大肠杆菌O157:H7 Z3955蛋白的亚细胞定位分析

α-淀粉酶是一种广泛存在的淀粉分解酶，催化淀粉和相关α-葡聚糖中α-1,4-葡萄糖苷键的水解，它可以定位在不同细菌的不同位置。大肠杆菌O157:H7 Z3955基因的同源基因在非致病性大肠杆菌编码α-淀粉酶，可以确定Z33955蛋白的准确定位。PCR扩增大肠杆菌O157:H7 EDL933菌株的Z3955基因，扩增的基因片段连接pGEX-6P-1载体构建重组质粒，将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中，表达重组蛋白GST-Z3955,并用谷胱甘肽琼脂糖珠纯化。纯化的GST-Z3955免疫BALB/c小鼠产生抗血清。利用GST-Z3955蛋白的抗血清检测Z3955在细菌中的亚细胞定位。最终成功构建了能表达目的蛋白的大肠杆菌BL21(DE3)-pGEX-6P-1-Z3955重组菌。用纯化的重组GST-Z3955蛋白免疫小鼠，获得了Z3955多克隆抗体。免疫印迹确定Z3955抗血清的最佳工作浓度为1∶12 500。Z3955定位在大肠杆菌O157:H7的胞质、内膜、细胞周质和外膜，但不能分泌到细胞外。Z3955蛋白的亚细胞定位鉴定将有助于该蛋白的功能研究，并有助于了解Z3955在大肠杆菌...     

Stx1A-LHRH融合毒素基因的构建及高效表达

通过PCR方法,从肠出血性大肠杆菌O157:H7的基因组DNA中扩增出Stx1A基因序列,并将之与编码LHRH的基因序列连接起来,构建编码Stx1A-LHRH的重组融合基因片段,并定向克隆到表达质粒pET28a的NcoⅠ和EcoRⅠ位点之间,构建重组表达质粒pET28a::stx1A-LHRH,将重组质粒转化到宿主菌BL21(DE3)中。对重组菌株用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE电泳检测结果表明重组菌株表达出了23700的目的融合蛋白Stx1A-LHRH,目的蛋白为包涵体表达,经薄层扫描分析表明表达量约占菌体总蛋白的37.6%。为了将来更好的进行目的蛋白的功能研究,本研究再将融合基因片段克隆到表达质粒pMAL-p2x中实现了重组蛋白的可溶性表达,表达的重组蛋白经amylose亲和层析柱一步纯化后纯度可达93.4%,为下一步进行重组蛋白的活性分析及其生物学作用研究奠定了基础。     

肝片吸虫Fh8标签融合表达口蹄疫O型病毒结构蛋白

口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)的结构蛋白VP1难以实现体外的高效表达。本研究为获得良好免疫原性的VP1蛋白,选用肝片吸虫Fh8小肽段作为新型融合表达标签,构建重组Fh8-VP1免疫原,以期获得大肠杆菌中的高效表达。分别合成VP1的20~40aa和129~169aa之间的核苷酸片段,并用2个甘氨酸(GG)连接2个片段,合成的核苷酸片段(ΔVP1)克隆入Fh8标签之后,构建重组菌BL21(DE3)/pColdⅠ-Fh8-ΔVP1,SDSPAGE分析蛋白表达形式,Western blot方法检测重组His-Fh8-ΔVP1的抗原性。结果显示,成功构建重组质粒BL21(DE3)/pColdⅠ-Fh8-ΔVP1,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,且以包涵体形式存在于菌体蛋白,可与猪源FMDV阳性血清发生特异性反应。     

空肠弯曲菌FliD蛋白的原核表达与抗原性分析

为获得空肠弯曲菌FliD蛋白并分析其抗原性,研究扩增空肠弯曲菌标准菌株11168 fliD基因并构建原核表达质粒pColdⅠ-fliD和pGEX-6p-1-fliD,将重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达并纯化FliD重组蛋白;纯化后的His-FliD蛋白免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,经3次免疫后收集小鼠血清,间接ELISA结果显示小鼠多抗血清效价为25 600,Westernblot结果显示多抗血清能够与重组蛋白His-FliD特异性结合。研究成功表达空肠弯曲菌FliD蛋白并初步分析其抗原性,为进一步研究空肠弯曲菌与宿主间相互作用及FliD蛋白作为候选亚单位疫苗奠定理论基础。     

