鸡传染性贫血病病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据鸡传染性贫血病病毒(chicken infectious anemia virus,CAV)基因组保守区域设计1对特异性引物和探针,通过优化反应条件,建立了一种快速检测CAV的TaqMan实时荧光定量PCR方法,同时验证其特异性、灵敏性和重复性.本试验建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法灵敏度可达1.8×10¹拷贝/μL,远高于常规PCR方法;并与禽类其他病毒性疾病无交叉反应,具有高特异性.用分离的病毒人工感染1日龄SPF雏鸡,14日龄剖检,对感染鸡体内各器官的病毒分布及载量进行检测,结果表明,在脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、法氏囊和血清中均可检测到病毒,肝脏、胸腺病毒载量明显高于其他组织.本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可同时检测大量临床样品,适用于CAV的诊断与流行病学分析.     

鸡传染性贫血病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus,CIAV)的实时荧光定量PCR检测方法,本试验通过CIAV基因组保守区域设计1对扩增片段大小为180bp的特异性引物,构建pGM-T-CIAV重组质粒,制备阳性标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR标准曲线,并进行敏感性试验、特异性试验和重复性试验。结果显示,CIAV的Ct阈值与标准品浓度在5.33×108至5.33×103拷贝/μL间呈良好的线性关系,相关系数R2=0.998,斜率为-3.443,产物Tm值在86℃左右。该方法与网状内皮组织增生病病毒(REV)、禽白血病病毒(ALV)J亚型、马立克氏病病毒(MDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因组均无交叉反应,敏感性为5.33拷贝/μL,比普通PCR高1 000倍,批内和批间重复试验变异系数均小于3%。结果表明,本试验建立的CIAV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法可实现对鸡传染性贫血病的早期诊断及感染程度的定量分析的检测。     

禽白血病J亚群病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

本研究旨在通过荧光定量PCR方法研究禽白血病J亚群病毒(ALV-J)在家禽体内各个器官的分布。根据ALV-J NX0101毒株基因5 258—5 510bp的碱基序列,设计了1对特异性引物,进行RT-PCR反应,扩增产物为253bp,将该产物连接T载体作为Real-time PCR反应的标准品,利用SYBR Green I染料进行Real-time PCR反应,建立了标准曲线,并进行反应灵敏性,特异性和重复性试验。然后用已建立的方法对人工感染ALV-J的SPF鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胸腺、法氏囊、腺胃进行3次重复检测,将Ct值带入标准曲线公式得出各个组织的病毒拷贝数。试验结果表明:标准曲线线性关系R值均为0.991 4,检测极限约为81拷贝质粒DNA,比RT-PCR灵敏100倍以上;特异性分析表明只有ALV-J能检测到特异性的熔解度峰值;批内和批间重复性试验的变异系数均小于5%。通过比较数值以得出胸腺ALV-J基因含量是最高的,肺脏、脾脏、法氏囊含量也比较高,心脏拷贝数最低。自然感染发病鸡各器官ALV-J基因均高于人工感染ALV-J的基因含量。本研究所建立的ALV-J基因实时荧光定量RT-PCR方法灵敏度高、特异性强、检测周期短,初步探讨了禽白血病J亚群病毒在畜禽体内各个器官的病毒分布。这为以后禽白血病的诊断以及治疗提供了重要的技术支持。     

Real-time RT-PCR检测J亚群禽白血病病毒的研究

为了建立检测J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的方法,试验采用Real-time RT-PCR,通过1对ALV-J特异性引物对ALV-J山东分离株(命名为ALV-JSD株)进行特异性、敏感性和重复性试验;然后用ALV-JSD株感染1日龄SPF鸡,感染8周后剖检取各组织,用已建立的方法检测ALV-LSD株的感染情况。结果表明:特异性试验中只有以ALV-JSD株cDNA为模板的反应管中能够检测到扩增曲线;敏感性试验测得反应灵敏度达到3.01×1010 copies/μL,比普通PCR灵敏100多倍;对人工感染鸡的不同组织样品进行3次重复检测,病毒检出率为100%;经重复性和实际临床样本检验证实,该方法稳定、可靠,为ALV-J的早期快速诊断建立了特异、灵敏、廉价的定量检测方法。     

