实时荧光定量PCR检测鸡传染性贫血病毒方法的建立

建立了Taqman实时荧光定量PCR方法检测鸡传染性贫血病毒(CAV)。选取CAV病毒的序列设计引物和探针。以梯度稀释的含有CAV目的扩增片段的质粒作为标准品,进行定量PCR反应以确定检测灵敏度。2.0×105～2.0×102个拷贝,4个数量级的范围内定量PCR有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为200个拷贝。根据病毒拷贝数与定量反应Ct值的关系,绘制了标准曲线。该方法具有特异性,对传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、禽白血病病毒和马立克病毒核酸都没有扩增反应。采用实时荧光定量PCR方法检测试验感染鸡的肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、法氏囊、泄殖腔棉拭子等样品,所有检测样品都有"S"型扩增曲线,且荧光信号值高。实时定量PCR检测CAV的方法,灵敏度高,特异性好,可以进行定量分析,在禽病的快速检测上具有重要意义。     

K亚群禽白血病病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

根据K亚群禽白血病病毒(ALV-K)gp85基因序列设计1对引物,对反应条件和反应体系进行优化,建立了快速检测ALV-K的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。该方法在1～10~7 copies/μL范围内具有良好的线性关系,灵敏度达到1 copies/μL,是常规PCR方法的100倍。该方法与经典亚群ALV及其他常见禽免疫抑制病病毒无交叉反应,批间与批内重复性试验变异系数均小于2%。将ALV-K原型株JS11C1通过卵黄囊接种途径感染SPF鸡,运用本试验建立的实时荧光定量PCR方法,对感染鸡体内各器官的病毒分布及病毒载量进行了检测。结果显示,在感染鸡的心脏、脾脏、肺脏、肾脏等器官中均可检测到病毒,其载量无明显差异。结果表明,本试验所建立的实时荧光定量PCR方法具有敏感度高、特异性强和重复性好的优点,可用于ALV-K的快速、定量检测,该方法同时为ALV-K致病机制的研究提供了良好的技术手段。     

鸭腺病毒A型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

试验旨在建立鸭腺病毒A型（duck adenovirus A,DAdV-A）TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。根据DAdV-A Hexon基因序列设计特异性引物和探针,建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行检测,用建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法和常规PCR方法同时对福建地区临床收集的85份番鸭源病料进行DAdV-A感染的检测,比较其符合率。结果表明,试验成功建立了检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,其扩增相关系数为0.996,扩增效率为99.9%;特异性强,对鸭常见病原（如鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌）检测均为阴性;灵敏度高,最低检测限为8.37拷贝/μL;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.54%~1.28%和0.61%~2.39%。对临床送检的85份病料,TaqMan实时荧光定量PCR方法的阳性率为7.06%（6/85）,PCR方法的阳性率为5.88%（5/85）,且PCR检测的阳性样品经TaqMan实时荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100%。本研究建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,为鸭群中开展DAdV-A的分子流行病学研究提供了有效技术手段。     

鸭腺病毒A型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

试验旨在建立鸭腺病毒A型(duck adenovirus A,DAdV-A)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。根据DAdV-A Hexon基因序列设计特异性引物和探针,建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行检测,用建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法和常规PCR方法同时对福建地区临床收集的85份番鸭源病料进行DAdV-A感染的检测,比较其符合率。结果表明,试验成功建立了检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,其扩增相关系数为0.996,扩增效率为99.9%;特异性强,对鸭常见病原(如鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌)检测均为阴性;灵敏度高,最低检测限为8.37拷贝/μL;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.54%~1.28%和0.61%~2.39%。对临床送检的85份病料,TaqMan实时荧光定量PCR方法的阳性率为7.06%(6/85),PCR方法的阳性率为5.88%(5/85),且PCR检测的阳性样品经TaqMan实时荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100%。本研究建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,为鸭群中开展DAdV-A的分子流行病学研究提供了有效技术手段。     

猪瘟病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank中猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）5′NTR的保守序列,设计1对特异性引物和TaqMan探针,以CSFV全长基因重组质粒pGEM-CSFV为标准品,建立TaqMan实时荧光定量PCR标准曲线,进行特异性、敏感性和重复性试验,并检测人工感染CSFV后不同时期猪血浆中CSFV的载量。结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系,R²=0.999;敏感性高,最低检测限为1×10¹拷贝/μL;特异性强,与猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒无交叉反应性;重复性好,组内和组间变异系数均小于2%。人工感染CSFV后第7天猪血浆中CSFV载量达到峰值,之后逐渐降低。结果表明,建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、重复性好等优点,为CSFV的定量分析及临床诊断奠定基础。     

