蓝舌病病毒血清Ⅰ型VP2与VP5、VP3与VP7两组蛋白在杆状病毒系统中的表达与鉴定

为表达具有天然构象的蓝舌病病毒血清1型(BTV1)主要结构蛋白VP2、VP3、VP5和VP7,研制针对流行于我国的BTV1型毒株的病毒样颗粒(virus-like particles,VLP)疫苗提供基础,将编码BTV1 VP2和VP5蛋白的基因分别克隆到双表达载体pFastBacDual的启动子pPH和pP10下游,构建重组质粒pFastBacDualBTV1-VP2-VP5,将重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,获得重组穿梭质粒rBacmidBTV1-VP2-VP5,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacBTV1-VP2-VP5;按照同样策略,制备重组杆状病毒rBacBTV1-VP3-VP7。使用兔抗BTV1-VP5蛋白多克隆抗体和鼠抗BTV-VP7蛋白单克隆抗体,分别对rBacBTV1-VP2-VP5和rBacBTV1-VP3-VP7感染的Sf9细胞进行间接免疫荧光试验(IFA)检测,结果病毒感染细胞可见特异性荧光出现;使用兔抗BTV1-VP2蛋白多克隆抗体和兔抗BTV1-VP3蛋白多克隆抗体,分别对rBacBTV1-VP2-VP5和r BacBTV1-VP3-VP7感染的Sf9细胞进行Western-blot检测,可见相对分子质量约100 kDa左右的条带,大小与预期相符。IFA检测和Western Blot检测结果显示,BTV1 VP2、VP3、VP5和VP7蛋白均得以表达,且具有良好的反应原性。     

蓝舌病病毒血清1型VP2与VP5、VP3与VP7两组蛋白在杆状病毒系统中的表达与鉴定

为表达具有天然构象的蓝舌病病毒血清1型（BTV1）主要结构蛋白VP2、VP3、VP5和VP7,研制针对流行于我国的BTV1型毒株的病毒样颗粒（virus-like particles,VLP）疫苗提供基础,将编码BTV1 VP2和VP5蛋白的基因分别克隆到双表达载体pFastBacDual 的启动子pPH和pP10下游,构建重组质粒pFastBacDual-BTV1-VP2-VP5,将重组质粒转化DH10Bac感受态细胞,获得重组穿梭质粒rBacmidBTV1-VP2-VP5,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacBTV1-VP2-VP5;按照同样策略,制备重组杆状病毒rBacBTV1-VP3-VP7。使用兔抗BTV1-VP5蛋白多克隆抗体和鼠抗BTV-VP7蛋白单克隆抗体,分别对rBacBTV1-VP2-VP5和rBacBTV1-VP3-VP7感染的Sf9细胞进行间接免疫荧光试验（IFA）检测,结果病毒感染细胞可见特异性荧光出现;使用兔抗BTV1-VP2蛋白多克隆抗体和兔抗BTV1-VP3 蛋白多克隆抗体,分别对rBacBTV1-VP2-VP5和rBacBTV1-VP3-VP7感染的Sf9细胞进行Western-blot检测,可见相对分子质量约100 kDa左右的条带,大小与预期相符。IFA检测和Western Blot检测结果显示,BTV1 VP2、VP3、VP5和 VP7蛋白均得以表达,且具有良好的反应原性。     

25型蓝舌病病毒VP2蛋白的原核表达及鉴定

为获得体外表达的25型蓝舌病病毒(BTV)VP2蛋白,本研究以NCBI上发表的25型BTV L2基因序列为模版,设计3对引物,PCR扩增3段部分重叠基因。将3段基因克隆到原核表达载体p ET-28a(+)中,构建重组质粒。以1.0 mmol/L的IPTG诱导含有阳性质粒的重组菌p ET-28a(+)-VP2-A/BL21、p ET-28a(+)-VP2-B/BL21、p ET-28a(+)-VP2-C/BL21进行表达,获得3段VP2蛋白,分别命名为VP2-A、VP2-B、VP2-C。经SDS-PAGE鉴定结果表明,重组蛋白以包涵体形式表达,大小依次为50 ku、48 ku、48 ku,与预期蛋白大小一致。经Western blot分析,VP2-A、VP2-B、VP2-C与His-Tag单抗发生特异性结合,证明其具有较好的反应原性。25型蓝舌病病毒VP2蛋白的分段表达为VP2蛋白的功能研究和制备蓝舌病的诊断试剂奠定了基础。     

