两株猪博卡病毒的检测及遗传演化分析

根据Gen Bank公布的猪博卡病毒序列,设计特异性引物,分别对猪博卡病毒(PBo V)的NS1基因、NP1基因、VP1/VP2全基因进行PCR方法测定,所得到的2个阳性样本分别命名为GD4和GD18。各基因遗传分析表明:GD4和GD18株各基因同源性较低,在34.9%⁵0.5%之间;猪博卡病毒主要分为3个大的分支,GD4和GD18分别处于不同的分支;分别与HQ223038和KF206167亲缘关系较近。     

猪博卡病毒VP1蛋白抗原表位分析及其克隆表达

为研究猪博卡病毒(PBo V)VP1蛋白在血清学诊断中的作用,用DNAStar软件预测了PBo V NP08株(Gen Bank登录号KR014255.1)VP1蛋白的主要抗原表位,确定1-334个氨基酸为优势抗原表位区,构建重组质粒p ET32a-VP1,将其转化感受态细胞BL21(DE3),并进行IPTG诱导表达。结果表明,重组菌可表达分子量为56.7 ku的重组蛋白VP1,主要以包涵体形式存在。纯化后蛋白的Western blot结果表明,表达的VP1蛋白与临床阳性血清具有良好的反应性。用该蛋白包被ELISA板,检测10份临床感染PBo V的猪血清样品和3份未感染猪的血清,结果表明其具有很好的特异性,不与未感染猪的血清发生反应,为建立PBo V感染血清学诊断方法奠定了基础。     

我国猪博卡病毒的流行现状及检测技术

<正>猪博卡病毒(PBo V)属于细小病毒科(Parvovirus)细小病毒亚科(Parvovirus)博卡病毒属(bocavirus),为无囊膜的单股DNA病毒,病毒粒子大小为25~30 nm,呈正二十面体结构。病毒基因组全长5.2 kb,编码3个主要的开放阅读框(ORF1~3),其中ORF1编码非结构蛋白NS1,ORF2编码衣壳蛋白VP1和VP2,     

猪博卡病毒(重庆株)NP1部分基因的克隆测序及生物信息学分析

通过设计特异性引物建立基于猪博卡病毒(Porcine Bocavivus,PBo V)NP1基因的特异性PCR方法,从重庆地区猪血液中扩增出PBo V-NP1的部分基因片段,进行基因测序,并与Gen Bank公布的PBo V、HBo V及PPV基因序列进行生物信息学分析。结果显示:本次试验克隆得到的PBo V重庆株NP1部分基因片段大小为257 bp,与已公布的PBo V-NP1基因的同源性为97.3%~100%;重庆株与PBo V瑞典株、PBo V中国株属同一进化分支,且PBo V重庆株NP1基因与PBo V瑞典株NP1基因亲缘性非常接近;PBo V重庆株NP1基因与Gen Bank公布的猪PBo V-NP1和1个人HBo V st1聚在博卡病毒一大分支,与PPV分属两大分支,而HBo V st1株又单独形成另一簇。这表明,PBo V重庆毒株与国外毒株的亲缘性非常接近,推测重庆地区猪群中感染的PBo V可能是通过引进或者进口国外动物性产品而传播感染猪群。     

貉源阿留申病毒VP2和NS1蛋白的抗原性预测

旨在预测和分析貉源阿留申病毒(RFAV)VP2和NS1蛋白的抗原表位特征,筛选阿留申病毒属较保守的B、T细胞抗原表位。本研究对RFAV的近全长基因组进行克隆及测序,对其VP2和NS1基因编码蛋白的理化性质、二级结构、翻译后修饰位点和抗原表位进行预测,并将预测的修饰位点、抗原表位与其他阿留申病毒种的序列进行比较分析,筛选相对保守的修饰位点和抗原表位。结果显示,获得的RFAV基因组长4 327 bp,编码VP2蛋白的636个氨基酸,编码NS1蛋白的641个氨基酸。VP2和NS1蛋白均为亲水性蛋白,二级结构以无规则卷曲为主。在阿留申病毒属内,VP2蛋白有3个保守的B细胞抗原表位,3个保守的T细胞表位,8个保守的翻译后修饰位点;NS1蛋白有1个保守的B细胞抗原表位,2个保守的T细胞抗原表位和7个保守的翻译后修饰位点。本研究成功克隆了RFAV近全长基因组序列,全面对RFAV的VP2、NS1蛋白抗原表位、翻译后修饰位点进行预测,并分析其在阿留申病毒属内的保守和变异特征,为阿留申病毒免疫研究提供参考。     

