三重PCR和双重荧光探针法检测ALV-A/J亚群方法的建立与应用

为快速检测禽白血病病毒（avian leukemia virus,ALV）并同时鉴别A亚群（ALV-A）和J亚群（ALV-J）,根据ALV不同亚群基因设计特异性引物和Taq Man荧光探针,经优化反应条件,建立通用型、A亚群与J亚群三重PCR以及A亚群与J亚群双重荧光探针检测方法。结果显示：三重PCR检测方法能特异性扩增ALV所有亚群以及A亚群和J亚群,检测灵敏度达1×103拷贝/μL;建立的ALV-A/J双重荧光探针检测方法特异性强,可检测的最低拷贝浓度为40拷贝/μL。本研究建立的三重PCR方法与商品化ALV实时荧光PCR检测试剂盒均有较高的符合率（Kappa系数> 0.75）;针对24份发病鸡精液,ALV-A/J双重荧光探针检测方法与商品化ALV实时荧光PCR检测试剂盒检测结果一致;本研究建立的两种检测方法均能同时鉴别出ALV A亚群和J亚群。利用本研究建立方法对安徽省394份临床样本进行检测,发现ALV总阳性率为38.58%,以J亚群单一感染为主,同时伴有A亚群单一感染以及A/J亚群混合感染。结果表明,本研究建立的ALV-通用型/A亚群/J亚群三重PCR方法和ALV-A/...     

不同ELISA检测方法在检测出壳雏鸡禽白血病病毒感染中的应用

通过雏鸡胎粪中群特异性衣壳蛋白27(p27)抗原检测以判定禽白血病病毒(ALV)垂直传播是实施禽白血病净化的关键步骤,为对比不同ALV-p27抗原ELISA试剂盒对我国四类广泛流行的亚群ALV垂直传播的检测效果,本试验设置ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K感染组,以无菌生理盐水作为对照组,在8胚龄时以卵黄囊接种的方式感染SPF鸡胚,建立鸡胚携带ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K的垂直感染模型。采集各组雏鸡胎粪样品和血浆样品,死亡鸡胚肝脏样品,死亡雏鸡胎粪样品、血浆样品和肝脏样品,其中血浆和肝脏样品需接种鸡胚成纤维细胞系(DF-1细胞)进行病毒分离,各样品以4家公司提供的ALV-p27抗原ELISA试剂盒进行检测,并以实时荧光定量PCR(RT-qPCR)进行平行检测,比较阳性检出率和灵敏度。结果显示,4家公司的ALV-p27抗原ELISA试剂盒对于同一样品的阴阳性判定结果基本一致,但灵敏度存在差异;胎粪样品直接ELISA检测不能将ALV阳性鸡只全部检出,相对于胎粪样品,血浆和肝脏病毒分离样品ELISA检测更具有灵敏度优势。本试验所建立的对比方法不仅有助于评估4家公...     

拉米夫定对禽白血病病毒的体内外抑制效应及其应用

为鉴定逆转录酶抑制剂类药物拉米夫定(LAM)对禽白血病病毒(ALV)体内和体外抑制效应及其在辅助ALV净化中的作用,本研究首先通过在培养液中添加不同浓度LAM连续进行DF-1细胞传代,并利用CCK-8法测定细胞活性,确定添加不超过5μg/m L的LAM对于DF-1细胞生长无影响,但与不添加药物的对照组相比可以显著抑制J亚群ALV(ALV-J)在DF-1细胞中的增殖。体内试验证实,在4 mg/只/d连续用药7 d情况下,感染ALV-J鸡群在第9周时病毒血症完全消除。此外,新城疫病毒活疫苗人工污染A亚群ALV(ALV-A)后,利用LAM连续干预,结果显示,经过LAM两代干预后可有效去除毒种中ALV-A污染。结果表明LAM对ALV-J和ALV-A均具有抑制作用,有助于降低ALV感染率和疫苗外源病毒污染,从而促进不同鸡群中ALV的净化。     

