索式桃花水母全长cDNA文库的构建

[目的]构建索式桃花水母的全长cDNA文库,为桃花水母的生长、发育、衰老过程功能基因的进一步筛选、克隆和表达奠定基础。[方法]利用RNAiso试剂盒提取桃花水母的总RNA,采用SMART技术合成全长cDNA,经SfⅠi酶切消化后,将cDNA克隆到质粒载体pDNR-LIB,并对cDNA文库进行质量评价。[结果]经鉴定,原始文库的滴度为7.9×10^5cfu/ml,库容量约为1.0×10^6cfu。随机挑取28个克隆,经PCR快速鉴定,插入片段大小在0.5～2.5kb,平均大小在1.0kb左右,重组率达94%,表明获得了高质量的桃花水母cDNA文库。[结论]该试验成功构建了桃花水母cDNA文库,其cDNA原始文库的库容,根据真核生物能够满足建库的要求,同时文库的cD-NA插入片段序列是完整的,从而证实构建的文库质量较好,可以用于桃花水母目的基因的筛选。     

单菌落PCR在发夹RNA重组克隆鉴定中的应用

以单菌落为模板进行PCR扩增,直接筛选插有发夹RNA(Small hairpin RNA,shRNA)干扰片段的重组阳性克隆。以圆滑单菌落为PCR模板,采用载体通用引物直接扩增目的片段,质粒测序验证PCR结果的正确性。结果表明,在筛选的6个菌落中均扩增出324 bp的目的条带,进一步进行测序分析鉴定,证实了菌落PCR阳性克隆含有发夹RNA干扰片段。单菌落PCR是一种简便、快速、可靠、有效筛选重组阳性克隆的方法。     

利用BAC克隆混合型探针筛选中国美利奴细毛羊cDNA文库

采用Taq酶进行快速标记细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome,BAC)克隆酶切片段,对制备好的混合型探针进行检测。通过噬菌体原位杂交的方法,筛选中国美利奴细毛羊cDNA文库。结果杂交筛选获得了3个cDNA阳性克隆,经过测序比对,分析了主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)基因的组成。     

菌落PCR技术在重组质粒筛选与鉴定中的应用

应用以菌落为模板的聚合酶链反应(PCR)技术,筛选插有酒类酒球菌苹果酸-乳酸酶基因mleA和苹果酸通透酶基因mleP序列的重组阳性克隆,筛选到的阳性克隆分别扩增到约1600bp及900bp的条带,且与两个目的基因片段大小一致。提取阳性克隆的质粒进一步进行双酶切(EcoR -Kpn )及质粒PCR鉴定,证明结果正确。菌落PCR技术的应用使重组质粒的筛选和鉴定得以优化和简化。     

梅花鹿心脏组织cDNA文库的构建

[目的]构建梅花鹿心脏cDNA文库。[方法]提取梅花鹿心脏总RNA,纯化mRNA;合成双链cDNA,连接载体,并电转化至感受态细胞;测定文库的克隆数、重组率及插入片段大小。[结果]经鉴定,所构建梅花鹿心脏组织cDNA文库,库容量为3.8×106个克隆,重组率为100%,插入片段大小为0.5～2.0kb,平均长度约为1.0kb。[结论]所构建cDNA文库的各项指标均达到要求。     

春大豆花芽cDNA文库的构建及质量分析

【目的】为了解大豆多荚、多粒相关基因的调控机制,构建了大豆花芽cDNA文库,根据要求初步鉴定了所构建文库的质量.【方法】以大豆吉农18突变体的幼嫩花芽为材料提取总RNA,采用SMART技术合成双链cDNA.经蛋白酶K的消化及SfiⅠ酶切后,将所得cDNA克隆到λTriplEx质粒载体中,成功构建了大豆花芽全长cDNA文库.【结果和结论】将初始文库经扩增后保存,检测扩增文库滴度为2.13×108pfu/mL,重组率接近95.3%,菌落PCR鉴定插入片段主要分布在0.5~2.0 kb.插入片段平均大小在1.0 kb左右.表明本研究所构建的文库既满足了目的基因的分离筛选,又可保证全长cDNA文库的获得,该文库的构建为进一步开展相关基因的克隆及分子生物学研究奠定基础.     

