检测猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ抗体乳胶凝集试验方法的建立

采用Ni-NTA His.Bind方法纯化pET-28a-ApxⅣ2表达蛋白,以羧化乳胶为载体,经化学交联法致敏乳胶,对致敏条件优化后进行质量检测。结果显示,在pH 4.7的PBS缓冲液中,乳胶浓度为2%、蛋白质量浓度为1.5g/L,偶联8h后制备的致敏乳胶凝集反应最好,致敏乳胶抗原无自凝现象;与副猪嗜血杆菌、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、大肠杆菌和多杀性巴氏杆菌阳性血清不发生凝集;批内重复、批间重复试验很稳定;阳性血清敏感性可达1∶32。对比试验中与ELISA方法的符合率为80%,2种方法检测的结果基本相符。结果表明,试验初步建立了检测猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ毒素抗体的乳胶凝集方法,为猪传染性胸膜肺炎的快速诊断提供了技术支撑。     

副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速鉴别诊断副猪嗜血杆菌的方法,本试验针对副猪嗜血杆菌infB基因序列,利用Premier5.0软件设计并合成了1对特异性引物,建立了针对副猪嗜血杆菌的PCR鉴别诊断方法,优化了退火温度,检测了该方法的敏感性和特异性,结果表明,本试验建立的PCR检测方法的最佳退火温度为49℃。敏感性试验表明,该PCR检测方法最低能检测到的DNA浓度为18.1×10-6μg/mL。通过特异性试验表明,本方法仅可由副猪嗜血杆菌中扩增出特异性条带,在金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等病原菌中扩增不出相应的条带,表明该方法具有较高的特异性。同时,通过对本方法检测出的阳性样品infB序列分析发现,与GenBenk中公布的副猪嗜血杆菌infB序列同源性均在98.2%~99%。表明建立的方法灵敏度高、特异性强,可以应用于副猪嗜血杆菌的实验室诊断。     

副猪嗜血杆菌病诊断方法研究进展

副猪嗜血杆菌病快速敏感的检测技术不仅对于及时采取措施防控疫情蔓延等至关重要,还能及早发现新菌株,找出最危险的病原菌并开发相关疫苗,在防控疫情时掌握主动.用于诊断副猪嗜血杆菌病的方法有很多,其中有适合临床大批量血清检测的ELISA方法,ELISA具有操作步骤简单、敏感性高和特异性好等很多优点.     

2012～2014年江西地区副猪嗜血杆菌分离株ERIC-PCR指纹图谱分析

在对15种副猪嗜血杆菌血清型参考株鉴定获得15种不同ERIC-PCR指纹的基础上,对2012~2014年分离自江西地区41株副猪嗜血杆菌临床分离菌株进行指纹鉴定。结果表明,41株副猪嗜血杆菌产生20种不同的指纹图谱,相同血清型的菌株表现出不同的指纹图谱,无法进行血清分型的副猪嗜血杆菌应用该方法可得到充分区分。该方法证实副猪嗜血杆菌ERIC-PCR指纹图谱存在丰富的多样性,可适用于副猪嗜血杆菌的快速基因分型及分子流行病学调查。     

副猪嗜血杆菌病原检测及aroA基因PCR-RFLP分型

本试验应用PCR方法及PCR-RFLP技术对aroA基因在副猪嗜血杆菌病原检测及基因分型中的作用进行探讨。以针对aroA基因的PCR引物成功检测出18株来自广西各地区猪场的副猪嗜血杆菌,敏感性检测结果表明,该PCR方法可检测的最低菌数为10²个。对该18株副猪嗜血杆菌进行aroA基因的序列测定,并进行aroA基因的酶切位点分析,筛选出Hind Ⅲ和FokⅠ两种限制性内切酶,利用PCR-RFLP技术对1株血清5型参考菌株与本研究中18株广西菌株aroA基因的完整编码序列进行Hind Ⅲ和FokⅠ限制酶谱分析,结果显示可分为与毒力相关的3种谱型。本研究结果表明,应用PCR方法及PCR-RFLP技术对副猪嗜血杆菌进行检测分析有助于更好地研究副猪嗜血杆菌的生物学特性及aroA基因的功能。     