含T细胞表位的猪细小病毒VP2基因核酸疫苗的构建及其在小鼠中的免疫原性分析

为研制猪细小病毒(PPV)主要保护性抗原VP2基因核酸疫苗,本研究将猪圆环病毒(PCV)编码T细胞表位P21多肽的序列连接于PPV VP2基因的5’端克隆于pcDNA3.1(+)中,构建重组表达质粒pcDNA-P21-VP2,并将其经磷酸钙介导转染HEK293T细胞中检测其表达情况。SDS-PAGE和western blot检测表明,P21-VP2重组蛋白获得了有效的表达,其分子量约为67 ku。将pcDNA-P21-VP2肌肉注射BALB/c小鼠后,采用ELISA方法检测其抗体,并采用MTT法检测小鼠免疫后脾脏淋巴细胞的增殖活性。试验结果表明,重组质粒能够有效诱导小鼠产生明显的抗体反应,并且对淋巴细胞的增殖反应有明显促进作用。该实验结果为研制有效的PPV核酸疫苗奠定了基础。     

传染性法氏囊病病毒主要结构蛋白VP2、VP1和VP2-VP1串联基因的原核表达及其初步应用

为获得传染性法氏囊病病毒(IBDV)特异性抗体检测用抗原VP2、VP1及VP2-VP1蛋白,分别设计引物扩增IBDV野毒株NN1172的VP2和VP1基因,并扩增VP2和VP1基因中抗原性和亲水性较好的重要区域,通过PCR扩增基因串联方法对截短的VP2和截短的VP1基因进行串联,首次获得VP2-VP1串联基因,并对VP2、VP1和VP2-VP1串联基因进行了原核表达和鉴定。结果成功构建了原核表达载体pET-VP2、pET-VP1和pET-VP2-VP1;诱导表达条件显示,3个重组质粒分别转入BL21菌株后经0.05 mmol/L IPTG诱导表达,分别得到分子量为69、114和63 kDa的VP2、VP1和VP2-VP1重组蛋白,且均以包涵体形式表达,3个重组蛋白分别于诱导后5、3和6 h时表达量最多。Western blot结果显示,表达的VP2、VP1和VP2-VP1蛋白与鸡抗IBDV阳性血清均具有良好的反应原性。以纯化的VP2、VP1和VP2-VP1蛋白作为包被抗原对传染性支气管炎病毒(IBV)、呼肠孤病毒(ReoV)、禽白血病病毒(ALV)和新城疫病毒(NDV)4种阳性血清检测均为阴性,表明所获得的纯化蛋白具有高度的特异性;对免疫了IBD灭活疫苗,IBD基因工程疫苗和IBD弱毒疫苗的商业鸡群进行抗体检测,结果均能显示疫苗免疫后机体抗体水平的变化趋势。本研究表明利用该原核表达系统所表达的3个蛋白均具有良好的免疫反应活性,为IBDV特异性抗体的检测和新型亚单位疫苗的研发奠定基础。     

BTV-16四结构蛋白的共表达与病毒样颗粒的制备

目前疫苗免疫是预防蓝舌病的主要有效手段,蓝舌病病毒样颗粒(VLPs)疫苗是蓝舌病疫苗研究的热点之一.为了制备蓝舌病病毒血清16型(BTV-16)病毒样颗粒,研究对载体pFastBac-Dual进行了改造,使其具有4个独立启动子的多克隆位点.依次将BTV-16 VP2、VP5、VP3和VP7基因插入到改造后载体(pF4)...     

猪细小病毒VP2蛋白的原核表达及其免疫原性评估

利用原核表达载体pET28a和pColdⅠ与猪细小病毒VP2基因分别构建重组表达质粒，并采用与伴侣蛋白共表达和低温诱导表达猪细小病毒VP2蛋白，并以电镜观察、血凝效价测定等进行鉴定。结果显示，2个表达载体均能对重组蛋白进行可溶性表达。冷休克载体组pColdⅠ-VP2蛋白在上清中表达效率更高且杂蛋白较少，诱导时不需要额外添加L-阿拉伯糖，表达过程工艺相对更简单。纯化后的pColdⅠ-VP2蛋白具有一定的免疫反应性，能在体外组装成病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs),且具有血凝活性，使用206佐剂混合乳化重组蛋白免疫豚鼠后，血清中能检测到高滴度血凝抑制抗体。上述结果为进一步研究新型安全高效的猪细小病毒疫苗提供了数据支持。     