津田芜菁直根皮cDNA文库的构建及ESTs测序质量的分析

利用Trizol法从津田芜菁中提取总RNA,分离纯化富含Poly(A)+的mRNA,反转录合成双链cDNA,并以λ-ZAP为载体,构建了津田芜菁cDNA文库。以XL1-Blue为受体菌,测定原始文库的滴度为4. 3×106pfu/mL,重组率为96%,扩增后文库总滴度为6×1010pfu/mL。对随机提取的质粒进行PCR鉴定,表明插入片段大多分布在0. 5~2. 0kb之间。文库质量鉴定结果表明,构建的津田芜菁直根皮cDNA文库具有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段。对3 020个克隆的序列测定表明,获得可用序列2 718个,测序成功率为90%,首批共获得652个芜菁直根皮ESTs。     

果梅花与果实cDNA文库的构建及鉴定

以果梅品种'细叶青'不同时期的花和果实为实验材料,应用Creator SMART cDNA Construction Kit构建了我国果梅第一个花和果实的cDNA文库。结果表明,该文库的库容量约为1.4×106pfumL,从扩增文库中随机挑取30个克隆进行PCR鉴定,其重组率达97%,插入片段多分布在1～3kb之间,平均大于1kb。说明本研究成功构建了果梅花和果实的cDNA文库,为进一步开展果梅开花调控和果实发育等相关基因的克隆及其表达与功能分析等研究奠定了重要基础。     

正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库构建及EST初步分析

【目的】构建猪淋巴细胞基因文库,初步绘制正常猪外周血淋巴细胞的基因表达谱,为进一步筛选免疫相关基因提供平台。【方法】以mRNA为模板,经反转录酶催化,在体外反转录成cDNA,与质粒载体连接后转化大肠杆菌,进一步扩增后,获得猪外周血淋巴细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合,并进行序列分析和注释。【结果】构建了正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库,获得库容量为1．2×10^6PFU／mL、重组率为93．3％、85％插入片段处于750～2000bp的高质量文库;随机测定1100条ESTs,经拼接和聚类,获得152条高表达的基因重叠群（Contigs）和619条低表达基因——单拷贝的EST（Singletons）;经序列比对分析,发现23．3％ESTs为与任何物种都没有匹配的新基因,75．9％ESTs为与猪没有匹配的新基因。用GO数据库对获得的EST进行基因功能分类和KEGG路径图分析,发现丝裂原活化蛋白激酶途径（Mitogenn—activated protein kinase,MAPK）、钙信号通路、胰岛素信号通路、脂肪细胞因子信号通路、Toll—like受体信号通路、B细胞受体信号通路和T细胞受体信号通路的基因均有较高表达。【结论】大部分的猪外周血淋巴细胞基因尚未被分离和鉴定出来,但这些基因mRNA转录和表达丰度均较高,且在猪外周血淋巴细胞中起着非常重要的作用。     

牛Dgat1基因高GC含量片段的定点突变

将扩增出的1.8 kb目的片段克隆入pUCm-T载体,以构建好的质粒为模板进行突变反应。DpnⅠ酶切反应产物,去除甲基化及半甲基化DNA模板。酶切产物经纯化后转入DH5α感受态细胞,提取质粒测序。结果表明,双核苷酸碱基AA突变为GC,成功得到突变载体。将定点突变试剂盒方法加以改进,完成GC含量高达69.5%模板定点突变,改进后的方法操作简单、经济实用,有效地解决了高GC含量模板难突变难题。     

K88菌毛基因的克隆及ST表位序列在菌毛基因上的融合

[目的]为了建立用于细胞表面展示的载体系统。[方法]利用PCR技术,以大肠杆菌质粒为模板扩增K88菌毛操纵子的结构基因faeC~faeH,并克隆到pBR322质粒载体中。合成一段替换序列,在菌毛抗原基因的超变区引入酶切位点ApaI和NcoI,合成耐热肠度素STII表位编码序列,并引入菌毛抗原基因的超变区。[结果]经PCR鉴定和限制性内切酶酶切证明,重组质粒pBR-fae插入片断大小为6.6kb,与预期相符。核苷酸序列分析证明,所得faeC~faeH序列正确。PCR筛选和测序验证证明,构建了K88菌毛-耐热肠度素STII的融合基因。[结论]试验成功获得了重组质粒pBR-fae-ST。     