猪白细胞介素18成熟蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

通过RT—PCR方法从用PHA和LPS刺激的猪脾脏细胞中扩增出猪白细胞介素18(pIL-18)成熟蛋白基因的cDNA，克隆到T载体pUCm-T后，序列测定表明，pIL-18成熟蛋白基因核苷酸长度为474bp，编码157个氨基酸。将该基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a构建重组质粒pETIL18m，转化大肠杆菌BL21(DE3)，并用IPTG诱导。重组菌菌体裂解物SDS—PAGE可检测到相对分子质量为19000的重组蛋白，免疫印迹法证实该重组蛋白可以与人IL-18单抗发生特异性免疫反应。     

奶牛S100A12基因克隆、原核表达及体外抗菌活性分析

克隆奶牛S100A12基因并在大肠杆菌中高效表达.采用RT-PCR扩增奶牛外周血白细胞中S100A12基因,构建原核表达载体pCold TF-S100A12,在大肠杆菌BL21(DE3)中IPTG诱导表达并纯化.SDS-PAGE和Westernblotting分析显示S100A12基因以融合蛋白形式表达,表达量占菌体总蛋白的46.7％,纯化的重组蛋白(80 mg/L).琼脂扩散法测定重组蛋白对乳腺炎主要致病菌大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性.结果显示:重组蛋白对大肠杆菌有抗菌活性,而对金黄色葡萄球菌无抗菌活性.本研究为S100A12蛋白抗体制备及基因功能研究奠定了基础.     

人MxA基因的原核表达及其抗血清的制备

本试验旨在利用大肠杆菌BL21(DE3)表达MxA融合蛋白pET32a(+)-MxA,制备兔抗人MxA抗血清。采用PCR技术获得MxA基因,然后将MxA基因重组到pET32a(+)载体中,筛选阳性克隆,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,用超声波裂解重组菌BL21(DE3)培养物,纯化蛋白质后免疫新西兰兔制备抗血清。SDS-PAGE分析结果显示,pET32a(+)-MxA融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中以包涵体形式高效表达;获得的抗血清经间接ELISA法检测效价为1∶6400;Western blotting检测结果显示,抗血清可与真核表达的MxA蛋白进行特异性结合。试验结果表明,在大肠杆菌中成功表达了pET32a(+)-MxA融合蛋白,制备了具有高度特异性的兔抗人MxA抗血清,这样为采用酶标法测定病毒患者全血细胞或由干扰素诱导的细胞产生的MxA蛋白质含量及临床诊断试剂盒的开发和应用打下了基础。     

迟钝爱德华菌PuAH基因的原核表达及其部分特性分析

本试验旨在对迟钝爱德华菌EIB202 PuAH基因进行克隆表达,并对其部分特性进行分析。根据GenBank中发表的迟钝爱德华菌PuAH基因序列(登录号:CP001135,CDS编号:ETAE_0818)设计引物,克隆并通过表达载体pET32a重组表达该基因所编码的蛋白,纯化表达产物并制备兔抗血清,采用ELISA、Western blotting、溶血试验、菌体凝集试验分析所得融合蛋白的特性。结果显示,所得融合蛋白主要以可溶性蛋白的形式表达,蛋白分子质量约为42 ku;具有免疫原性和抗原性,对鳗鲡红细胞不具溶血性,但融合蛋白抗血清对迟钝爱德华菌EIB202膜蛋白提取物的溶血性有一定的抑制作用,且可以凝集迟钝爱德华菌EIB202菌体。     