基于Multi-PCR的淮南王土鸡J亚群禽白血病诊断及病原鉴定

为确诊疑似J亚群禽白血病病例,试验从湖北某养殖户送检的散养淮南王土鸡典型病变组织中,提取DNA,用分别针对A、B、J亚群禽白血病病毒(ALV)和针对马立克氏病病毒(MDV)、网状内皮增生症病毒(REV)的Multi-PCR方法进行检测,结果只扩增出与ALV-J对应的条带,而无MDV、REV、ALV-A、ALV-B对应条带,表明鸡群感染ALV-J。用DF-1细胞进行病毒分离培养,以抗ALV-J的单克隆抗体JE9为一抗进行间接免疫荧光试验结果显示DF-1细胞呈现亮绿荧光,表明从病料中分离到的病毒为ALV-J,这也是首次从淮南王土鸡分离到ALV-J。     

应用荧光定量RT-PCR检测J亚群禽白血病病毒

针对J亚群禽白血病病毒（ALV-J）基因序列保守区域设计一对特异性引物和一条特异性探针,通过构建重组阳性标准质粒作为阳性标准品,建立了检测ALV-J核酸的荧光定量PCR方法。优化反应体系和条件后进行特异性、敏感性、重复性试验。结果显示,该检测方法特异性强,与其它禽源病毒如A亚群禽白血病病毒（ALV-A）、B亚群禽白血病病毒（ALV-B）、新城疫病毒（ NDV）、禽流感病毒（AIV）、鸡传染性贫血病毒（CIAV）和马立克病病毒（MDV）均不发生交叉反应;该方法可检测到3.2×102拷贝/μL的病毒核酸,与常规RT-PCR相比,敏感性高100倍;重复性试验的变异系数小于2%。研究结果表明,建立的Real-time RT-PCR 检测方法特异性强、灵敏度高、可重复性好,可用于ALV-J的定量检测。     

山东省种鸡场禽白血病流行病学调查

正禽白血病(Avian Leukosis)是由禽白血病病毒(ALV)引起的禽类的多种传染性肿瘤疾病的统称,在我国禽类养殖场中广泛流行,给家禽业造成了较大的经济损失。根据其宿主范围以及各病毒之间的干扰情况,ALV分为A、B、C、D、E和J等亚群,其中常见的外源性病毒是ALV-A和ALV-B,ALV-J最早是在19世纪80年代后期,从英国的商品肉鸡中分离出来的,也是商品鸡群     

K亚群禽白血病病毒5′LTR序列及启动活性分析

通过对ALV-K 5′LTR序列及其启动活性比较分析,以探究5′LTR对ALV-K体外复制能力的影响。选取广东某黄羽祖代种鸡场健康鸡群中分离到的ALV-K(GDFX0601)毒株作为研究对象,将其5′LTR核苷酸序列与国内外不同亚群ALV分离株比较分析,并将该ALV-K接种DF-1细胞,采用ELISA对细胞培养上清进行ALV p27抗原检测以分析其在DF-1细胞上的复制能力,还分别将ALV-K(GDFX0601)、ALV-J(CHN06)、ALV-E(ev-1)和ALV-K(JS11C1)5′LTR克隆进pGL3-Basic载体,分别转染DF-1、CEF和293T细胞后测定荧光素酶活性来评估不同毒株5′LTR的启动活性。结果显示,ALV-K(GDFX0601)与其他内源性ALV LTR相似性为98.5%,而与其他外源性ALV的相似性仅有70%左右,且其LTR U3区转录调节元件与外源性病毒差异较大,与内源性病毒相似。ALV-K(GDFX0601)在ALV易感细胞DF-1上的复制速度与感染能力均弱于外源性病毒ALV-A、ALV-B和ALV-J。5′LTR的启动活性试验发现ALV-K(GDFX0601)毒株LTR的启动活性比ALV-J和LTR为外源性的ALV-K(JS11CI)毒株的启动活性弱(P0.05)。ALV-K比其他亚群ALV复制能力低可能与5′LTR启动活性有关。     