副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立与初步应用

为了解副猪嗜血杆菌病在贵州对猪群的危害和流行规律、进一步开展副猪嗜血杆菌病的防治研究提供参考依据,特进行副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立与初步应用研究。根据副猪嗜血杆菌（HPS）16S rRNA基因序列设计1对引物,通过优化组合试验,对贵州省分离的HPS进行PCR扩增,扩增出长为650bp的目的基因片段,而大肠埃希氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌、葡萄球菌等扩增结果为阴性。采用该方法对贵州发病猪群中350头疑似病例进行PCR检测,检出率为8％～49％。该方法检测副猪嗜血杆菌敏感性高、特异性好,可用于副猪嗜血杆菌的快速诊断。     

副猪嗜血杆菌病的PCR诊断与病理组织学观察

为了诊断副猪嗜血杆菌病和研究其病理组织学变化,采集疑似副猪嗜血杆菌病病猪的主要病变组织器官,进行细菌分离和PCR检测,并观察各器官的病理组织学变化。结果表明:分离的菌株和副猪嗜血杆菌标准菌株均扩增出650 bp左右的特异性目的条带,且分离菌株与标准菌株的序列同源性高达99%,诊断为副猪嗜血杆菌感染。病理组织学观察可见肺脏组织出血,肺泡间质增宽,心脏和肝脏严重出血、瘀血和充血,肾小球萎缩和淀粉变性,炎性细胞浸润。说明副猪嗜血杆菌对猪各组织器官均有不同程度的损伤,尤以肺脏病变最为严重。     

副猪嗜血杆菌广东流行株的分离鉴定与基因分析

本研究从广东省各个地区送检病料中成功分离鉴定了4株副猪嗜血杆菌,并且针对副猪嗜血杆菌16S rRNA基因特异性进行PCR检测和基因测序同源性分析,通过GenBank联机比对分析,所分离的菌株与国内外菌株16S rRNA序列同源性在98.2%以上,分离菌株之间同源性在99.6%~100%之间,证明了所暴发的菌株是副猪嗜血杆菌。     

副猪嗜血杆菌OMP P5间接ELISA抗体检测方法优化

利用副猪嗜血杆菌(HPS)OMP P5基因表达并纯化复性后蛋白作为包被蛋白,通过对最佳加样作用时间的确定和最佳酶标二抗反应时间等条件的探索优化,建立针对副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5(OMPP5)的间接ELISA抗体检测方法,通过对进行和未进行HPS免疫的健康猪血清的检测,证实了建立的间接ELISA方法具有敏感性高、特异性强、反应快速准确等特点,可用于HPS的快速诊断     

副猪嗜血杆菌和猪链球菌双重PCR方法的建立与应用

针对副猪嗜血杆菌和猪链球菌16S rRNA序列各设计1对特异性引物,分别能扩增出822 bp和294 bp的DNA片段,并据此建立了快速准确鉴别副猪嗜血杆菌和猪链球菌的双重PCR方法,临床试验证明该方法具有很好的特异性、敏感性,能对临床病料进行鉴别诊断.对161份临床样本检测结果显示,副猪嗜血杆菌的检出率为23.75%,猪链球菌的检出率为43.48%,二者混合感染率为9.94%.     

副猪嗜血杆菌分离鉴定及药敏试验

副猪嗜血杆菌能够引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎等,是影响猪的最重要细菌之一,目前在所有的主要养猪国家均有存在。为了弄清河南省副猪嗜血杆菌病流行情况,2012年-2015年,从河南不同地区猪场送检的疑似病料,进行副猪嗜血杆菌分离和鉴定,共分离到5株细菌,通过细菌形态观察、培养特征鉴定、生化试验、PCR检测,鉴定为副猪嗜血杆菌,分别命名为A6-fei、C3-xin、C12-xin、D2-fei和E1-fei。采用纸片扩散法,对分离5株副猪嗜血杆菌进行药敏试验,其结果表明所分离的5株副猪嗜血杆菌的药物敏感性不尽相同,各分离菌株对头孢噻肟、氟苯尼考星最敏感,对复方新诺明敏感性最差,其中菌株C3-xin对复方新诺明、庆大霉素、卡那霉素、青霉素完全耐药。表明副猪嗜血杆菌病在河南省依然存在,并且不同地区菌株对常用药物的敏感性各不相同,应当引起养猪场重视。     