大肠杆菌O157:H7菌毛分子伴侣基因的克隆与表达

根据Genebank中已登录的大肠杆菌O157:H7菌株EDL933基因序列中茵毛分子伴侣ycbR基因序列设计1对引物,并分别在其5'端分别加入Neo I、Xho I酶切位点,以大肠杆菌O157:H7国内分离株97094的DNA为模板,用聚合酶链反应(PCR)扩增出710 bp的DNA片段.回收并纯化该DNA片段,用限制性核酸内切酶Nco I、Xho I同时消化DNA片段和双酶切栽体质粒pET28a(+).将它们回收纯化并连接,然后转化到宿主菌大肠杆菌DH5a,从该菌中提取重组质粒,用PCR、限制性内切酶位点分析及核苷酸序列测定法对克隆的重组质粒进行鉴定,表明ycbR基因定向克隆到了载体质粒pET28a(+).再将重组质粒转化到表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3),在含Kan抗生素LB培养基中经IPTG诱导12～16 h,做SDS-PAGE分析,表明ycbR基因在菌株中获得高效表达,表达蛋白相对分子质量大小约为30 000,与预期结果一致.为研究大肠杆菌ycbR基因产物的功能和致病作用奠定了基础.     

大肠埃希菌O157∶H7 eae A基因的克隆及其表达质粒的构建

采用自行设计的引物,应用PCR方法直接从广东分离株大肠埃希菌O157∶H7021210的染色体DNA中扩增出eaeA基因的完整阅读框,得到了一条大小约为2 800 bp的基因片段。T-A克隆后将其亚克隆至原核表达载体pET-28a( ),经PCR鉴定、酶切鉴定及核苷酸序列测定,证实成功构建原核重组表达质粒pET-eaeA。大肠埃希菌O157∶H7 eaeA基因的克隆及原核表达质粒的成功构建,为下一步进行诱导表达、活性鉴定及eaeA基因表达蛋白诊断抗原的研制奠定了基础。     

弓形虫表面抗原糖蛋白相关序列SRS47D基因的原核表达及蛋白定位研究

为表达弓形虫表面抗原糖蛋白相关序列(surface antigen glycoprotein 1-related sequences,SRS47D)并确定其在弓形虫中的定位,本研究将SRS47D基因序列插入原核表达载体pColdⅠ,构建原核表达质粒pColdⅠ-SRS47D,转入大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况,Western blot分析重组蛋白的反应原性;利用His柱纯化重组蛋白,免疫新西兰兔,制备抗血清,通过间接ELISA检测血清效价;利用免疫荧光法检测蛋白在弓形虫速殖子中的定位。结果显示:成功构建了原核表达质粒pColdⅠ-SRS47D,在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达,表达产物约为55 kDa;重组蛋白能与感染弓形虫的小鼠血清发生特异性反应,免疫兔血清效价达到1∶51 200;免疫荧光检测结果显示,SRS47D蛋白分布在弓形虫速殖子表面,尤其前部和后部表膜。上述结果为进一步深入研究弓形虫SRS47D的特性和功能奠定了基础。     

凋亡蛋白融合基因在大肠杆菌中的表达及抗体制备

在获得凋亡蛋白融合基因重组质粒pMD18-T-EGF-PⅡ-Apoptin的基础上,成功地构建了重组表达质粒pET-28a-EGF-PⅡ-Apoptin,将阳性重组质粒转化表达受体菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达,进行表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测,结果表明,表达蛋白带位于33 kD处,凋亡蛋白融合基因获得高效表达,薄层扫描分析表明表达蛋白占菌体蛋白的40%.表达蛋白经透析袋电洗脱法纯化后,对獭兔进行常规免疫,应用ELISA检测到较高的多克隆抗体效价,表明此蛋白具有良好的抗原性.Westem blot结果显示,利用纯化包涵体制备的兔抗血清可以很好地和所表达的蛋白带特异性结合.     