牛腺病毒5型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

建立针对牛腺病毒5型六邻体(Hexon)基因的实时荧光定量TaqMan PCR检测方法。根据牛腺病毒5型Hexon基因高度保守区设计引物和TaqMan探针,绘制标准曲线,对其灵敏度、特异性、重复性进行验证,建立牛腺病毒5型实时荧光定量TaqMan PCR快速检测方法。结果显示,构建的重组质粒pUC57-BAV5,标准曲线在10~2～10~7拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.975 2,建立检测方法的最低检测限为32拷贝/μL;应用建立的方法检测牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒、牛呼吸道合胞体病毒无交叉反应;重复性试验表明,同一浓度的20个平行样品的变异系数为1.4%。牛腺病毒5型TaqMan探针荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,可以用于牛腺病毒5型的快速、准确的检测。     

TaqMan荧光定量PCR检测鸡产蛋下降综合征病毒方法的建立及应用

根据GenBank公布的鸡产蛋下降综合征病毒六邻体蛋白基因的高度保守序列,设计了2对特异性引物和1条TaqMan探针.以构建的阳性重组质粒为标准品,绘制标准曲线,建立了一种快速检测鸡产蛋下降综合征病毒的TaqMan荧光实时定量PCR方法.该方法最小检出量达10 copies·μL-1,在1.0×102～1.0×108copies· μL-1检测范围间有良好的线性关系,特异性、稳定性和重复性也较好.用建立的本方法检测感染鸡产蛋下降综合征病毒鸡群的产蛋分离物,与普通PCR相比,该荧光实时定量PCR方法具有更高的敏感性,可更好地用于鸡产蛋下降综合征病毒的临床检测.     

非洲猪瘟病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

建立一种TaqMan荧光定量PCR检测方法,用于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)保守结构蛋白P72基因的检测。参照GenBank登录的ASFV P72相关基因序列,设计合成1对特异性引物与1个TaqMan探针,通过对反应条件和反应体系进行优化,建立了快速检测ASFV的TaqMan实时荧光定量PCR方法,对该方法的灵敏性、特异性与重复性进行了验证。结果显示,该方法能有效扩增1.0×10~0～1.0×10~9拷贝/μL ASFV-P72标准质粒,建立的标准曲线呈现良好的线性关系;检测灵敏度为1.0×10~0拷贝;对猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒等病原不发生交叉反应;重复性试验结果显示变异系数(CV)小于1%。结果表明,本试验建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,可用于临床样本中ASFV的检测,从而更好地对ASF疫情进行监测和诊断。     

鸡贫血病毒Taq Man探针荧光定量PCR检测方法的建立

根据鸡贫血病毒(CAV)基因序列,选取一段高度保守的基因序列作为目的片段设计引物与探针,将该目的片段克隆到pMD18-T载体中,作为阳性标准品.通过优化荧光定量PCR反应条件,建立了CAV的荧光定量PCR检测方法.结果表明,该检测方法的敏感性达到10个病毒拷贝/μL,与其他禽病病毒无交叉反应,批间与批内重复试验相关系数都小于5%.实验数据证明该检测方法敏感性高,特异性好,重复性佳.     

猪圆环病毒3型实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立快速、灵敏且特异的检测猪圆环病毒3型(porcine circovirus, PCV)的实时荧光定量PCR方法,本研究根据ORF2基因的保守序列设计一对特异性引物和TaqMan探针,通过构建标准品质粒来制作荧光定量PCR标准曲线,优化反应条件,验证敏感性、特异性及重复性,建立了检测PCV3的实时荧光定量PCR方法。结果显示,该方法可以特异性检测出PCV3,而对猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒等检测结果均为阴性,表明其具有良好的特异性。用构建的标准品质粒测得的灵敏度可以达到10 copies/μL,重复试验批内及批间变异系数均小于2%,表明其具有良好的灵敏性和重复性。以上结果表明,本研究建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏性高、特异性强的优点,可为我国PCV3型的早期检测及相关研究工作提供可靠的技术支持。     

鸡贫血病病毒套式PCR检测方法的建立及应用

鸡贫血病病毒不仅引起鸡的传染性贫血 ,而且也是引起鸡免疫抑制病的主要病原。本研究首次在国内建立了鸡贫血病病毒的套式PCR检测方法。试验证明此方法具有高度的特异性和敏感性 ,以鸡马立克氏病毒、鸡网状内皮组织增生病毒、鸡传染性法氏囊病毒、正常MDCC_MSB1细胞DNA作为模板扩增时均未出现可见带 ,在检测鸡的各种组织病料时均未出现假阳性结果 ,该法比一次性PCR的敏感性高约 1 0 0 0倍 ,能检测到约一个拷贝的鸡贫血病病毒DNA ,而一次性PCR只能检测到3.6× 1 0 3 个拷贝。此方法已成功地应用于临床试验。对于鸡贫血病毒的许多鸡胚分离物和细胞分离物 ,一次性PCR不能扩增出可见电泳条带 ,而套式PCR都能扩增出特异的DNA片段 ,从而说明 ,套式PCR的敏感性大大高于一次性PCR ,可消除一次性PCR产生的假阴性结果     

Polymerase chain reaction amplification for direct detection of chicken anemia virus DNA in tissues and sera.