K亚群禽白血病病毒gp85单因子血清的制备及其特异性鉴定

为了制备一种快速特异性识别K亚群禽白血病病毒(ALV-K)的单因子血清,本试验将ALV-K接种DF1细胞,提取感染细胞DNA作为模板,PCR扩增1 005 bp ALV-K-gp85和510 bp ALV-K-gp85(fragment)基因.将其正确的阅读框插入表达载体pET-28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(Rosetta)菌株中表达.将表达蛋白常规免疫昆明白小鼠制备抗血清.结果表明成功获得39.85和22.01 ku的重组融合蛋白,且具有良好的免疫原性.间接免疫荧光试验(IFA)结果表明两血清均可与ALV-K反应,而不与ALV-A、ALV-B和ALV-J反应.本试验首次研制获得能特异性识别ALV-K的单因子血清,为K亚群禽白血病的快速检测奠定了基础.     

锦州地区不同品系蛋鸡禽白血病病原学和血清学检测

为了解锦州地区不同品系蛋鸡禽白血病(Avian leukosis,AL)的流行情况,采集了本地区主要引进品系及地方品种鸡的血清817份,棉拭子667份,对采集样品进行血清学、病原学检测。结果表明,包括祖代鸡在内的各品系蛋鸡群P27抗原及禽白血病病毒(ALV)抗体均有阳性,平均P27抗原阳性率为8.10%;ALV-A/B亚型抗体3.92%;ALV-J亚型抗体7.96%。检测结果表明,目前锦州地区各品系蛋鸡群均存在ALV感染,其中以ALV-J为主,ALV-A和ALV-B同时存在。     

地方特色蛋鸡配套系亲本群中不同亚群禽白血病病毒的混合感染

采用ELISA、病毒分离和多聚酶链式反应(PCR)方法对江苏某地方特色蛋鸡亲本群的禽白血病病毒(ALV)p27抗原、ALV-A/B和ALV-J抗体以及病原核酸进行了检测,结果显示该配套系母本群泄殖腔拭子p27抗原阳性率为40.6%,ALV-A/B抗体阳性率为3.8%;父本群泄殖腔p27抗原阳性率为24.4%,ALV-J抗体阳性率为19.4%;细胞培养物IFA检测显示父本分离株JS12JD03能与J亚群特异单克隆抗体Je-9反应,在荧光显微镜下产生绿色荧光,而母本分离株JS12JD01和JS12JD02则无;gp85氨基酸序列同源性分析显示母本鸡群分离株JS12JD01属于A亚群、JS12JD02属于B亚群,父本鸡群分离株JS12JD03属于J亚群ALV,提示了该地方特色蛋鸡亲本群存在A、B、J亚群ALV的混合感染。     

2009年我国部分地区禽白血病分子流行病学调查

为了解自2009年年初以来国内一些地区禽白血病流行情况及流行毒株的分子特征,我们从湖北、黑龙江、山东、辽宁、吉林、广东、宁夏、安徽8个省区39个鸡场采集疑似禽白血病病料样品178份,用ALV-A、ALV-B和ALV-J特异性引物,通过PCR方法进行检测。结果表明,8个省的35个鸡场的124份病料中检出了ALV-J(69.7%);25份病料中检出了ALV-A(13.9%);7份病料中检出了ALV-B(3.9%)。14个分离毒株env基因氨基酸同源性为84.3%～99%;与J亚群原型毒株HPRS-103的氨基酸序列同源性为87.3%～98.2%;与其它J亚群env基因氨基酸序列同源性为83%～97.4%。遗传进化分析表明,14个ALV-J分离株分别分属于不同的分支。其中,LJL09DH02分离株与其它分离株及参考毒株的的亲缘关系最远,与HPRS-103的氨基酸同源性仅为87.3%。另外4个分离株的env基因与HPRS-103的氨基酸同源性低于93%,其余9株与HPRS-103的同源性较高(96.6%以上)。该调查结果表明,我国目前ALV的感染主要以J亚群为主,ALV-A和B同时存在。     

