犬瘟热病毒贵州分离株N基因的克隆及序列分析

根据GenBank中发表的犬瘟热病毒Onderstepoort株N蛋白基因序列设计两对特异性引物,采用RT-PCR扩增犬瘟热病毒贵州分离株(CDV-GZ1)的N基因,并进行克隆与序列分析。结果显示,CDV-GZ1株N基因的ORF全长1572 bp,其编码氨基酸序列与国外Shuskiy株和01-2689株的同源性分别为98.9%和97.1%,与部分国内分离株同源性在95%以上,说明N蛋白是保守性较强的结构蛋白。     

犬瘟热病毒贵州分离株H基因的克隆及其序列分析

根据GenBank中犬瘟热病毒Onderstepoort株序列设计特异性引物,以犬瘟热病毒贵州分离株(CDV-GZ1)RNA为模板,应用RT-PCR对病毒H蛋白编码基因进行了扩增、克隆及序列分析.测序结果表明,CDV-GZ1 H基因ORF由1 824 bp组成,可编码607个氨基酸;与已发表23株其它CDV H基因核苷...     

水貂犬瘟热病毒分离鉴定及其H基因序列分析

为了解山东地区水貂犬瘟热病毒(CDV)遗传变异特征,采集水貂养殖场的发病水貂病料,通过RT-PCR鉴定为CDV阳性,将阳性病料接种Vero/Dog SLAM细胞进行病毒分离,通过间接免疫荧光、电镜负染、测序等方法鉴定,得到4株犬瘟热病毒,分别命名为WD1株、WD2株、WX1株和WX2株。分离株H基因测序结果显示,WD1株、WD2株、WX1株均为Asia-Ⅰ型,其中WD1和WD2与近几年仅在水貂和狐狸养殖场流行的新犬瘟热毒株核苷酸和氨基酸序列同源性分别为97.5%~99.2%和97%~99%;WX-1型与国内犬源HL001株的同源性最高,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.6%和99.5%;WX2与疫苗株同属于一个分支,与疫苗毒Lederle株核苷酸和氨基酸序列同源性高达99.5%和98.8%。结果表明,水貂养殖场存在多株犬瘟热病毒混合感染的情况,提醒养殖场应注意防控,该结果也为犬瘟热病毒分子流行病学积累了资料。     

犬瘟热病毒F基因克隆及序列分析

从犬瘟热病毒检测阳性的3份(KM1、KM2、KM3)病料中进行F基因的克隆测序,并与其他5株代表性参考毒株的同一基因序列进行比较(国内外流行毒株以及疫苗毒株).结果表明,KM1与KM2有95.7%的核苷酸同源性,其氨基酸序列完全相同;KM3株与KM1有1个氨基酸的差异,与参考的5株犬瘟热病毒的F基因核苷酸和氨基酸分析同源性分别为91.1%～96.5%和96.8%～100%.     

犬瘟热病毒强毒株在Vero-SLAM细胞上传代后的基因突变分析

为了了解犬瘟热病毒强毒株全基因组序列在Vero-SLAM细胞上传代培养后的突变情况,本试验利用犬瘟热病毒强毒分离株HeBei株第12代细胞毒,通过RT-PCR方法分段扩增犬瘟热病毒全基因,对扩增出的各个片段进行克隆和鉴定,并应用SeqMan程序将所测得的序列进行拼接成Hebei株全长cDNA序列。结果表明,全基因与原始序列相比有24处碱基突变,总突变率为0.15%,其中3处为非编号码区的突变,其余21处在编码区,碱基突变率最高的蛋白基因为F(0.36%),最低为N(无突变)。氨基酸突变率分别为N蛋白0.00%;P蛋白0.39%;M蛋白0.30%;F蛋白0.60%;H蛋白0.50%;L蛋白0.18%。表明犬瘟热病毒强毒株经Vero-SLAM细胞传代培养后基因突变主要发生在F蛋白基因上。     