Direct detection of chicken anemia virus (CAV) DNA in tissues and sera was investigated by a polymerase chain reaction (PCR) assay. Using a pair of primers constructed to amplify the coding sequence of the CAV DNA genome, the PCR assay was shown to be extremely sensitive, being able to detect 1 fg of CAV replicative form DNA. The oligonucleotide primers used for the PCR yielded 583 base-pair (bp) amplified product, which was sized by ethidium bromide-agarose gel electrophoresis. Tissue samples from seven cases of suspected chicken infectious anemia were obtained for CAV isolation. DNA extracted from the homogenized suspension of pooled tissues of each case was analyzed by the PCR assay. Results showed that five of the seven cases were positive for CAV DNA by PCR, whereas CAV was isolated from four cases only. The PCR assay also detected CAV DNA in two of 37 serum samples from disease-free chickens. The specificity of PCR was confirmed by chemiluminescence dot-blot analysis of the amplified products.     

PCR、斑点杂交及间接免疫荧光试验对鸡传染性贫血病临床诊断的应用比较

应用能特异性扩增出鸡传染性贫血病毒（ Ｃ Ａ Ｖ） ０５８ ｋｂ Ｄ Ｎ Ａ 的已知引物，对江苏某地区疑为 Ｃ Ａ Ｖ感染的 １５～３０ 日龄病鸡的肝 Ｄ Ｎ Ａ 样品进行了 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增。结果，在被检的 ２０ 份样品中，有 ６ 份为 Ｐ Ｃ Ｒ 阳性，阳性率 ３０％ 。利用地高辛标记的 ０８５ ｋ ｂ 的 Ｃ Ａ Ｖ 核酸探针对相同样品进行斑点杂交，结果与 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增相同。对应的病鸡血清经间接免疫荧光试验（ Ｉ Ｉ Ｆ Ａ）发现，有 ７ 份为 Ｃ Ａ Ｖ 抗体阳性，与 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增结果的符合率为 ７７％ 。初步结果表明，江苏某地区存在 Ｃ Ａ Ｖ 感染， Ｉ Ｉ Ｆ Ａ 与 Ｐ Ｃ Ｒ 的结果有差异     

Studies on the pathogenesis of chicken infectious anaemia virus infection in six-week-old SPF chickens

The pathogenesis of chicken infectious anaemia virus (CAV) infection was studied in 6-week-old and one-day-old SPF chickens inoculated intramuscularly with graded doses of Cux-1 strain (10(6)-10(2) TCID50/chicken). Viraemia, virus shedding, development of virus neutralizing (VN) antibodies and CAV distribution in the thymus were studied by virus isolation, polymerase chain reaction (PCR), immunocytochemistry (IP) and in situ hybridization until postinfection day (PID) 28. In 6-week-old chickens infected with high doses of CAV, viraemia and VN antibodies could be detected 4 PID and onward without virus shedding or contact transmission to sentinel birds. However, virus shedding and contact transmission were demonstrated in one-day-old infected chickens. In the 6-week-old groups infected with lower doses, VN antibodies developed by PID 14, transient viraemia and virus shedding were detected. The thymus cortex of all 1-day-old inoculated chickens stained with VP3-specific mAb. Cells with positive in situ hybridization signal were fewer and scattered throughout the thymus tissue of the one-day-old inoculated chickens as compared to IP-positive cells. These results suggest that early immune response induced by high doses of CAV in 6-week-old chickens curtails viral replication and prevents virus shedding.     

PCR和斑点杂交检测鸡传染性贫血病毒

通过聚合酶链反应（ｐｃＲ）扩增鸡传染性贫血病毒（ｃＡＶ）ＤＮＡ特定片段，将此ｐｃＲ产物用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记后作为探针进行斑点杂交，以此检测ＣＡＶ并作流行病学调查。对从江苏省不同地市随机采集的２月龄左右不同疾病的病鸡ＤＮＡ样品进行检测，在被检的５２个不同鸡群来源的病料中，有３６个鸡群来源的病料ＤＮＡ显示ＣＡＶ阳性（群阳性率为６９．２％）；备组织中ＣＡＶＤＮＡ含量有所差异，依次为胸腺＞脾、骨髓、肝＞肾、法氏囊、脑。用ＰＣＲ检测得到的阳性鸡的组织病料感染ＳＰＦ鸡，在感染后第２４天检查，出现贫血症状。初步调查表明，在江苏一些地区ＣＡＶ感染已相当普遍，但它与发病的关系还有待于进一步研究。     