2014～2015年广东省5个黄羽肉种鸡场禽白血病感染情况调查

为了解2014~2015年广东省5个黄羽肉种鸡场禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)的感染情况,本研究于2014年3月至2015年3月在广东省5个黄羽肉种鸡场共采集52 367份父母代种鸡血液样品,采用DF-1细胞培养分离病毒并对分离物进行ALV-p27抗原以及ALV-A、B和J亚型PCR鉴定。结果显示:5个黄羽肉种鸡场均存在不同程度禽白血病的感染,p27抗原检出率为5.91%(3 094/52 367),其中ALV-J阳性率为5.12%(2 683/52 367),ALV-A、B阳性率为0.31%(160/52 367),ALV-A、B、J混合感染阳性率为0.48%(251/52 367)。调查结果表明:目前这5个鸡场黄羽肉种鸡群ALV感染以ALV-J为主,同时存在ALV-A、B以及ALV-A、B、J亚群混合感染的复杂局面。混合感染现象应引起重视,禽白血病病毒净化工作仍需持续进行。     

河南地方品种鸡禽白血病病毒感染状况的调查

为了解河南地方品种鸡禽白血病病毒感染状况,2015年10月至2017年4月,在河南地区9个种鸡场,采集了5个河南地方品种1 450只开产母鸡的泄殖腔拭子、血清和蛋清,利用ELISA方法检测3种样品中的禽白血病病毒p27抗原和血清中的禽白血病病毒A/B亚型、J亚型抗体。结果:河南地方品种鸡群总体ALV p27抗原阳性率为泄殖腔拭子22. 62%、血清26. 83%、蛋清12. 90%;鸡群总体血清ALV-A/B亚型、J亚型抗体阳性率分别为24. 76%和19. 52%。5个品种鸡群的血清ALV p27阳性率依次为河南斗鸡84. 48%、淅川乌骨鸡53. 78%、固始鸡19. 81%、三黄鸡17. 22%、卢氏鸡16. 67%,但同品种不同场区间差异较大。表明河南省地方品种鸡群存在不同程度的ALV感染,且可能存在ALV-A/B亚型和ALV-J亚型的同时感染。     

黔东南小香鸡ALV的流行病学调查及病毒的分离鉴定

黔东南小香鸡是我国特有的地方品系鸡,为了解我国黔东南小香鸡禽白血病的感染状况,本研究采集我国某地方品系鸡保种鸡场的黔东南小香鸡血清和蛋清,进行禽白血病的血清学和病原学调查。结果显示,该保种鸡场黔东南小香鸡群的ALV-J抗体阳性率为1.9%,ALV-A/B抗体阳性率为16.7%;蛋清ALV抗原阳性率为27.5%,并从中分离到一株外源性ALV。使用特异引物扩增gp85基因,序列比对分析表明,该毒株为A亚群ALV。该研究表明,黔东南小香鸡保种鸡群存在ALV的感染,流行株主要以ALV-A为主,必须实施严格的监控淘汰措施,推动我国地方品系鸡ALV的净化。     

K亚群禽白血病病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据K亚群禽白血病病毒(ALV-K)gp85基因序列设计1对引物,对反应条件和反应体系进行优化,建立了快速检测ALV-K的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。该方法在1～10~7 copies/μL范围内具有良好的线性关系,灵敏度达到1 copies/μL,是常规PCR方法的100倍。该方法与经典亚群ALV及其他常见禽免疫抑制病病毒无交叉反应,批间与批内重复性试验变异系数均小于2%。将ALV-K原型株JS11C1通过卵黄囊接种途径感染SPF鸡,运用本试验建立的实时荧光定量PCR方法,对感染鸡体内各器官的病毒分布及病毒载量进行了检测。结果显示,在感染鸡的心脏、脾脏、肺脏、肾脏等器官中均可检测到病毒,其载量无明显差异。结果表明,本试验所建立的实时荧光定量PCR方法具有敏感度高、特异性强和重复性好的优点,可用于ALV-K的快速、定量检测,该方法同时为ALV-K致病机制的研究提供了良好的技术手段。     