鸡传染性贫血病毒SYBR Green Ⅰ法荧光定量PCR检测方法的建立及其在疫苗污染检测中的应用

为了更快速而灵敏地检测禽弱毒疫苗中可能存在的鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)污染,根据CIAV基因组保守区域VP2部分基因设计和合成了1对特异性引物,通过优化反应条件建立了快速检测CIAV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。结果显示,建立的检测方法灵敏度可达6.36 copies/μL,是常规PCR灵敏度的1000倍。该方法与禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)、禽白血病病毒(Avian leukemia virus,ALV)、鸡马立克氏病病毒(Mareks disease virus,MDV)等均无交叉反应,特异性良好;批内和批间重复试验显示变异系数均小于2.5%,呈现良好的可重复性。在模拟试验中,建立的SYBR Green I荧光定量PCR能够检测到1000羽份弱毒疫苗中1个EID50的低剂量污染,应用该方法从送检的14种(批)商品化禽用弱毒疫苗中检测到2份为CIAV阳性,阳性样品按照经典的SPF鸡检查法进行检测也为CIAV阳性。因此,本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法灵敏度高,特异性强,重复性好,适合用于疫苗中CIAV污染的检验。     

一种塞内卡病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种塞内卡病毒实时荧光定量PCR方法,研究针对塞内卡病毒3C基因保守区域设计了一对引物和探针,将3C基因克隆到pCR-4 TOPO载体中,以重组质粒为标准品,通过优化PCR反应条件,建立了一种检测SVA的实时荧光定量PCR方法。结果表明,该检测方法的敏感性达到2.5×10 copies/μL,灵敏度高于普通PCR;与其他相关病毒及细菌均不发生交叉反应,批内和批间试验重复性的变异系数(CV)均小于4%,具有良好的稳定性。研究建立的一种塞内卡病毒实时荧光定量PCR方法可以检测SVA的定性和定量,对SVA快速诊断检测具有重要意义。     

应用荧光定量RT-PCR检测J亚群禽白血病病毒

针对J亚群禽白血病病毒（ALV-J）基因序列保守区域设计一对特异性引物和一条特异性探针,通过构建重组阳性标准质粒作为阳性标准品,建立了检测ALV-J核酸的荧光定量PCR方法。优化反应体系和条件后进行特异性、敏感性、重复性试验。结果显示,该检测方法特异性强,与其它禽源病毒如A亚群禽白血病病毒（ALV-A）、B亚群禽白血病病毒（ALV-B）、新城疫病毒（ NDV）、禽流感病毒（AIV）、鸡传染性贫血病毒（CIAV）和马立克病病毒（MDV）均不发生交叉反应;该方法可检测到3.2×102拷贝/μL的病毒核酸,与常规RT-PCR相比,敏感性高100倍;重复性试验的变异系数小于2%。研究结果表明,建立的Real-time RT-PCR 检测方法特异性强、灵敏度高、可重复性好,可用于ALV-J的定量检测。     

TaqMan荧光定量PCR检测鸡产蛋下降综合征病毒方法的建立及应用

根据GenBank公布的鸡产蛋下降综合征病毒六邻体蛋白基因的高度保守序列,设计了2对特异性引物和1条TaqMan探针.以构建的阳性重组质粒为标准品,绘制标准曲线,建立了一种快速检测鸡产蛋下降综合征病毒的TaqMan荧光实时定量PCR方法.该方法最小检出量达10 copies·μL-1,在1.0×102～1.0×108copies· μL-1检测范围间有良好的线性关系,特异性、稳定性和重复性也较好.用建立的本方法检测感染鸡产蛋下降综合征病毒鸡群的产蛋分离物,与普通PCR相比,该荧光实时定量PCR方法具有更高的敏感性,可更好地用于鸡产蛋下降综合征病毒的临床检测.     

鸡贫血病毒Taq Man探针荧光定量PCR检测方法的建立

根据鸡贫血病毒(CAV)基因序列,选取一段高度保守的基因序列作为目的片段设计引物与探针,将该目的片段克隆到pMD18-T载体中,作为阳性标准品.通过优化荧光定量PCR反应条件,建立了CAV的荧光定量PCR检测方法.结果表明,该检测方法的敏感性达到10个病毒拷贝/μL,与其他禽病病毒无交叉反应,批间与批内重复试验相关系数都小于5%.实验数据证明该检测方法敏感性高,特异性好,重复性佳.     