大肠杆菌志贺毒素stxB融合基因的构建及其高效表达

利用PCR方法，从肠出血性大肠杆菌O157：H7的基因组DNA中，分别扩增出Stx1B和Stx2B亚基的结构基因片段，然后再通过PCR将这2个片段连接起来，并定向克隆到表达质粒pET28a的Nco1和EcoR 1位点之间，构建了重组表达质粒pMB1。将重组质粒转化到宿主菌BL21(DE3)中，对重组菌株BL21(pMB1)用IPTG进行诱导表达，并对最佳诱导时间进行了探索。SDS-PAGE电泳检测结果表明。重组菌株表达出了16300的目的蛋白Stx2B-L-Stx1B；经薄层扫描分析表明，表达量约占菌体总蛋白的68．4％，且目的蛋白为包涵体表达，表达量约占细菌沉淀的84．6％。研究还表明，未用IPTG诱导的BL21(pMB1)菌株也可有少量目的蛋白的基础表达。不同诱导时间的结果表明，在3～7h的诱导时间内，目的蛋白的表达量没有明显变化。     

禽腺病毒4型Penton和Fiber1蛋白原核表达及多克隆抗体的制备

为开展禽腺病毒4型(FAdV-4)五邻体蛋白(Penton)和纤丝蛋白(Fiber1)多克隆抗体的制备及评价,研究通过对Penton和Fiber1基因优势抗原表位基因片段进行生物信息学分析,设计特异性引物PCR扩增获得Penton和Fiber1优势抗原表位基因片段,将其克隆至原核表达载体pColdⅠ,转入表达宿主菌BL21(DE3)进行异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,将纯化、鉴定后的目的蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,对抗体进行Western blot鉴定及间接ELISA抗体效价测定。结果可见,FAdV-4 Penton基因序列共编码525个氨基酸,Fiber1基因序列共编码432个氨基酸,其优势抗原表位点分别有7、6个区域,且均集中于N端;成功构建pColdⅠ-P和pColdⅠ-F1重组原核表达质粒,其诱导表达的重组蛋白Penton和Fiber1均与His标签单抗发生特异性反应,动物免疫获得的Penton、Fiber1多克隆抗体均能与目的蛋白反应形成特异性条带,且Penton多克隆抗体效价高于Fiber1多克隆抗体。综上,研究获得的纯化重组蛋白Penton较Fiber...     

大肠杆菌O157 Z4182基因的克隆与表达

根据大肠杆菌0157z4182基因设计1对引物，并在其5'端分别加入NcoI、XhoI酶切位点，用聚合酶链反应（PCR）从本试验用的大肠杆菌O157及1株产志贺毒素大肠杆菌（STEC）08、1株肠道聚集粘附大肠杆菌（EAggEC)和1株产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）菌株中也扩增出了803BP的DNA片段。以大肠杆菌0157菌株94H的DNA为模板，用上述引物做PCR，将其产物连接到载体质粒pET28a( )，然后转化到宿主菌大肠杆菌LE392，从该菌中提取重组质粒，再将其转化到表达宿主大肠杆菌BL21（DE3），用PCR，限制性内切酶位点分析及核苷酸序列测定法对克隆的重组质粒进行鉴定，表明Z4182基因定向克隆到了载体质粒Pet28a( )。将转化子培养并经IPTG诱导后，做SDS-PAGE电泳，表明该菌株可以表达Z4182基因。本试验为阐明大肠杆菌O157Z4182基因的分布及探讨该基因产物的功能和致病作用奠定了基础。     

人补体C1INH基因的原核表达及其抗血清的制备

 采用PCR技术获得人补体C1INH基因全长,以其为模板扩增出抗原表位基因片段命名为C1,然后将C1片段重组到pET32a(+)载体中,筛选阳性克隆,转化大肠杆菌;IPTG诱导表达,用超声波裂解重组菌BL21培养物,纯化蛋白后免疫新西兰兔制备抗血清。SDS-PAGE分析表明,pET32a-C1融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中以包涵体形式高效表达;获得的抗血清经间接ELISA法检测效价为1∶6 400;Western-blot检测显示,抗血清可与原核表达的C1INH蛋白进行特异性结合,为进一步检测真核表达蛋白及研究rhC1INH的功能活性,并为C1INH的临床检测奠定基础。     