副猪嗜血杆菌广东分离株外膜蛋白P5基因的克隆及蛋白结构预测

根据GenBank上发表的副猪嗜血杆菌(HPS)外膜蛋白基因的核苷酸序列设计并合成1对特异性引物,从广东省HPS分离株外膜蛋白P5基因中扩增出与预期设计的1116bp大小相符的片段,将扩增产物连接到pMD18-T载体上,进行序列测定和分析。结果表明,克隆出HPS广东分离株的目的基因,核苷酸长为1116bp,共编码371个氨基酸,与已发表的HPS(SH0165)外膜蛋白基因核苷酸序列同源性100%,氨基酸同源性100%。生物学预测分析结果显示,HPS外膜蛋白是一种混合型结构蛋白,含有α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲,其β-转角和无规则卷曲区域可能形成抗原表位;其N端含有1个信号肽,最佳切割位点在21～22个氨基酸;有15个抗原决定簇;无跨膜区;同源建模分析,未见相似三维结构。     

Purification and renaturation of membrane neuraminidase from Haemophilus parasuis

Haemophilus parasuis, which causes polyserositis, polysynovitis, meningitis, septicemia, and pneumonia in pigs, has emerged as an increasing problem in modern swine production systems. Co-factors for and the pathogenesis of H. parasuis disease are not defined. One of the potential virulence factors of H. parasuis is its neuraminidase (sialidase). While purifying the H. parasuis neuraminidase from the membrane fraction, we developed a protocol to renature enzymatic activity after enzyme preparations were resolved electrophorectically in denaturing polyacrylamide gels. The H. parasuis neuraminidase co-resolved with recombinant neuraminidase of Vibrio cholera; thus its apparent molecular mass is 82 kilodalton (kDa). The H. parasuis neuraminidase was associated with the membrane fraction and the purification protocol removed over 99% of the H. parasuis cell protein while retaining over 90% of the neuraminidase activity. Purified protein will provide another avenue to clone the neuraminidase gene that has been refractory to cloning and the protocol will be a means to purify recombinant protein.     

副猪嗜血杆菌PCR快速诊断方法的建立

副猪嗜血杆菌营养要求比较苛刻,常规生化试验检测方法比较烦琐,本研究针对副猪嗜血杆菌16SrRNA基因特异性PCR引物序列,合成一对PCR引物,建立相应的PCR检测方法,同时对该方法的灵敏性、特异性等实验。结果显示可检测出浓度为2．8×10^3CFU／mL的副猪嗜血杆菌表明该方法灵敏度高;对大肠杆菌、链球菌、巴氏杆菌、沙门氏杆菌、金黄色葡萄球菌进行PCR扩增均不获得任何条带,表明该方法特异性较强。所以该方法对于临床快速检测副猪嗜血杆菌具有重要意义。     

副猪嗜血杆菌江西株的分离鉴定及药敏试验

从江西省彭泽县某猪场出现咳嗽、呼吸困难、胸膜有化脓性纤维蛋白渗出物病变的病死猪中分离到4株革兰氏阴性细小杆菌,对其进行培养特性和生化特性鉴定;用副猪嗜血杆菌16S rRNA的特异性PCR引物,通过PCR技术可从分离菌中扩增出821 bp的特异基因片段,表明该分离菌株为副猪嗜血杆菌。药敏试验结果表明,4株分离菌对头孢唑啉高度敏感,对头孢哌酮、氯霉素等敏感,而对复方新诺明、青霉素G等有抵抗力。小白鼠攻毒试验结果显示4株分离株均有致病性。     