F亚群禽白血病病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为建立检测F亚群禽白血病病毒(ALV-F)的SYBR Green I荧光定量PCR方法,本研究以ALV-F分离株FGD1803基因组为模板,PCR扩增其env基因,构建重组质粒pMD18-T-F作为标准品。利用该重组质粒建立了SYBR Green I荧光定量PCR方法(qPCR)的标准曲线,并经反应条件优化建立了检测ALV-F的qPCR方法。建立的标准曲线结果显示,重组质粒标准品的拷贝数与Ct值呈良好的线性关系,R2为0.993,扩增效率为1.03。该方法各反应条件的优化结果为10μmol/L上下游引物各0.5μL,退火温度为55℃。特异性试验结果显示,该方法仅能特异性检测ALV-F,而对ALV-A、ALV-B、ALV-J、ALV-K、ALV-E、网状内皮增生病病毒、马立克氏病病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、鸡支气管炎病毒等禽源病毒无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法对质粒标准品的最低检测限为1.16×102拷贝/μL,敏感性是常规PCR方法的100倍;以3个不同浓度重组质粒标准品为模板进行重复性试验,结果显示批内和批间重复性试验变异系数均小于5%;利用该方法与病毒培养方法分别检测30份七彩山鸡血浆样品(21份ALV阳性,9份阴性)的细胞培养物,结果显示该qPCR方法的阳性检出率为33.3%(10/30),常规PCR方法的阳性检出率为20.0%(6/30),病毒分离方法的阳性检出率为13.3%(4/30),该qPCR方法与病毒分离方法的符合率为80.0%。本研究在国内首次建立了用于ALV-F检测的qPCR方法,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可以用于临床样品的检测。为该病毒的检测提供了技术支撑。     

鸡传染性贫血病毒荧光定量PCR检测方法的建立及其在疫苗污染检测中的应用

为了更快速而灵敏地检测禽弱毒疫苗中鸡传染性贫血病毒(CIAV)的污染,根据CIAV基因组保守序列设计合成了引物及TaqMan探针,通过优化反应条件建立了快速检测CIAV的实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,建立的检测方法灵敏度可达10拷贝·μL~(-1),比常规PCR灵敏度高100倍。该方法与禽白血病病毒、禽网状内皮组织增生症病毒以及马立克病病毒等病毒基因均无交叉反应,具有很好的特异性;批内重复和批间重复显示变异系数均小于2%,呈现良好的可重复性。在模拟试验中,该方法能够检测到1 000羽份弱毒疫苗中1个EID50的低剂量污染,应用该方法从送检的39种(批)商品化禽用弱毒疫苗中检测到2份为CIAV阳性。上述结果表明,本研究建立的荧光定量PCR检测方法灵敏度高,特异性强,重复性好,可用于检测疫苗中CIAV低剂量的污染。     

荧光定量PCR检测鸡马立克氏病血清1型病毒方法的建立及应用

为了建立一种快速的鸡马立克氏病血清1型病毒(MDV-1)病原检测方法,试验采用针对MDV-1基因序列保守区域设计1对特异性引物和1条特异性的探针,通过构建重组阳性标准质粒的方法,构建重组质粒作为阳性标准品,建立了检测MDV-1核酸的荧光定量PCR方法。优化反应体系和条件后进行特异性、敏感性、重复性试验。结果显示,该检测方法特异性强,与其它禽源病毒如新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡传染性贫血病毒(CIAV)和J亚群禽白血病病毒(ALV-J)均不发生交叉反应;该方法可检测到4.6×101拷贝/L的病毒核酸,与常规PCR相比,敏感性高100倍;重复性试验的变异系数小于2%。研究结果表明所建立的Real-time PCR检测方法特异性强、灵敏度高、可重复性好,可用于MDV-1的定量检测。     