貉源阿留申病毒VP2和NS1蛋白的抗原性预测

旨在预测和分析貉源阿留申病毒（RFAV） VP2和NS1蛋白的抗原表位特征，筛选阿留申病毒属较保守的B、T细胞抗原表位。本研究对RFAV的近全长基因组进行克隆及测序，对其VP2和NS1基因编码蛋白的理化性质、二级结构、翻译后修饰位点和抗原表位进行预测，并将预测的修饰位点、抗原表位与其他阿留申病毒种的序列进行比较分析，筛选相对保守的修饰位点和抗原表位。结果显示，获得的RFAV基因组长4 327 bp，编码VP2蛋白的636个氨基酸，编码NS1蛋白的641个氨基酸。VP2和NS1蛋白均为亲水性蛋白，二级结构以无规则卷曲为主。在阿留申病毒属内，VP2蛋白有3个保守的B细胞抗原表位，3个保守的T细胞表位，8个保守的翻译后修饰位点；NS1蛋白有1个保守的B细胞抗原表位，2个保守的T细胞抗原表位和7个保守的翻译后修饰位点。本研究成功克隆了RFAV近全长基因组序列，全面对RFAV的VP2、NS1蛋白抗原表位、翻译后修饰位点进行预测，并分析其在阿留申病毒属内的保守和变异特征，为阿留申病毒免疫研究提供参考。     

猫泛白细胞减少症病毒北京株NS1基因克隆与生物信息学分析

为分析猫泛白细胞减少症病毒（FPV）北京株（FPV-BJ 05株）NS1基因的分子特征及其编码蛋白的生物学功能,本研究对FPV-BJ 05株NS1基因进行PCR扩增、克隆及序列测定。应用生物信息学软件分析FPV-BJ 05株与GenBank上登录的11株FPV参考株NS1基因的同源性,并预测NS1蛋白理化性质、信号肽、跨膜结构、B细胞抗原表位、磷酸化位点、亚细胞定位及蛋白结构与功能、高级结构等。结果显示,NS1基因全长2 007 bp,编码668个氨基酸,且与其他FPV分离株NS1基因核苷酸序列同源性为98.8%~99.3%,氨基酸序列同源性为97.9%~98.8%。系统进化树分析结果显示,FPV-BJ 05株NS1蛋白与GenBank上登录的3株FPV参考株处于同一大分支,但由于氨基酸的突变导致其属于独立的一小分支。NS1蛋白既无信号肽也无跨膜结构域,属于非分泌型的疏水性蛋白。B细胞抗原表位预测结果显示,NS1蛋白柔韧性较好,抗原性及表面可及性较高,预测该蛋白含有13个优势抗原位点。修饰结构预测表明,NS1蛋白含有62个潜在磷酸化位点,27个O-糖基化位点和2个N-糖基化位点。亚细胞定位结果显示,NS1蛋白在细胞质和细胞核的概率较高,分别为69.6%和17.4%。NS1蛋白二级结构中α-螺旋、延伸链、无规则卷曲和β-转角分别占39.37%、15.42%、39.37%和5.84%。应用在线软件SWISS-Modle对NS1蛋白进行建模,预测其三级结构,结果发现NS1蛋白主要以α-螺旋为主。本试验结果将为北京地区FPV免疫诊断及核酸疫苗研究提供理论依据。     