伪狂犬病病毒gG基因缺失通用转移载体的构建

对克隆有伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA SphI 15kb片段的质粒pBSA用SphI和KpnI消化，将含gG全基因及其上游PK基因，下游gD基因部分编码区的约2．6kb的片段亚克隆到消除了EcoRI位点的载体pUC19中，获得重组质粒pUSK(E)。以pEGFP-N1为模板，通过PCR扩增约0．3kb的SV40Poly(A)片段，并将其克隆到杆状病毒转座载体pFastBac1的NotI和PstI位点，利用pFastBac1的BamHI和PstI将含有9个酶切位点以及SV40Poly(A)的片段亚克隆到pUSK(E)的相应位点，在插入的同时导致gG基因5‘端编码区约9个酶切位点以及SV40Poly(A)的片段亚克隆到pUSK(E)的相应位点，在插入的同时导致gG基因5‘端编码区的400bp的缺失，构建了由gG启动子驱动gG部分编码区缺失的通用转移载体pgG-Uni。序列分析进一步证实：有7个单一酶切位点可供外源基因直接插入。上述结果为构建以伪狂犬病病毒作载体的多价基因工程疫苗以及利用标记蛋白探讨伪狂犬病病毒在体内的增殖与分布奠定了基础。     

棉花花药全生育期均一化全长cDNA文库的构建和分析

【目的】深入了解棉花花药发育的分子机制,并为其不育机理的研究提供参考序列。【方法】构建棉花花药全生育期的均一化全长cDNA文库并测序获得9 896条高质量的EST,利用生物信息学和荧光定量相结合法对所得数据进行系统分析。【结果】该cDNA文库库容为1.2×107,插入片段分布在1—3 kb。将所测得的高质量EST进行拼接得到6 643条unigenes,平均长度为779 bp。经过序列比对注释和生物信息学分析,得到一系列在棉花花药发育过程中起重要作用的基因,并获得28条参与花粉壁合成的基因。荧光定量结果表明,这些基因均在花药发育前期优势表达,尤其是在四分体时期表达量最高。【结论】获得大量的棉花花药表达基因,并分析得到一些调节棉花花药发育的重要途径以及参与棉花花粉壁合成相关基因。     

鸭卵清蛋白5'端调控区的克隆和序列分析

通过PCR技术从产蛋鸭输卵管基因组中扩增出1．2kb的鸭清蛋白5’端调控区,将其亚克隆入phDl8-T载体的多克隆位点(命名为pOV),经酶切和测序鉴定可作为启动外源基因表达的调控序列。为构建其启动外源基因的质粒表达载体作准备。     

抗 ICOSL 核糖体展示单链抗体库的构建

[目的]构建出鼠源抗ICOSL核糖体展示抗体库。[方法]通过RT—PCR从人B淋巴瘤细胞Daudi的总RNA中扩增出ICOSL胞外区基因,并将此基因插入到原核表达载体pET28a中进行表达。以表达纯化的ICOSL蛋白为抗原免疫Balb／c小鼠,取小鼠脾脏提取总RNA,通过RT—PCR扩增小鼠的重链可变区和Linker（VH—linker）序列,以及轻链可变区和Linker（VK—linker）序列。经重组PCR将两段基因连接起来,将VH／K与pMD19一T载体链接产物转化E．coliDH50L,PCR鉴定并测序。[结果]VH和κ链得到正确的扩增,长度分别为421和689bp,V14／κ连接产物正确,连接产物长度为1079bp。[结论]所采用的引物及反应条件能够扩增出目的基因,成功构建了鼠源抗ICOSL核糖体展示抗体库,为进行核糖体展示体外筛选抗IcosL特异性单链抗体奠定基础。     

含伪狂犬病毒完整UL49基因及部分UL48基因片段的克隆与序列分析

以地高辛标记的伪狂犬病毒（PRV）Ea株UL49.5基因片段为探针，同SalI、KpnI、BamHI消化的PRV Ea株基因组DNA进行Southern杂交，确定SalI2.8kb、KpnI17.0kb、BamHI25.0kb片段中含UL49基因。将SalI2.8kb片段克隆到pUC119中，利用其中的BamHI进行亚克隆，获得重组质粒pUC2.0。测定约2.0kb片段的全序列并进行序列分析，发现该片段包含UL50基因部分编码区，UL49.5基因和UL49基因的完整编码区，并且在UL49基因下游，还存在一段约369个碱基的序列，经与人单纯疱疹病毒I型（HSV－1）、牛单纯疱疹病毒I型（BHV－1）的UL48基因进行比对，具有较高的同源性，推测为PRV UL48基因的部分编码区。