鸡Caspase-1基因SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立快速定量检测鸡Caspase-1基因的方法,本研究根据鸡Caspase-1基因序列设计特异性检测引物,PCR扩增Caspase-1基因片段,构建pMD-Caspase-1重组质粒。以该重组质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增,建立标准曲线,并通过反应条件优化、特异性、敏感性及重复性等试验,建立了鸡Caspase-1基因SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。结果显示,本研究建立的该荧光定量PCR方法在重组质粒标准品为1.0×10~3拷贝/μL～1.0×10~8拷贝/μL范围内具有良好的线性关系;该荧光定量PCR方法对Caspase-1基因的扩增具有较强的特异性;对重组质粒标准品的检测下限为1.0×10~2拷贝/μL,比常规PCR敏感100倍;批内和批间变异系数分别在0.51%～4.41%和0.37%～0.88%,重复性好。利用所建立的方法可以定量检测致病性禽腺病毒血清4型感染鸡不同组织中Caspase-1的转录水平。本研究方法的建立将为研究鸡Caspase-1在免疫反应和疫病发展过程中的作用提供技术支持。     

A、B、J和K亚群禽白血病病毒多重PCR检测方法的建立及应用

为快速检测鸡群禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)感染状态,本研究针对鸡群中主要流行的外源性ALV亚群ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K,设计通用上游引物PF和特异性下游引物AR、BR、JR和KR,通过构建质粒标准品,对最适引物浓度、退火温度及循环数等反应条件进行优化,建立了能同时检测ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K的多重PCR方法,进一步对其特异性、敏感性和重复性进行评估。结果显示,采用0.2μmol/L PF、0.1μmol/L AR、0.1μmol/L BR、0.1μmol/L JR和0.1μmol/L KR,56.0℃退火温度和30个循环的反应条件建立的多重PCR方法检测效果最优。该方法能特异性地检测出ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K的单一或混合感染,而对其它禽源病毒无特异性扩增;该方法对质粒标准品的检测下限为1×103拷贝/μL,敏感性较高;利用该方法对3个浓度混合质粒模板的检测,显示出良好的批内和批间重复性。利用本研究建立的多重PCR方法与传统病毒分离方法对96份表观健康鸡抗凝血样品及21份肿瘤组织样品进行检测,结果显示该多重PCR方法检出率更高,二者符合率99.1%。利用建立的多重PCR方法检测119份ALV阳性样品,结果显示,单一感染ALV-J检出率最高(43.7%),其次为ALV-K(17.6%);除单一感染外,地方品种鸡群还存在ALV-B+J、ALV-J+K的二重感染,以及ALV-A+B+J、ALV-A+B+K、ALV-B+J+K的三重感染。本研究为禽白血病流行病学调查及外源性ALV初步鉴定提供了技术支撑。     

副鸡禽杆菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的副鸡禽杆菌hagA基因序列设计特异性引物,经PCR扩增出了123bp的片段。产物经回收与pMD18-T Vector连接后转化到基因工程菌DH5α中,提取重组质粒,经PCR及测序鉴定后,作为阳性模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线,并做敏感性试验、特异性试验、重复性试验和临床检测应用。结果显示,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数R2=0.999 8;溶解曲线特异,产物Tm在81.3~81.5℃之间;最低检测限为0.18拷贝/μL,其敏感性比常规PCR至少高100倍;该方法不与其细菌发生交叉反应,呈现很好的特异性;重复性试验中,批内和批间变异系数均小于1%,说明该方法重复性很好;临床副鸡禽杆菌样本的检测结果表明所建立的荧光定量PCR方法的检测率明显高于常规PCR方法,为该病的早期快速诊断,并定量分析副鸡禽杆菌感染程度奠定了基础。     

禽呼肠孤病毒TaqMan实时荧光RT-PCR方法的建立及病毒组织分布比较研究

根据本实验室分离禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)毒株和GenBank中已发布ARV标准毒株σC基因序列比对结果,在保守区域设计1对引物和1条特异性TaqMan探针。通过对反应条件和反应体系的优化,建立的Real-time RT-PCR在1×10~1~1×10~(10) copies/μL范围内具有良好的线性关系,灵敏度达到10 copies/μL,是常规PCR方法的100倍。本研究建立的RTPCR与其他禽病病原无交叉反应,且批间与批内重复性试验变异系数分别小于1%和2%,表明该方法具有良好的特异性和重复性。将本实验室分离流行毒株MS01和标准毒株S1133感染SPF鸡后,利用建立的Real-time RT-PCR对ARV在鸡体内组织脏器的分布及病毒载量进行比较研究,结果表明,毒株MS01及S1133对SPF鸡的致死率分别为80%和46.7%,两株病毒均能在肝脏、脾脏、肺脏中有效复制,毒株MS01病毒载量明显高于毒株S1133,但与毒株S1133不同,毒株MS01在肾脏组织中也能有效复制。本研究不仅为禽呼肠孤病毒的诊断提供了技术手段,也有利于进一步探索流行毒株MS01高致病性的分子机制。     