不同禽源副黏病毒分离株F基因的克隆与序列分析

分别对鸡源、鸭源、鹅源新城疫病毒(NDV)强毒分离株(WF00C、WF00D、WF00G)的F基因进行RT-PCR扩增、克隆和序列测定,并对其核苷酸和推导氨基酸序列进行分析.结果表明,各分离株F基因均含1个完整的开放阅读框(ORF),全长为1662 bp,编码553个氨基酸,有6个潜在的糖基化位点,裂解位点区的氨基酸序列均为112R-R-Q-K-R-F117,与强毒株特征相符,具有第101位的K(赖氨酸)和121位的V(缬氨酸),符合基因VK型NDV特征;WF00C株有13个半胱氨酸(Cys)残基,WF00D株和WF00G株各有12个Cys残基;在限制性内切酶(RE)位点(nt334～1682)的分布上,3个毒株均存在多数鹅源分离株特有的973 nt和1249 nt Rsa Ⅰ位点;WF00D株与WF00C株、WF00G株以及GenBank的15株各基因型代表株的F基因编码区同源性进行比较,其核苷酸序列同源性为84.7 %～99.3%,推导的氨基酸序列同源性为88.4%～98.9%;3个分离株间的同源性较高,其与ZJ1、SF02和NA_1等鹅源毒株之间差异较小,而与LaSota、F48E9等毒株之间差异明显.根据NDV系统发育进化树、酶切位点分析以及基因分型结果,证明它们的基因型均为Ⅶd亚型.     

犬瘟热病毒蓝狐株的分离鉴定

为了对狐犬瘟热的防治提供参考依据,试验通过观察接种分离病毒细胞的细胞病变(CPE)情况,结合反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、核苷酸序列同源性分析对从疑似犬瘟热死亡的蓝狐脾脏中分离出的病毒进行了鉴定。结果表明:该毒株可使培养细胞出现明显的细胞病变。提取感染细胞的总RNA进行RT-PCR,扩增出1 044 bp的融合蛋白基因片段,大小与预期值相符;分离毒株与GenBank中已发表的10株犬瘟热毒株核苷酸序列同源性为92.9%～97.1%,氨基酸序列同源性为96.3%～97.7%。说明分离株为犬瘟热病毒。     

犬瘟热病毒蓝狐分离株融合蛋白基因的序列分析

根据已发表的犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)Onderstepoort株序列设计1对引物,RT-PCR法扩增出约1 000 bp的融合蛋白基因片段,通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pMD18-T载体。序列分析表明CDV蓝狐分离株F蛋白基因片段由1 044 bp组成,编码348个氨基酸,与其它CDV25259株、2544-Han95株、A75-17株、DOGDK91C株、5804P株、ONP株、PDV-2株核苷酸序列同源性分别为94.5%、94.1%、94.7%、94.2%、94.2%、97.6%和94.9%;氨基酸序列的同源性分别为98.6%、97.1%、98.0%、98.0%、98.3%、97.7%和98.6%;与其它CDV毒株相比,蓝狐分离株存在核苷酸缺失突变(1 030位～1 038位)和氨基酸缺失突变(344位～348位)。     

新城疫病毒广东分离株F基因的克隆与序列分析

为研究新城疫病毒(NDV)基因变异情况,用RT-PCR扩增了9个广东分离株的F基因cDNA片段,并将其分别克隆到pGEM-Teasy载体中。序列分析结果表明,上述分离株F基因长度为1 662 bp,编码553个氨基酸,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为95.1%~99.2%和96.0%~99.8%;但与LaSota、Roakin、F48E9及B1等常见疫苗株的氨基酸同源性仅为87.6%~92.2%。9个NDV分离株F蛋白裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q/R-K-R-F-I-G119,与平均致死鸡胚时间(MDT)、脑内接种指数(ICPI)等病毒致病力测定结果相符,均属于基因Ⅶ型NDV。     

1株越南斗鸡新城疫病毒的分离和分子鉴定

从一起新城疫暴发的病例中分离出1株新城疫病毒(NDV),命名为贵州分离株(DQ)。用RT-PCR方法扩增了贵州分离株的整个F基因片段,并将其克隆到pMD18-T载体中。序列分析结果表明,上述分离株F基因长度为1 662 bp,编码553个氨基酸。该毒株与国内2株分离株(CH2000、TW2000)之间的亲缘关系较近,其核苷酸和氨基酸序列同源性分别为95.7%~96.6%和96.6%~96.8%;但与LaSota、B1及F48E9等常见毒株的核苷酸和氨基酸同源性仅为84.0%~86.5%和87.2%~89.9%。DQ分离株在F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112R-R-Q-K-R-F117,与NDV强毒株特征相符,且具有101处的K(赖氨酸)和121处V(缬氨酸)2个特征性氨基酸,与NDV基因Ⅶ型的特性完全相符。利用MegAlign软件绘制NDV的系统发育进化树,结果表明,该分离株为基因Ⅶd亚型。     