猪细小病毒自然弱毒N株VP1基因的扩增与序列分析

对猪细小病毒自然弱毒N株（PPV—N株）VP1基因扩增及测序,利用生物信息学技术预测VP1蛋白的二级结构与B细胞抗原表位,以及分析该蛋白的氨基酸差异位点及密码子偏爱性。结果表明,PPV—N株VP1基因与弱毒参考毒株NADL-2VP1基因同源性最高,亲缘关系最近。PPV—N株VP1蛋白的二级结构较为复杂,以β-折叠为主,并有较多的转角和无规则卷曲区域,在序列的20～56、61～80、86～130、136～188区域为B细胞抗原表位的优势区域。PPV强、弱毒株VP1蛋白存在5个氨基酸差异位点（T-365-I,G-528-D,Q-533-H,P-586-S,K-715-R）,这些位点处氨基酸残基抗原性与毒力成正相关。PPV—N株VP1蛋白在A、C、E、G、H、I、K、N、Q、R、S、T、V和Y氨基酸于密码子选择上存在一定的偏爱性。     

猪博卡病毒VP2基因的克隆及生物信息学分析

为研究猪博卡病毒VP2蛋白的结构与功能,应用套式PCR技术对猪博卡病毒VP2基因进行分子克隆,并对其进行生物信息学分析。结果显示,获得了1 656bp的猪博卡病毒VP2基因(GenBank登录号为KF806730),此序列与其他PBoV分离株核苷酸序列同源性为82%⁸9%,进化树分析结果显示,KF806730与PBoV5在一个分支,说明两者之间具有较近的亲缘关系。经生物信息学分析,此序列编码551个氨基酸,相对分子质量为61 261.7,理论等电点(PI)为5.98,体外半衰期为30h(体外哺乳动物类网状细胞),不稳定系数为34.36,脂肪系数为54.88,平均亲水性为-0.766,最大疏水指数为1.733,最小疏水指数为-3.378;在同一氨基酸的不同密码子的选择上存在一定程度的偏向性;无信号肽和跨膜区;综合多种方法分析预测其主要抗原表位可能位于第78-80aa、311-314aa、507-509aa区域;二级结构、三维结构预测显示VP2蛋白主要以无规则卷曲为主,存在多个螺旋和折叠区域。本试验成功获得猪博卡病毒VP2基因,为以后研究此基因的生物学功能和建立该病毒的诊断方法奠定了基础。     

猫泛白细胞减少症病毒北京株NS1基因克隆与生物信息学分析

为分析猫泛白细胞减少症病毒(FPV)北京株(FPV-BJ 05株)NS1基因的分子特征及其编码蛋白的生物学功能,本研究对FPV-BJ 05株NS1基因进行PCR扩增、克隆及序列测定。应用生物信息学软件分析FPV-BJ 05株与GenBank上登录的11株FPV参考株NS1基因的同源性,并预测NS1蛋白理化性质、信号肽、跨膜结构、B细胞抗原表位、磷酸化位点、亚细胞定位及蛋白结构与功能、高级结构等。结果显示,NS1基因全长2 007bp,编码668个氨基酸,且与其他FPV分离株NS1基因核苷酸序列同源性为98.8%～99.3%,氨基酸序列同源性为97.9%～98.8%。系统进化树分析结果显示,FPV-BJ 05株NS1蛋白与GenBank上登录的3株FPV参考株处于同一大分支,但由于氨基酸的突变导致其属于独立的一小分支。NS1蛋白既无信号肽也无跨膜结构域,属于非分泌型的疏水性蛋白。B细胞抗原表位预测结果显示,NS1蛋白柔韧性较好,抗原性及表面可及性较高,预测该蛋白含有13个优势抗原位点。修饰结构预测表明,NS1蛋白含有62个潜在磷酸化位点,27个O-糖基化位点和2个N-糖基化位点。亚细胞定位结果显示,NS1蛋白在细胞质和细胞核的概率较高,分别为69.6%和17.4%。NS1蛋白二级结构中α-螺旋、延伸链、无规则卷曲和β-转角分别占39.37%、15.42%、39.37%和5.84%。应用在线软件SWISS-Modle对NS1蛋白进行建模,预测其三级结构,结果发现NS1蛋白主要以α-螺旋为主。本试验结果将为北京地区FPV免疫诊断及核酸疫苗研究提供理论依据。     