散养土鸡J亚群禽白血病病毒和网状内皮组织增生症病毒混合感染的诊断

湖北某农户散养的土鸡,鸡群精神委靡、整体消瘦,对病鸡进行剖检,发现部分鸡体表和脏器可见大小不等的肿瘤结节。取病变典型的组织制作病理切片,镜检可看到髓样细胞瘤和网状细胞。提取病鸡组织DNA,用两组Multi-PCR分别检测A、B、J亚群禽白血病病毒(ALV-A、ALV-B、ALV-J)和马立克病病毒(MDV)、禽网状内皮增生症病毒(REV)。结果仅扩增出与ALV-J和REV相应的条带,表明该鸡群为ALV-J和REV混合感染。     

江苏常州地区禽白血病血清学调查研究

为了解江苏常州地区肉鸡禽白血病病毒(ALV)感染情况,本研究采集了该地区2019年7-12月、2020年1-4月肉鸡血清样本1257份,通过ELISA试剂盒检测ALV-A/B、ALV-J、抗原p27阳性率.结果显示:在接受调查的两个地区均存在ALV感染及混合感染,且ALV-A/B感染率(13.13％)均高于ALV-J(...     

土鸡源ALV-K HB2018003株的分离鉴定

为确认湖北某土鸡养殖场鸡只消瘦并伴有个别死亡的现象是否由禽白血病所引起,试验采用禽白血病群特异性抗原P27 ELISA和特异性针对禽白血病病毒(ALV)-A/J/K的多重PCR(Multi-PCR)的方法对送检的20只病鸡进行检测,对阳性样品进行病毒分离。结果表明:送检的20只病鸡中有11只为P27抗原阳性,阳性率为55%,将群特异性抗原P27和PCR检测均为阳性的病鸡血液接种DF-1细胞,成功分离到一株ALV-K,命名为HB2018003。说明该湖北土鸡养殖场鸡只感染ALV-K。     

贵阳地区禽白血病的血清学调查

为了解和掌握禽白血病在贵阳地区发生和流行的基本情况,采用禽白血病A、B亚群抗体(ALV-A或B)和J亚群抗体(ALV-J)检测试剂盒,对贵阳市13个养鸡场中的15个肉鸡和商品蛋鸡共481份血清进行禽白血病抗体间接ELISA检测,结果 ALV抗体阳性率达到11.43%(55/481),其中9个鸡群172份血清样本A、B亚群抗体阳性率达到18.60%(32/172),13个鸡群309份血清J亚群抗体阳性率达到7.44%(23/309),结果表明该地区存在禽白血病病毒的感染。     

华东地区蛋鸡群中禽白血病的分子流行病学调查

为了解华东地区蛋鸡群中禽白血病的流行情况,2011年3月至2012年10月,从江苏、山东、安徽、上海等省市的蛋鸡养殖场中采集疑似禽白血病病例样品105份,经DF-1细胞分离培养、间接免疫荧光试验鉴定,从中分离禽白血病病毒(ALV)15株,继而对分离毒株gp85基因进行了序列测定和遗传进化分析。结果表明,在所获得的ALV分离株中,有A亚群ALV(ALV-A)3株,B亚群ALV(ALV-B)4株,剩余8株则均为J亚群ALV(ALV-J)。ALV-A、ALVB分离株遗传进化较为稳定,与其原型株(RAV-1、RAV-2)gp85基因核苷酸序列同源性均在98%以上,与我国近年来的地方分离株亲缘关系较远。ALV-J分离株与其原型株(HPRS-103)gp85基因核苷酸序列的同源性在92.8%~94.5%之间。8株ALV-J分离株中,只有1株与蛋鸡ALV-J分离株有较高的亲缘关系,其余均较远,反而与早期的肉鸡分离株有较高的亲缘关系,表明目前于华东地区蛋鸡群中流行的ALV-J可能来源于早期肉鸡分离株的感染。4株ALV-J分离株与我国地方品系HR土鸡的ALV-J分离株HR332J具有很高的亲缘关系,表明ALV-J的感染范围进一步扩大,对地方品系鸡也造成了很大的危害。