一株基因Ⅸ型鸭源新城疫病毒F基因的克隆及序列分析

从广东地区疑似患有新城疫的病死雏番鸭群中分离到1株新城疫病毒,命名为GD1002株。毒力测定结果表明,致死鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)、6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)分别为56.0 h、1.64、2.29,符合强毒株的毒力判断标准。利用RT-PCR扩增了该分离株F基因的主要功能区片段,并进行了克隆与序列分析。该分离株F蛋白裂解位点的组成为¹¹²R-R-Q-R-R-F¹¹⁷,具有典型新城疫强毒株的分子特征。F基因第47-420 nt片段基因分型分析表明,该流行株属于基因Ⅸ型。相似性及遗传进化分析结果表明,该分离株与基因Ⅸ型毒株F₄₈E₉、JS/1/97/Ch和FJ/1/85/Ch株有较高同源性和较近的亲缘关系。     

犬冠状病毒小膜蛋白基因的分子克隆与序列分析

首次对犬冠状病毒(CCV)V1株和DXMV株小膜蛋白(SM)基因进行了克隆和序列测定.用RT-PCR对分离的CCV V1和DXMV野毒株SM基因进行了扩增,并将其克隆到pMD18-T中进行核苷酸序列测定.结果两毒株SM基因ORF全长均为246bp,编码82个氨基酸;与GenBank中CCV标准毒株Insavc-1 SM基因相比,核苷酸和推导的氨基酸序列同源性分别为100%、92.1%和100%、90.9%.DXMV株与Insavc-1株SM基因相比有9个碱基发生了改变,导致4个氨基酸发生变化.对冠状病毒科中不同的冠状病毒SM基因及其推导的氨基酸序列聚类分析表明,冠状病毒可分为4个群,群内不同冠状病毒SM基因及其蛋白显示出很高的同源性,而不同群之间的同源性却较低.     

浙江省猪流行性腹泻病毒S1基因克隆与序列分析

本研究旨在分析浙江省猪流行性腹泻病毒（PEDV）的遗传变异情况,利用实时荧光定量RT-PCR方法对2015-2016年浙江省内收集的58份猪腹泻样品进行检测,设计2对特异性引物对16份来自浙江不同地区PEDV阳性样品的S1基因进行RT-PCR扩增、克隆及序列测定,并应用生物信息学软件对16株PEDV浙江毒株的S1基因进行分析。结果显示,48份样品为PEDV阳性。16个毒株之间S1基因片段核苷酸和氨基酸同源性分别为93.1%~99.8%和92.4%~99.7%,与疫苗株CV777的核苷酸同源性为92.3%~95.7%,氨基酸同源性为90.7%~95.7%。与疫苗株CV777相比,15个毒株在S1基因区域存在着15个核苷酸插入和6个核苷酸缺失。系统进化分析表明,大部分毒株与国内外流行的基因Ⅱ型PEDV毒株亲缘关系较近,15个毒株与2011-2016年中国流行的基因Ⅱ型PEDV毒株核苷酸和氨基酸同源性均在96.6%以上;与早期分离的CV777株、LZC株亲缘关系较远,核苷酸和氨基酸同源性均在93.4%以下;1个毒株（ZJ16NB6）与国内外流行的S-INDEL样毒株较近,核苷酸和氨基酸的同源性较高,均在98.4%~99.5%之间。本研究结果表明,2015-2016年浙江省仔猪腹泻主要是由PEDV感染引起的,浙江省流行的PEDV同时存在着基因Ⅱ型和S-INDEL样毒株,但以基因Ⅱ型毒株为主。     

猪链球菌血清2型JX02株溶血素基因的克隆及序列分析

采用特异性引物对猪链球菌2型(Streptococus suis type 2)JX02菌株进行PCR扩增，将扩增到的溶血素基因克隆到pMDl8-T质粒栽体中，经鉴定后测序。结果显示，扩增的JX02株溶血素基因长度为1494bp，与P1／7株和US-1933株等进行序列比较，核苷酸同源性为100％和99．7％，氨基酸序列同源性为100％和99．8％。     

Cloning and Genetic Variation Analysis of NSP2 Gene of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Guizhou Strain GZ-R