犬细小病毒VP2基因编码主要抗原表位区的核酸免疫及其免疫原性研究

为评价犬细小病毒(CPV)VP2主要抗原表位的免疫原性,本研究对CPV YZ株VP2的氨基酸序列进行分析,确定了主要抗原表位区域(VP2-228),通过PCR扩增相应的表位编码区域基因片段(700 bp),将其克隆于真核表达载体p VAX1中构建重组真核表达质粒p VAX1-VP2-228。Western blot结果显示VP2-228能够在COS-7细胞中正确表达。将该重组质粒免疫小鼠,利用血凝抑制试验检测不同时期的抗体水平,以MTT法检测免疫35 d时淋巴细胞的增殖活性。结果表明p VAX1-VP2-228能够诱导小鼠产生较高的抗体水平;淋巴细胞增殖试验表明免疫小鼠的淋巴细胞刺激指数显著高于对照组(p0.05)。本研究为开展CPV DNA疫苗的研究提供了实验依据。     

蓝舌病16型病毒核心样颗粒的获取与鉴定

为了制备一种新型基因工程疫苗BTV-16 VLP疫苗,将蓝舌病病毒16型VP3与VP7基因片段插入杆状病毒双表达载体pFastBac Dual质粒中,通过转染Sf9细胞,同时表达VP3与VP7蛋白。经负染后电镜观察到有与蓝舌病病毒形态相似的核心样颗粒,表明蓝舌病VP3与VP7蛋白能自主组装形成核心样颗粒,并通过Western Blot试验验证该核心样颗粒与蓝舌病病毒具有相同的抗原性。因此本研究成功构建出16型蓝舌病病毒核心样颗粒,为病毒样颗粒装配打下了基础,为制备16血清型BTV VLP疫苗做好前期准备。     

利用杆状病毒表达系统表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白

从GenBank下载传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因序列,根据昆虫细胞偏爱密码子对IBDV VP2基因进行密码子优化,化学合成优化后的VP2基因序列,然后构建杆状病毒表达载体pTri Ex-4-VP2,构建成功的重组杆状病毒pTri Ex-4-VP2转染sf9细胞,制备病毒原种,采用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定VP2的免疫原性。结果显示:细胞感染Bac-VP2后,其细胞裂解蛋白在58 ku附近有1个条带,且该条带与IBD阳性血清发生特异性反应;间接免疫荧光试验(IFA)结果显示VP2基因能在Sf9细胞中表达;动物攻毒保护试验中,2次免疫重组VP2蛋白后能诱导14日龄SPF鸡产生对IBDV强毒攻击,保护率为60%。本研究为进一步研究IBDV VP2基因工程疫苗提供了物质基础。     

表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的重组火鸡疱疹病毒的构建及生物学特性分析

鸡传染性法氏囊病（IBD）是一种严重危害养禽业的高度致死性和免疫抑制性传染病。为研制IBD重组火鸡疱疹病毒（HVT）活载体疫苗,本研究构建了表达鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）保护性抗原VP2基因的重组HVT并对其体外生物学特性进行了分析。通过RT-PCR扩增IBDV超强毒株VP2基因并克隆入pCI载体,获得重组真核表达质粒pCI-VP2。用限制性内切酶将携带CMV启动子的VP2基因表达框架切下,连接于入门质粒pENTR,构建获得重组入门质粒pENTR-VP2。将pENTR-VP2与HVT重组黏粒H3-Kan/ccdB进行LR重组反应,构建重组表达黏粒H3-VP2。用H3-VP2与其他4个相互重叠并覆盖HVT全基因组的黏粒共同转染鸡胚成纤维细胞（CEF）,拯救获得重组病毒rHVT-VP2。将重组病毒在CEF中连续传至20代后用PCR、间接免疫荧光试验和免疫印迹试验进行检测,并绘制重组病毒体外生长曲线,分析其体外复制特性。结果表明,重组病毒rHVT-VP2能够稳定表达VP2蛋白,rHVT-VP2在CEF中的复制能力与亲本病毒无明显差异。重组病毒rHVT-VP2免疫鸡后能够诱导产生IBDV中和抗体,并对IBDV强毒株攻击引起的死亡提供90%免疫保护。重组病毒rHVT-VP2的构建为研制IBD重组HVT活载体疫苗奠定了基础,对IBD的防控具有重要意义。     