H7-HCP-Tir-Intimin高效降低小鼠粪便中大肠杆菌O157:H7排菌

构建BL21(PcoldⅠ-fliC-hcpA-tir-eae),并评价对小鼠的免疫原性,以期研制更加有效的候选免疫原,最大限度降低E.coli O157:H7对食物、环境和人类的危害。将946、423、309、811bp的fliC,hcpA,tir和eae基因被依次克隆,中间添加8个氨基酸的间隔序列,构建重组菌BL21(PcoldⅠ-fliC-hcpA-tir-eae)。进口白油和ISA50V作为佐剂与重组蛋白乳化,制备2种油乳剂疫苗,分别接种4周龄BALB/c雄鼠,二免21d,口服攻击E.coli O157:H7109 CFU/只,每天采集粪便,检测排菌。结果显示,2种重组疫苗均能够诱导高滴度血清IgG。ISA50V佐剂组抗体产生早于进口白油佐剂组,但进口白油佐剂组抗体滴度一致性更好。所有免疫组小鼠排菌极度降低,第1天排菌低于104 CFU/g,第5天检测不到排菌,整个检测期无反弹,而对照组在整个检测期排菌持续很高(>104 CFU/g)。结果表明,四价重组蛋白H7-HCP-Tir-Intimin能够高效降低口服大肠杆菌O157:H7后的排菌,极显著降低细菌的定植,很大程度减少病原传播,对环境和人类的威胁。     

支气管败血波氏杆菌黏附素基因的表达及抗原性分析

为了在大肠杆菌中表达支气管败血波氏杆菌prn基因并鉴定重组蛋白的抗原性,试验采用PCR方法以败血波氏杆菌的基因组DNA为模板扩增prn基因,插入到pMD18-T克隆载体进行测序,并将目的基因插入原核表达载体pPro-HTa中,构建重组质粒pPro-HTa-prn,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达该基因,并用SDS-PAGE和Western-blot检测该蛋白。结果表明:成功构建了重组质粒pPro-HTa-prn,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了prn基因;重组蛋白纯化前后均可与支气管败血波氏杆菌阳性血清发生特异性反应。说明支气管败血波氏杆菌prn基因获得成功表达,重组蛋白具有与天然蛋白一样的抗原特异性。     

PRRSV变异株ORF5全基因的可溶性表达与重组蛋白的纯化

为了获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株可溶性糖基化囊膜蛋白(GP5),从p MD18-T-ORF5(V)重组质粒中PCR扩增得到PRRSV变异株LX13(1)结构蛋白ORF5全基因编码区,并克隆至原核表达载体p Cold TF DNA上,得到重组表达质粒p Cold-TF-GP5(V),转化大肠埃希菌BL21中诱导表达,并通过SDS-PAGE和Western Blot鉴定分析。结果表明,目的基因插入位置和阅读框正确,成功表达的融合蛋白分子量约为75.2 ku,并以可溶性蛋白的形式存在,表达量约占菌体总蛋白含量的22.26%。该融合蛋白能与鼠抗His标签单克隆抗体发生特异性反应,说明重组蛋白具有反应原性。该可溶性重组蛋白的获得为研究PRRSV变异株GP5蛋白的抗原性奠定了基础。     

迟缓爱德华菌菌毛蛋白原核表达及多抗血清制备

为研究迟缓爱德华菌菌毛蛋白PILI的功能和免疫原性,本研究利用PCR方法从迟缓爱德华菌基因组中克隆出pili基因,并将其构建到pET-32a原核表达载体上,重组载体转化BL21大肠杆菌诱导重组蛋白表达,通过SDSPAGE和Western blot方法验证重组蛋白表达。用亲和层析方法纯化蛋白,纯化的蛋白免疫小鼠,所得的多抗血清能够特异性识别迟缓爱德华菌PILI蛋白,为研究PILI蛋白奠定基础。