副猪嗜血杆菌的分离与鉴定

从福建省龙岩市l例临床症状、病理剖检变化疑似副猪嗜血杆菌病的患病猪的关节液中分离到1株革兰氏染色阴性可疑菌株,经卫星现象、生化鉴定等实验室诊断,进一步以副猪嗜血杆菌的16S rRNA基因设计特异性引物进行PCR鉴定,确定该分离菌为副猪嗜血杆菌。药敏试验结果表明,分离株对环丙沙星、卡那霉素、强力霉素、氨苄西林、阿米卡星、庆大霉素药物敏感;对泰妙菌素、诺氟沙星有抵抗力。     

噬菌体展示技术筛选副猪嗜血杆菌外膜蛋白P5的抗原表位

为了研究副猪嗜血杆菌（HPS）外膜蛋白P5的抗原表位,应用噬菌体展示随机12肽库,以抗HPS外膜蛋白P5的单克隆抗体作为固相分子,进行了3轮筛选。对随机挑选出的10个分离间隔良好的噬菌斑进行ELISA和West—ernblot等检验,最终确定了4个各结果均为阳性的优势短肽。将4个短肽序列与GenBank中HPS外膜蛋白p5的序列进行比对分析,发现这些序列没有同源性或同源性较低,但竞争ELISA结果显示这些短肽与单抗的结合都能够被外膜蛋白P5有效的抑制。以上结果显示,通过噬菌体展示技术成功获得了4个HPS外膜蛋白P5的模拟表位,为后期开展以抗原表位为基础的诊断、表位疫苗等研究提供了依据。     

副猪嗜血杆菌的分离鉴定及16S rRNA序列分析

从云南某规模化养猪场病猪肺脏分离到1株革兰氏阴性小杆菌,经细菌生化鉴定、PCR鉴定和16S rRNA序列比对鉴定为副猪嗜血杆菌。抗生素药物敏感试验结果表明,分离菌株对四环素、红霉素、氯霉素、头孢噻吩高敏;对庆大霉素、氧氟沙星、诺氟沙星中敏;对磺胺甲唑耐药。16S rRNA分析结果表明,该分离株与GenBank中的Hps参考株AB078973(基因登录号)同源性为100%,将分离菌株鉴定为副猪嗜血杆菌。16S rRNA遗传进化关系表明,分离株与副猪嗜血杆菌3株血清5型参考株AB078972、AB078973、AB078974的16S rRNA序列位于一个分支上,遗传进化关系最近,它们之间的核苷酸同源性在99.0%~99.4%之间,初步鉴定为血清5型副猪嗜血杆菌,致病性试验结果表明,分离菌株对小白鼠有强致病性,命名为YN-1株。     

副猪嗜血杆菌病研究进展

近年来,由副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)所引起的猪群多发性浆膜炎和关节炎在中国各地屡有发生,对仔猪和青年猪造成严重危害,给养猪业带来了巨大的经济损失,目前,该病已成为全球范围内影响养猪业的典型细菌性疾病。副猪嗜血杆菌血清型复杂,分离培养困难。为了全面认识该病,对其病原学、病理变化、流行病学、致病因子、诊断方法、免疫防治等进行了综述。     

Detection of Haemophilus parasuis and Mycoplasma hyorhinis in swine and association of those pathogens with clinical and pathological-anatomic findings

In routine diagnostic it is difficult to detect a Haemophilus parasuis infection causing a polyserositis. In the presented study, a detection method by means of PCR, from collective swabs of the serosal surfaces from animals, with and without fibrinous serositis, was investigated. A significant association was detected between post mortal findings of fibrinous serositis and molecular biological detection of Haemophilus parasuis and Mycoplasma hyorhinis. However, no significant association existed between cultural detection of Haemophilus parasuis in bronchoalveolar lavage fluid and pathological-anatomical ascertainable fibrinous serositis. A significant association between Haemophilus parasuis and Mycoplasma hyorhinis could be determined in the animals that were included in this study.