基于鸽新城疫病毒M基因实时定量PCR检测方法的建立

研究通过比对鸽源和鸡源新城疫病毒M基因的序列,找到其差异位点并在保守区设计引物和TaqMan探针,建立了一种可以特异性检测鸽新城疫病毒的实时荧光定量PCR方法。以鸽新城疫病毒M基因阳性质粒为模板制作标准曲线并对检测方法的指标进行系统评价。结果显示,该方法的标准曲线为方程为:y=-3.334logX+37.837,相关系数R2=0.992;重组质粒标准品检测下限为1×101 copies/μL,比普通PCR灵敏100倍;特异性试验显示,该方法与鸡新城疫病毒不同毒株及其他常见禽类病毒无交叉反应;重复性试验的组间及组内的变异系数均小于2%,说明本研究建立的实时定量PCR检测方法敏感性高、特异性强、重复性好,可应用于鸽新城疫病毒的早期检测,为鸽新城疫病毒的防控提供了技术支持。     

猪圆环病毒3型实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立快速、灵敏且特异的检测猪圆环病毒3型(porcine circovirus, PCV)的实时荧光定量PCR方法,本研究根据ORF2基因的保守序列设计一对特异性引物和TaqMan探针,通过构建标准品质粒来制作荧光定量PCR标准曲线,优化反应条件,验证敏感性、特异性及重复性,建立了检测PCV3的实时荧光定量PCR方法。结果显示,该方法可以特异性检测出PCV3,而对猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒等检测结果均为阴性,表明其具有良好的特异性。用构建的标准品质粒测得的灵敏度可以达到10 copies/μL,重复试验批内及批间变异系数均小于2%,表明其具有良好的灵敏性和重复性。以上结果表明,本研究建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏性高、特异性强的优点,可为我国PCV3型的早期检测及相关研究工作提供可靠的技术支持。     

鸡胚致死孤儿病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的:建立鸡胚致死孤儿病毒CELO的荧光定量PCR检测方法,实现该病毒在鸡胚及禽源性生物制品中的快速检测.方法根据CELO L5纤突1序列设计引物和探针,建立荧光定量PCR检测方法,并对其线性、特异性、精密性、灵敏度进行考察.运用建立的方法对40份SPF鸡胚尿囊液和16株流感疫苗主种子批毒种进行CELO检测.结果:建立的荧光定量PCR其最佳线性范围为1x109~1x104拷贝/μl,R2值达0.99以上,特异性良好,与其他种属的腺病毒及流感病毒间均无交叉反应,灵敏度为102拷贝/μl;荧光定量PCR方法检测40份SPF鸡胚尿囊液和16株流感毒种结果为阴性.结论:本研究所建立的鸡胚致死孤儿病毒荧光定量PCR检测方法,特异性好,敏感性高,为鸡胚及禽源性生物制品中的快速检测提供了技术支撑.     

基于便携式荧光定量PCR仪的鸡传染性贫血病毒检测方法的建立及应用

本研究参照Gen Bank中鸡传染性贫血病毒基因组序列,设计特异引物和TaqM an探针,通过优化反应条件,建立了能检测鸡传染性贫血病毒的荧光PCR方法,并验证该方法的特异性、敏感性和重复性。结果表明,该方法检测鸡传染性贫血病毒灵敏度可达2.69TCID50/100μL,该法对禽呼肠孤病毒(AR V)、马立克氏病病毒(MDV)、禽白血病病毒(ALV)、禽网状内皮组织增生病病毒(REV)和传染性法氏囊病病毒(IBDV)的检测结果均为阴性。本试验建立的TaqM an荧光定量PCR检测方法可对鸡传染性贫血病毒进行快速鉴别诊断,为鸡传染性贫血的诊断及防控净化工作奠定了基础。