大熊猫轮状病毒CH-1株外衣壳蛋白(VP7)基因的克隆和生物信息学分析

为研究大熊猫轮状病毒(Giant Panda Rotavirus,GPRV)CH-1株外衣壳蛋白VP7基因的结构及功能,用MA-104细胞(恒河猴胎猴肾细胞)增殖GPRV,提取总RNA,运用RT-PCR扩增VP7基因,并测序,用生物信息学软件预测其功能,并构建系统进化树。结果显示成功获得了长1042bp的GPRV VP7蛋白基因(GenBank登录号GU188284)。经生物信息学分析,此序列包含1个981bp的完整开放阅读框,编码326个氨基酸;预测GPRV VP7蛋白理论相对分子质量为37354.8u,等电点为4.76,半衰期为30h,不稳定系数为26.71,总平均亲水性为-0.015,疏水性介于-2.344～3.567;1—24位氨基酸可能是信号肽序列;跨膜结构分析表明VP7蛋白有2个跨膜区,其N端和C端都位于病毒膜外区;抗原表位预测显示VP7蛋白有12个抗原决定簇;结构预测显示其可能包含2个N-糖基化作用位点,5个蛋白激酶C磷酸化作用位点、4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化作用位点、1个酪氨酸激酶磷酸化作用位点、4个N-豆蔻酰化位点、1个原核膜脂蛋白脂附着点和1个革兰氏阳性球菌表面蛋白‘锚’六肽。系统进化树分析显示GPRV VP7基因与人A组轮状病毒VP7基因的进化距离最近。本研究成功获得了GPRV VP7基因,为今后研究此基因的生物学功能以及建立该病毒的诊断方法奠定基础。     

猫细小病毒VP2基因克隆与生物信息学分析

为了解猫细小病毒（feline parvovirus,FPV）VP2蛋白的分子特点及变异规律,克隆FPV山东分离株SD-01的VP2基因,对其进行生物信息学分析。首先,以FPV阳性病料基因组DNA为模板,PCR扩增VP2基因并克隆获得重组质粒pMD18-T-FPV SD-01-VP2。测序结果显示：VP2基因全长1 755 bp,编码584个氨基酸;氨基酸同源性比对发现,与其他FPV分离株的VP2基因氨基酸同源性较高,可达99.0%~100%。生物信息学分析结果显示：VP2蛋白为非分泌型的亲水性蛋白,无信号肽和跨膜区域;二级结构中α螺旋、延伸链、β转角和无规则卷曲分别占8.7%、24.5%、4.3%和62.5%;三级结构预测发现,VP2蛋白以无规则卷曲为主,与二级结构预测结果一致。亚细胞定位预测显示,VP2蛋白不含有线粒体导肽（mTP）或分泌通道信号肽（SP）,定位在细胞质和细胞核中的概率较高,分别为47.8%和26.1%。B细胞抗原表位预测结果显示,VP2蛋白的抗原性及表面可及性较高,共含有11个潜在的优势B细胞抗原表位。蛋白翻译后修饰预测结果显示,VP2蛋白可能含有49个潜在磷酸化修饰位点,6个N-糖基化修饰位点和21个O-糖基化修饰位点,且这些修饰位点在FPV VP2蛋白内高度保守。本研究有助于了解我国FPV流行情况,掌握其重要结构蛋白VP2的理化性质和特性,从而为下一步VP2蛋白功能研究和疫苗研发奠定了基础。     

猪轮状病毒贵州株VP7基因克隆及生物信息学分析

为了解贵州省猪轮状病毒(PoRV)VP7蛋白的结构及功能,根据Gen Bank发表的猪轮状病毒VP7基因序列设计1对特异性引物,扩增1株猪轮状病毒贵州流行株VP7基因全序列并进行序列测定及生物信息学分析。结果显示:VP7基因全长为1 062 bp,包含一个981 bp的开放发阅读框,编码326个氨基酸,氨基酸突变主要发生在高变区。与已知的14个国内外参考毒株VP7核苷酸和推导的氨基酸序列比较,同源性分别为71.5%~97.0%和72.4%~98.7%,与G4型毒株核苷酸同源性及推导的氨基酸同源性分别为86.6%~97.0%和92.9%~98.7%。核苷酸系统进化树结果显示,贵州流行株与G4型毒株CMP070/09属同一个分支,因此推测贵州流行株为G4型猪轮状病毒。预测PoRV VP7蛋白理论相对分子质量为37.2 ku,等电点为4.75,半衰期为30 h,不稳定系数为31.22;跨膜结构及信号肽分析表明VP7蛋白有2个跨膜区,无信号肽区域;抗原表位预测显示VP7蛋白在第69~104、145~150、176~183、210~224、311~321位及其附近肽段可能为其优势抗原表位;结构预测显示,VP7蛋白存在1个N-糖基化作用位点、14个磷酸化位点,不存在O-糖基化位点。     