鸡传染性法氏囊病超强毒Gx与疫苗毒Gt在鸡体内的复制研究

本试验利用鸡传染性法氏囊病超强毒Gx及其致弱疫苗毒Gt为对象,研究超强毒与弱毒株在鸡体主要免疫器官内的复制情况,以探讨两类毒株表现不同生物特性的原因。分别利用鸡胚半数致死量和鸡胚成纤维细胞半数感染量对超强毒Gx和疫苗株Gt进行病毒滴度的测定;再利用荧光定量RT-PCR对两类毒株进行病毒量的校准。以相同量的病毒对2周龄SPF鸡进行攻毒。攻毒试验表明超强毒Gx能造成47.5%的死亡,法氏囊、脾脏、胸腺等免疫器官均严重损伤;而疫苗毒Gt无致死,且未能造成任何病理可见的损伤。病毒的体内复制情况表明超强毒相对于疫苗毒复制更为迅速,病毒载量更高。     

Development of a DNA vaccine against chicken anemia virus by using a bicistronic vector expressing VP1 and VP2 proteins of CAV

In the present study, we describe the development of a DNA vaccine against chicken anemia virus. The VP1 and VP2 genes of CAV were amplified and cloned into pBudCE4.1 to construct two DNA vaccines, namely, pBudVP1 and pBudVP2-VP1. In vitro and in vivo studies showed that co-expression of VP1 with VP2 are required to induce significant levels of antibody against CAV. Subsequently, the vaccines were tested in 2-week-old SPF chickens. Chickens immunized with the DNA-plasmid pBudVP2-VP1 showed positive neutralizing antibody titer against CAV. Furthermore, VP1-specific proliferation induction of splenocytes and also high serum levels of Th1 cytokines, IL-2 and IFN-γ were detected in the pBudVP2-VP1-vaccinated chickens. These results suggest that the recombinant DNA plasmid co-expressing VP1 and VP2 can be used as a potential DNA vaccine against CAV.     

鸡传染性贫血病毒套式PCR检测方法的建立

本试验根据GenBank中登录的禽传染性贫血病毒(CAV)基因序列,设计合成2对引物,外引物的扩增片段大小为485 bp,内引物的扩增片段大小为297 bp,建立了适合CAV快速检测的套式PCR方法(nested PCR),并采用该方法对CAV阳性毒株及临床病料进行了检测。结果显示,该方法能扩增到297 bp的条带,禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、禽网状内皮增生病病毒、减蛋综合征病毒、禽呼肠孤病毒、马立克氏病病毒的扩增结果均为阴性。该方法第1步扩增的敏感性是100 pg,第2步PCR扩增的敏感性是1 fg,敏感性提高了10⁵倍。本研究建立的CAV套式PCR方法具有敏感性高、重复性好、特异性强等优点,可用于CAV的临床诊断和分子流行病学调查等。     

鸡贫血病病毒感染雏鸡细胞周期的研究

用流式细胞仪对雏鸡感染鸡贫血病毒后不同时期胸腺和骨髓细胞的细胞周期进行了分析，结果显示感染鸡骨髓和胸腺发生了Ｇ１阻滞，这表明ＤＮＡ合成抑制，Ｇ２／Ｍ期细胞数量明显减少，这说明增殖性细胞在减少。本实验结果提示增殖性细胞减少是鸡传染性贫血病（ＣＩＡ）中胸腺淋巴细胞和骨髓造血细胞大量减少的重要原因之一，这为阐明ＣＡＶ的发病机理提供了新资料     

Isolation and preliminary characterization of chicken anemia virus from chickens in Nigeria

Chicken anemia virus (CAV) was isolated for the first time from the Nigerian chicken population. The virus was recovered from necropsied birds from broiler and pullet flocks that suffered disease outbreaks tentatively diagnosed as infectious bursal disease. A sensitive polymerase chain reaction (PCR) assay detected CAV DNA in tissues of necropsied birds. Restriction endonuclease analysis performed with the 733-bp PCR product and the Cfo I enzyme indicated at least two different CAVs were circulating among the Nigerian chicken population. Four isolates were obtained from pooled liver and thymus tissues using the MDCC-MSB1 cell line. These isolates were found to be antigenically closely related to the Cuxhaven-1 (Cux-1) reference strain of CAV when reacted with four monoclonal antibodies prepared against the Cux-1 virus. One of the isolates (isolate A) induced thymus atrophy, bone marrow aplasia, and low hematocrit values when inoculated into 1-day-old specific-pathogen-free chickens. These findings not only demonstrate that CAV is present in Nigeria, but they also likely represent the first cell culture isolation of the virus in Africa.