斑点免疫结合试验和酶联免疫吸附试验检测绵羊蓝舌病病毒抗体的比较

蓝舌病,一种由节肢动物传播的家畜和野生反刍动物的病毒性疾病,世界范围发生。虽然所有反刍动物可能易感,但通常只见绵羊出现严重的临床疾病。 蓝舌病病毒(BTV)有24个血清型。这些血清型可用中和试验区别。全部血清型具有一种群特异性抗原,其抗体能用不同免疫学方法如补体结合、免疫扩散(ID),免疫     

新型鸭细小病毒VP3基因克隆与原核表达

应用PCR方法扩增新型鸭细小病毒(NDPV)VP3基因,将其克隆至原核表达载体pQE1中,获得重组质粒pQE1-VP3。重组质粒pQE1-VP3经优化诱导表达后,通过SDS-PAGE对表达产物进行分析并利用His标签抗体对表达的蛋白进行Western blot鉴定。结果表明,NDPV VP3蛋白在25℃、IPTG浓度为1.0mmol/L经诱导5h,可获得最大诱导表达量,表达蛋白的分子质量约为60ku,主要以不溶性包涵体形式存在。纯化复性后,可获得浓度为5.165 mg/mL及纯度为97%的VP3蛋白。获得的重组菌pQE1-VP3以及高纯度的VP3蛋白,为进一步研究NDPV检测方法和新型疫苗奠定了基础。     

兔瘟病毒VP60蛋白原核表达及其应用

为获得活性良好的兔出血症病毒基因工程抗原,本研究对兔出血症病毒ZB分离株的VP60基因进行了原核表达与初步应用。参照ZB株分离病毒VP60基因序列,设计合成一对特异性引物,PCR扩增长876bp的VP60基因片段。将目的片段定向克隆至pET30a表达载体中,经鉴定正确后,重组质粒转化BL21表达菌,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组蛋白,重组蛋白纯化后,Western blot检测表明具有良好的抗原性与特异性,以该蛋白作为诊断抗原,初步建立了检测兔瘟病毒抗体的间接ELISA诊断方法。本研究为RHDV分子流行病学调查提供了参考,为VP60蛋白结构与功能研究、RHDV抗体检测试剂盒及新型疫苗的研制奠定基础。     

蓝舌病疫苗国内外研究进展

蓝舌病是反刍动物的一种非接触性传染病,主要发生于绵羊,在该病流行地区,于发病季节前接种蓝舌病疫苗可有效预防该病。总结了目前国内外蓝舌病弱毒疫苗、灭活疫苗、病毒样颗粒及重组疫苗的研究进展。以期为相关研究提供参考。     

蓝舌病病毒VP5蛋白的原核表达及其抗原性分析

为表达蓝舌病病毒(BTV)VP5蛋白并检测其生物学活性,本实验采用RT-PCR方法扩增血清12型BTV的VP5基因,构建重组质粒pMAL-VP5。将重组质粒转化TB1感受态细胞,以0.4 mmol/L的IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示,融合了大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP)标签的VP5重组蛋白以可溶形式表达,分子质量约为112.2 ku。利用MBP标签对重组蛋白进行纯化,并以其作为包被抗原,间接ELISA检测山羊血清样品,结果 5份羊血清P/N值均大于1,其中有1只羊检测结果 P/N值为2.396,鉴定为阳性血清,表明重组蛋白可以与VP5抗体反应,可以作为检测BTV VP5抗体的抗原,为今后进一步开展BT诊断研究奠定了基础。     