口蹄疫病毒O型泛亚株VP1蛋白的二级结构及抗原表位预测

为获得口蹄疫病毒（FMDV）O/PanAsia毒株VPl蛋白的抗原信息,从而为制备多肽疫苗提供理论依据,运用生物信息学软件,对O/PanAsia毒株的结构蛋白VP1理化性质、结构功能以及细胞表位进行分析,预测抗原表位以选择合适肽段。应用ProParam、TMHMM Server、ProScale和SignaIP 等在线工具,分析VP1蛋白氨基酸序列,运用计算机技术和分子生物学软件,分析预测VP1蛋白的基本理化性质、结构功能以及可能的B细胞和T细胞抗原表位,筛选B细胞表位肽段并对VP1的两个主要T细胞表位CTL和Th细胞表位进行预测。结果显示：O/PanAsia毒株VP1 蛋白的等电点为9.49,相对分子质量为23 520.83;VP1蛋白的B细胞表位为8~23、135~149和193~205位氨基酸。预测该VP1有10个CTL和10个Th细胞抗原表位,表明其具有较好的免疫原性;最终筛选出VP1蛋白的5个CTL和5个Th优势表位。用生物信息学方法预测O/PanAsia毒株VPl蛋白为稳定性蛋白,含有T、B淋巴细胞抗原表位。本研究为FMDV的进一步研究和疫苗制备奠定了基础。     

猪细小病毒非结构蛋白NS1基因的克隆、序列分析及蛋白质结构预测

根据GenBank登录的猪细小病毒NADL-2株和China株序列,利用Oligo 6.0软件设计1对扩增NS1全基因的特异性引物,对从贵州省安顺地区检测到的PPV的NS1基因进行扩增、克隆、测序、序列分析和蛋白质结构预测分析。测序结果表明,扩增的目的基因长度为1986 bp,共编码659个氨基酸,其中NS1基因的1287、1288和1298位碱基发生了缺失,导致429、430和433位氨基酸发生缺失。系统发生树结果表明,本试验测序的NS1基因与NADL-2弱毒株处在同一进化分支;氨基酸同源性与NADL-2弱毒株和Kresse毒株最高,均为98.6%。蛋白质结构预测分析结果表明,非结构蛋白NS1的分子质量为75269.76 u,理论等电点pI为7.25,不稳定系数为41.57,推测其为不稳定蛋白质;脂肪指数为73.58,总体平均亲水性为-0.565,推测该蛋白质是一种亲水性蛋白质;该蛋白质含有丰富的α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲,柔性区域较多,呈连续分布;非结构蛋白NS1无跨膜区和信号肽;预测非结构蛋白NS1含有3个N-糖基化位点、3个cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点、5个蛋白激酶C磷酸化位点、22个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点、8个N-肉豆蔻酰化位点、1个酰胺化位点及1个ATP/GTP结合位点基序A(P-环);该蛋白质抗原表位较多,存在10个主要的抗原表位。     

猪博卡病毒的基因分型

为了解猪博卡病毒(PBoV)的遗传进化规律,研究可行的PBoV基因分型方法,本研究利用Gen Bank中登录的29条PBoV和2条本实验室测得的全基因组序列信息,采用生物信息学软件进行基因组序列分析。结果显示,分别以NS1基因、NP1基因和VP1基因编码氨基酸构建的系统进化树,PBoV均被划分为3个基因群,但三种氨基酸序列绘制的进化树存在差异;基因群内各病毒株的氨基酸序列同源性较高,而各基因群之间病毒株的氨基酸序列同源性非常低,基因组结构差异较大。     