In order to investigate the genetic variation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) strain GZ-R and the characteristics of NSP2 gene,in this study,two specific primers were designed based on NSP2 gene for nested RT-PCR,cloning and sequence analysis of the target gene.The results showed that the second round of nested PCR not only amplified the expected band of about 3 000 bp,but also amplified another band of 1 200 bp.The two DNA fragments were cloned into the pMD19-T vector,and two fragments were obtained by sequencing.The large fragment was 2 980 bp long and named as GZR-NSP2-L.The small fragment was 1 131 bp long and named as GZR-NSP2-S.The homology comparison results of the two fragments showed that GZR-NSP2-S had GZR-NSP2-L N-terminal nucleotide 1-945 and C-terminal 2 795-2 980 nucleotide,and lack of nucleotide between bits 946-2 794 in GZR-NSP2-L.The nucleotide homology of GZR-NSP2-L with VR-2332 strain and Lelystad virus strain was 81.2% and 48.6%.The results of homology comparison of encoded amino acids were consistent with the results of nucleotide homology,revealing that the PRRSV GZ-R strain belonged to the American-type strain.Comparison of amino acid deletion sites revealed that GZ-R NSP2 had 30 discontinuous amino acid deletions at positions 481 and 533-561.The deletion sites were consistent with PRRSV highly pathogenic strains.In summary,the PRRSV GZ-R strain could be identified as American-type highly pathogenic strain.The experimental results could provide some references for further exploring the epidemic trend of PRRSV in Guizhou province and the mechanism of NSP2 in PRRSV replication.     

猪巨细胞病毒福建株DPOL基因的克隆及序列分析

为了明确猪巨细胞病毒（porcine cytomegalovirus,PCMV）福建株（PCMV-FJ01株）DPOL基因特征,本研究根据GenBank数据库中PCMV DPOL基因序列特征,利用引物设计软件Oligo 7.0设计针对DPOL基因的引物,以PCMV-FJ01株核酸DNA为模板,对其进行分段PCR扩增。将分段扩增的产物经胶回收试剂盒回收后进行克隆测序,对测序结果进行拼接后获得PCMV-FJ01株DPOL基因序列,并进行生物信息学分析。结果表明,PCMV-FJ01株DPOL基因全长为3 021 bp,编码1 006个氨基酸;其与GenBank中的PCMV分离株DPOL基因核苷酸和氨基酸同源性分别在98.7%和99.1%以上。遗传进化分析发现,相对于巨细胞病毒属其他种代表株,PCMV分离株DPOL基因在遗传进化上和玫瑰疱病毒属代表株更近。建议根据PCMV DPOL基因遗传进化特征,将其划归为玫瑰疱病毒属的一个病毒新种--猪玫瑰疹病毒（porcine roseolovirus）。     

Cloning and Sequencing Analysis of DPOL Gene of Porcine Cytomegalovirus

In order to know the DPOL gene characterization of porcine cytomegalovirus (PCMV) (PCMV-FJ01 strain),three pairs of specific primer were designed by Oligo 7.0 software based on comparison the characterization of DPOL gene retrieved from GenBank.The target DPOL gene fragments were amplified using PCR methods with the strain PCMV-FJ01 genomic DNA. The target PCR fragments were cloned and sequenced. The assembly sequences were bioinformatics analysis. The DPOL gene of PCMV-FJ01 strain was 3 021 bp in length, coding 1 006 amino acids. The results showed that the homology of the nucleotide sequence and amino acid sequence were above 98.7% and 99.1%, respectively. Phylogenetic analysis revealed that the PCMV was closer with genus Roseolovirus rather than genus Cytomegalovirus. The results suggested that PCMV should be new species under genus Roseolovirus base on the phylogenetic relationship.     

猪细小病毒自然弱毒N株VP1基因的扩增与序列分析

对猪细小病毒自然弱毒N株（PPV—N株）VP1基因扩增及测序,利用生物信息学技术预测VP1蛋白的二级结构与B细胞抗原表位,以及分析该蛋白的氨基酸差异位点及密码子偏爱性。结果表明,PPV—N株VP1基因与弱毒参考毒株NADL-2VP1基因同源性最高,亲缘关系最近。PPV—N株VP1蛋白的二级结构较为复杂,以β-折叠为主,并有较多的转角和无规则卷曲区域,在序列的20～56、61～80、86～130、136～188区域为B细胞抗原表位的优势区域。PPV强、弱毒株VP1蛋白存在5个氨基酸差异位点（T-365-I,G-528-D,Q-533-H,P-586-S,K-715-R）,这些位点处氨基酸残基抗原性与毒力成正相关。PPV—N株VP1蛋白在A、C、E、G、H、I、K、N、Q、R、S、T、V和Y氨基酸于密码子选择上存在一定的偏爱性。