶切方法自含鸡CaBP-D28k基因的克隆质粒pGEM-T-CaBP-D28k中扩增CaBP-D28k基因,并将其克隆到真核表达载体pCDNA3中,阳性克隆鉴定后,在PEI作用下转染COS-1细胞,通过间接免疫荧光试验(IFA)检测到了CaBP-D28k在COS-1中的表达。     

犬瘟热病毒水貂株H与F蛋白基因原核表达重组质粒的构建及表达

将克隆质粒pMD-18T-H和pMD-18T-F分别进行双酶切,获得纯化的H基因和F基因,在T4DNA连接酶的作用下,亚克隆到原核表达载体pET28a(+)上,获得原核重组质粒pET28a-H和pET28a-F.将原核重组质粒转化大肠埃希菌Escherichia coli Rosetta2(DE3)中进行表达,SDS-PAGE结果显示H基因和F基因分别表达相对分子质量约为31 400和38 200的融合蛋白,Western-blot检测结果显示,表达蛋白均可与CDV标准阳性血清呈阳性反应,表明原核表达的CDV H蛋白和F蛋白在反应原性上具有与天然H蛋白和F蛋白同样的特性,可作为CDV诊断用抗原,为CDV的免疫预防研究奠定基础.     

抗菌肽CM与haFGF改构体融合基因的构建与表达

构建重组改构体aFGF28-154和抗菌肽CM基因的融合基因,使其在大肠杆菌系统中融合表达,以期获得具有靶向FGFR高表达肿瘤细胞的抗肿瘤融合蛋白.利用PCR引物延伸的方法拼接得到带有G4S铰链的天蚕素-蜂毒素杂合肽CM与aFGF28-154的融合基因,插入大肠杆菌表达载体pET20b中,构建表达质粒pET-CM-aFGF28-154,并转化至大肠杆菌BL21(DE3),氨苄青霉素抗性筛选重组转化子.IPTG诱导4 h后,菌液经超声破碎,以包涵体形式表达的融合蛋白约占菌体总蛋白的18%.将包涵体溶解并通过差速离心除去部分杂蛋白,透析复性并用Heparin Sepharose CL-6B亲和层析,目的蛋白得到初步纯化,为进一步研究蛋白的生物学活性奠定了基础.     

牛Cathelicidin BMAP-28基因的克隆及原核表达

根据GenBank中公布的牛BMAP-28基因mRNA序列设计引物,利用RT-PCR技术从牛骨髓总RNA中扩增出BMAP-28基因片段,将其克隆到pMD-18载体上,通过PCR、酶切和测序分析鉴定,获得重组克隆载体pMD18-T-BMAP28.以重组质粒为模板,扩增BMAP-28基因的去信号肽片段,转入原核表达载体PE...     

弓形虫RH株表面抗原SAG3去信号肽基因的蛋白原核表达及鉴定

根据GenBank中弓形虫表面抗原SAG3基因序列,以弓形虫总RNA反转录的cDNA为模板,扩增出SAG3去除信号肽基因并进行原核表达.将重组pET-28a(+ )-SAG3阳性表达质粒转入大肠杆菌BL(DE3)中,用IPTG进行诱导表达.通过SDS- PAGE和Western blotting对重组蛋白进行分析和鉴定.结果表明:成功扩增了不合信号肽的SAG3基因,构建的原核表达质粒在大肠杆菌中得到了高效表达,能够与鼠抗弓形虫阳性血清发生特异性反应,去信号肽的SAG蛋白具有反应原性.     

小鼠B7-H4原核表达载体的构建、表达及多克隆抗体的制备

目的探讨小鼠B7-H4原核表达载体的构建、表达及多克隆抗体的制备。方法采用特异性引物扩增小鼠B7-H4（mB7-H4）胞外功能区DNA,经酶切、拼接构建原核表达载体pET28a-mB7-H4。将构建的重组表达质粒转化入E.coliBL21（DE3）菌株,采用IPTG诱导表达、Ni-NTA柱亲和层析纯化目的蛋白、SDS-PAGE分析蛋白纯度。将纯化的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并对其进行纯化及鉴定。结果序列测定证实了构建的pET28a-mB7-H4重组表达载体含有mB7-H4编码序列,其序列分析与GenBank中公布序列对比一致,质粒在E.coli中诱导表达相对分子质量（Mr）为26.5 KD的目的蛋白,SDS-PAGE分析表明纯化后的目的蛋白达到电泳纯。双向琼脂扩散法检测抗体效价为1∶16,ELISA法检测抗体效价为1∶12 800,Western blot分析显示抗体能特异性结合mB7-H4。结论成功制备了高表达重组mB7-H4蛋白的原核表达载体及高效价抗mB7-H4多克隆抗体,为进一步研究B7-H4的功能奠定了基础。     

新城疫病毒F48E9株F1基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中新城疫病毒(NDV)F48E9株F1基因序列和原核表达载体pET-28a的克隆位点,设计1对引物,通过PCR方法获得了F1基因;将F1双酶切产物插入原核表达载体pET-28a,得到的重组子命名为pET-F1。用IPTG进行诱导将其在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行了表达,收集菌液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,结果表明,NDV F1在pET-F1中获得了高效融合表达,其表达蛋白的分子质量约为31 ku。表达的重组蛋白为进一步研究NDV的免疫特性和分子生物学功能奠定了基础。     

Construction of Fusion Expression Vector Carrying GFP and ZmCIPK

[Objective] The aim was to isolate the CBL-interacting protein kinases(CIPK)from maize(Zea mays L.)and construct the fusion gene expression vector which consisted the ZmCIPK8 and GFP.[Method] The ZmCIPK8 cDNA was successfully cloned by using RT-PCR method.And then,it was connected to the pBlueScript SK(pSK)plasmid,which contained the GFP gene.So that the fusion gene vector pSK-CIPK-GFP was obtained.Then,the fusion gene was connected into the efficient plant expression vector PBI121 to construct the fusion gene expression vector PBI-CIPK-GFP.At last,the recombined expression vector was transformed to Agrobacterium tumefaciems LBA4404 to produce the engineering strain LBA4404-PBI-CIPK-GFP.[Result] The fusion gene expression vector which consisted of GFP and ZmCIPK8 gene and engineering strain LBA4404-PBI-CIPK-GFP were successfully constructed.[Conclusion] The results lays a foundation for further study of subcellular localization of ZmCIPK8,which can help to clarify the molecular mechanism of regulation serious stresses,and also provides an important basis for the research on resistance stress engineering of maize.     

鸡p15INK4B基因的克隆表达及纯化

为研究鸡p15INK4B蛋白的功能及为制备此蛋白的单克隆抗体提供材料,应用引物搭桥法合成p15INK4B基因,应用基因工程的手段构建p15INK4B基因的原核表达载体,在E.coliRosetta(DE3)菌进行融合表达,并对表达产物进行亲和层析纯化。结果成功地构建了p15INK4B基因原核表达载体,经亲和层析制备了较高纯度的目的表达产物。