猪博卡病毒的研究进展

猪博卡病毒是最近发现的一种属于细小病毒科博卡病毒属的单链DNA病毒。它具有三个开放阅读框,能够编码NS1,NP1,VP1和VP2四种蛋白。常与其它致病菌混合感染猪只。可以通过PCR,实时荧光定量PCR,环介导等温扩增技术和其它分子病毒学技术进行检测。目前在粪便、血清、肾脏、淋巴结和其它组织器官检测到该病毒。由于猪博卡病毒是新发现的一种病毒,所以还有很多问题未得到解决,本文将对近几年该病毒的研究进展进行阐述。     

鹅源副黏病毒NA-1株F蛋白抗原表位预测和三维结构建模

以鹅源副黏病毒NA-1株F蛋白的氨基酸序列为基础,分析预测蛋白的理化性质、三维结构与B细胞的抗原表位。运用生物信息学方法及手段对NA-1株F蛋白的理化性质、亲疏水性、可及性、信号肽、跨膜结构域、二级结构等方面进行分析,预测其抗原表位。同时利用同源建模法预测其三维空间结构。结果NA-1株F蛋白存在多个潜在的抗原表位位点。该研究为进一步通过试验方法确定其优势表位和从结构出发了解其生物学功能提供了理论依据。     

安卡拉病毒贵州流行株penton基因分子特性分析

为了解安卡拉病毒贵州流行株penton基因分子特征,本试验参考GenBank上FAdV基因序列设计合成特异性引物,对penton基因CDS区进行扩增,运用生物信息学软件对penton基因的核苷酸序列、蛋白质理化性质、信号肽、二级结构、三级结构和B细胞表位进行分析。结果显示,3株FAdV（GZ-BJ、GZ-QL、GZ-LPS）penton基因片段大小均为1 578 bp。系统进化树分析显示,GZ-BJ、GZ-QL、GZ-LPS均属于FAdV-4型,3株FAdV-4核苷酸同源性在99.9%~100%之间,推导氨基酸序列同源性在99.8%~100%之间;与国内其他分离株、国外分离株差异不大。蛋白理化性质分析显示,该蛋白属于不稳定的、不具有跨膜结构的亲水蛋白,其二级结构主要以无规则卷曲为主（54.29%）;结构域预测结果显示,penton蛋白只含有一个低复杂度区域;B细胞表位预测发现,penton基因编码的氨基酸可能存在3个优势抗原表位区,分别为5-171、207-236和420-462位氨基酸处。本试验结果表明,安卡拉病毒penton基因相对保守,存在多个优势抗原表位,可作为安卡拉病毒防控研究靶蛋白,为该病毒防控与致病机理研究奠定基础。     

猪博卡病毒非结构蛋白NP1基因的克隆及基因分型研究

为明确猪博卡病毒福建株非结构蛋白NP1的特征,本研究根据GenBank中登录的非结构蛋白NP1的基因特征,设计特异性引物从一份患有断奶仔猪多系统衰竭综合征的仔猪肺脏和淋巴结基因组DNA中扩增到猪博卡病毒非结构蛋白NP1的全长基因序列。测序结果显示,本试验克隆的猪博卡病毒非结构蛋白NP1的基因全长为675bp,编码有224个氨基酸,其与美国株猪博卡病毒(OH110株)核苷酸同源性最高,达97.3%,但与美国株猪博卡病毒(IN109-1株)核苷酸同源性仅为81.8%;与英国北爱尔兰野猪博卡病毒(F41株和64-1株)同源性均不高,分别为82.5%和80.9%;与猪博卡病毒(H18株)核苷酸同源性最低,仅为43.8%。通过对猪博卡病毒代表株进行核苷酸同源性比对分析发现,猪博卡病毒存在3个主要的基因群,不同基因群非结构蛋白NP1的核苷酸同源性均低于50.0%。结果提示需对猪博卡病毒进行明确的划分,不同来源的猪博卡病毒可细分为3个明显的代表种。