猪IL2基因重组对PPV VP2-PCV2ORF2真核质粒免疫原性增强的研究

将猪IL2成熟肽基因、PPV VP2基因和PCV2 ORF2抗原多肤基因定向克隆至真核表达载体pCI-neo,构建重组质粒pCI-ORF2-VP2和pCI-IL2-ORV2-VP2,用脂质体介导法将其转染PK15细胞,采用RT-PCR法和间接免疫荧光法检测重组质粒在体外的表达情况.并以小鼠为动物模型,分别将pCI-IL2-ORF2-VP2质粒、pCI-ORF2-VP2质粒、pCI空载体、猪细小灭活苗和圆环亚单位苗通过肌注进行免疫,检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞转化功能,外周血T淋巴细胞亚群的动态变化及血清抗体效价.结果表明,重组质粒在体外能正常表达,pCI-IL2-ORF2-VP2免疫小鼠脾脏淋巴细胞转化功能,CD4+、CD8+T淋巴细胞的数量和血清PPV/PCV2抗体的OD值在二免后均高于或显著高于pCi-ORF2-VP2对照组.结果表明,猪IL2基因重组能显著增强VP2/ORF2核酸疫苗诱导的免疫应答.     

蓝舌病Ⅰ型病毒VP5蛋白的表达纯化及免疫原性分析

为分析蓝舌病Ⅰ型病毒(BTV-1)VP5蛋白的免疫原性,本研究构建了载体PET-28a-VP5并转化BL21(DE3),然后进行IPTG诱导表达,以及SDS-PAGE和Western-blot分析。结果显示,重组VP5蛋白相对分子质量约为62 kDa,与预期结果一致。进一步优化条件,发现IPTG为0.2 mmol/L、温度为25℃、诱导6 h时,重组蛋白在上清中表达量最高,通过Ni柱纯化获得的重组蛋白纯度约为75%。将纯化后的重组蛋白VP5分别以40μg/只和20μg/只免疫Balb/c小鼠,同时设置PBS为阴性对照,对三免后血清进行间接ELISA检测,发现高、低剂量免疫小鼠均能产生针对VP5蛋白的特异性抗体。用灭活BTV-1进行DOT-ELISA检测,发现其能与VP5蛋白免疫的小鼠血清发生特异性反应,说明利用大肠杆菌表达的重组蛋白VP5具有良好的免疫特性,这为进一步开展BTV相关研究奠定了基础。     

蓝舌病I型病毒VP5蛋白的表达纯化及免疫原性分析

为分析蓝舌病I型病毒（BTV-1）VP5蛋白的免疫原性，本研究构建了载体PET-28a-VP5并转化BL21（DE3），然后进行IPTG诱导表达，以及SDS-PAGE和Western-blot分析。结果显示，重组VP5蛋白相对分子质量约为62 kDa，与预期结果一致。进一步优化条件，发现IPTG为0.2 mmol/L、温度为25 ℃、诱导6 h时，重组蛋白在上清中表达量最高，通过Ni柱纯化获得的重组蛋白纯度约为75%。将纯化后的重组蛋白VP5分别以40 μg/只和20 μg/只免疫Balb/c小鼠，同时设置PBS为阴性对照，对三免后血清进行间接ELISA检测，发现高、低剂量免疫小鼠均能产生针对VP5蛋白的特异性抗体。用灭活BTV-1进行DOT-ELISA检测，发现其能与VP5蛋白免疫的小鼠血清发生特异性反应，说明利用大肠杆菌表达的重组蛋白VP5具有良好的免疫特性，这为进一步开展BTV相关研究奠定了基础。     

牛痘病毒携带的外源抗原通过胞内成熟病毒粒子表面展示增强免疫应答

牛痘病毒(VACV)是天花疫苗,且常作为疫苗载体用于治疗感染性疾病和癌症。由活VACV疫苗诱导的抗体大多作用于病毒粒子的结构蛋白,包括胞内成熟病毒粒子(MV)的膜蛋白。本研究结果表明,VACA表达的外源性抗原可通过与MV膜蛋白结合而增强其抗体反应。本研究构建了3种表达鼠疫耶尔森氏杆菌保护性抗原LcrV的重组VACV:①未经修饰的LcrV;②与信号肽融合的LcrV;③与VACV D8蛋白跨膜结构域融合的LcrV(LcrV-TM)。电镜结果显示,LcrV-TM可展示于MV的表面;而且与表达LcrV的其它两种重组病毒相比,表达LcrV-TM的VACV在小鼠体内诱导出的抗LcrV抗体效价显著升高。只有由表达LcrV-TM的VACV免疫的小鼠能够对致死性鼠疫耶尔森氏杆菌和VACV WR株产生保护。VACV载体表达的抗原可通过与D8跨膜结构域融合来增强其免疫应答。重组病毒为天花和鼠疫疫苗的研究和发展奠定了基础。