H9N2亚型禽流感病毒NS1基因的原核与真核表达

【目的】构建H9N2亚型禽流感病毒(AIV)NS1基因的原核和真核表达载体,将其分别在大肠杆菌和293细胞中进行表达,为进一步研究NS1蛋白的功能及其与宿主的相互作用,以及鉴定禽流感疫苗免疫禽和野毒感染禽ELISA诊断试剂盒的制备提供理论依据。【方法】用RT-PCR方法扩增H9N2亚型AIV的NS1基因,将其定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)中构建NS1基因的原核重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达;同时,将NS1基因克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,构建NS1基因真核重组质粒,将其瞬时转染293细胞,48h后收集感染细胞,对大肠杆菌表达产物和293细胞表达产物进行Western-blotting分析。【结果】成功构建了NS1基因的原核表达载体pET-32a-NS1和真核表达载体pEGFP-C1-NS1。Western-blotting结果表明,大肠杆菌和293细胞的表达产物均能检测到特异性条带(大肠杆菌的表达产物在约44ku处出现阳性条带,293细胞表达产物在约55ku处出现特异条带)。【结论】NS1基因在大肠杆菌和293细胞中得到成功表达,获得的NS1蛋白具有良好的抗原活性。     

H1亚型猪流感病毒广东株HA基因的原核表达

为了研制猪流感检测试剂和流感亚型特异性单抗筛选所需的重组抗原,本研究克隆和原核表达了H1N1亚型猪流感病毒的血凝素(hemagglutinin,HA)基因.首先采用RT-PCR方法扩增了H1亚型猪流感病毒(SIV)广东株的HA基因.测序结果表明,扩增的SIV HA基因cDNA长度为 1 701 个核苷酸,共编码566个氨基酸.BLAST分析表明,H1N1亚型SIV广东株HA基因核苷酸序列与GenBank中已发表的中国香港特别行政区、中国大陆、美国分离的经典H1亚型毒株相近,核苷酸序列同源性在89%以上.然后将HA基因的cDNA片段亚克隆至pET32a( )表达载体中,构建重组质粒pET32a-H1,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达.SDS-PAGE和凝胶扫描分析表明,HA基因在大肠杆菌中获得了高效表达,重组融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的25.2%.经免疫印迹证实重组蛋白可以被SIV特异性抗体所识别.     

小鼠Klf4基因的原核表达研究

[目的]对小鼠Klf4基因重组蛋白进行原核表达分析。[方法]利用双酶切从重组质粒p MXs-Klf4上回收小鼠Klf4基因片段,克隆入p ET-41a(+)载体后转化BL21大肠杆菌,用IPTG诱导表达,探讨诱导表达最佳浓度和时间,最后采用SDS-PAGE对重组蛋白进行鉴定及分析。[结果]重组质粒Klf4-p ET-41a(+)在IPTG诱导下可表达与预期相符的约为51 ku的KLF4蛋白;经IPTG刺激后重组蛋白表达增多,以0.8 mmol/L IPTG诱导6 h为佳;重组蛋白以包涵体形式存在于大肠杆菌BL21中。[结论]小鼠Klf4基因可在原核细胞中表达。     

红鳍东方鲀白介素15的原核表达及其活性测定

为了开发红鳍东方鲀Takifugu rubripes免疫基因及其重组表达,生产重组免疫因子蛋白,通过提取红鳍东方鲀肾脏组织总RNA,利用RT-PCR技术扩增得到白介素15(interleukin15,IL15)基因序列,将IL15成熟肽序列与原核表达载体p ET-32a(+)连接,成功构建重组表达载体(重组子)p ET-32a(+)-IL15,并将其重组子转化至Escheria coli BL21(DE3)感受态细胞中获得重组表达IL15的基因工程菌,再经IPTG诱导,p ET-32a(+)-IL15在BL21中得到了融合表达。结果表明:通过对表达产物的纯化和Western Blotting检测,红鳍东方鲀IL15在大肠杆菌中的表达量较高,蛋白浓度为294.6μg/m L;用MTT法对该蛋白进行活性鉴定显示,加入稀释10倍和100倍的重组红鳍东方鲀IL15蛋白时,CTLL-2细胞的增殖率相对较高,分别为71%和73%。研究表明,重组红鳍东方鲀IL15蛋白具有体外促进CTLL-2细胞增值的能力。     

H9N2亚型禽流感病毒NS1蛋白原核表达载体的构建及表达

为对H9N2亚型禽流感病毒(AIVs)NS1基因进行原核表达,并对表达产物进行抗原性分析,根据NS1基因合成1对特异性引物,进行PCR扩增,将扩增片段连接至PMD18-T载体,通过序列测定和比对筛选出保真基因克隆;将保真基因克隆至pET32a表达载体,构建重组质粒pET32a-NS1后转化至大肠杆菌BL21(DE3)中...     

H5N1亚型禽流感病HA1基因的克隆测序与表达

提取禽流感病毒液中RNA,根据GenBank中收录的禽流感病毒(AIV)H5N1亚型的血凝素(HA)基因序列设计并合成了1对引物。RT-PCR扩增出HA全基因,并克隆到pMD18-T载体,对重组质粒进行酶切鉴定及序列测定。与GenBank收录的其他AIV H5N1亚型的HA基因进行序列比较分析,同源性达96%~99%。从HA基因序列中截取HA1基因,亚克隆到表达质粒pET-28a中构建HA1基因原核表达质粒,转化E.coliBL21(DE3)细胞,在IPTG诱导下表达出HA1蛋白,所表达的蛋白质分子质量约为37~40ku。该研究为进一步开发用于禽流感抗体检测的抗原蛋白打下了基础。     

牛SPAG11D基因的原核表达及其抑菌活性研究

为了检测重组蛋白SPAG11D的抑菌活性,提取牛睾丸组织总RNA,经RT-PCR扩增了SPAG11D基因,将该基因插入p ET-32a(+)融合表达载体,并转入BL21(D3)进行原核表达,通过改变IPTG浓度和诱导时间优化表达条件,并用琼脂扩散法测定重组蛋白体外抑菌活性。结果显示,成功扩增牛SPAG11D基因,产物大小为390 bp,其序列与Gen Bank公布序列相一致;正确构建了原核表达载体p ET-32a(+)-SPAG11D,重组蛋白最佳表达条件为IPTG终浓度1.0 mmol/L、诱导时间为4 h;表达产物的分子质量约为33 k Da;该重组蛋白对霍乱弧菌具有明显的体外抑菌活性。本研究成功构建了牛SPAG11D基因的原核表达载体,并获得了具有抑菌活性的重组蛋白His-SPAG11D。     

刺参C型凝集素(AJL)基因的克隆及原核表达分析

为了开发海参免疫基因,生产重组免疫因子蛋白,利用cDNA末端快速扩增技术(Rapid-amplification of cDNA ends,RACE)获得了刺参凝集素基因(Apostichopus japonicus Lectin,AJL)的编码区序列(Coding sequence,CDS),CDS的长度为492 bp,编码163个氨基酸,其中成熟肽由143个氨基酸组成。将成熟肽的基因克隆并连接至载体p ET-32a(+)中,成功构建了原核表达的重组体p ET-32a(+)-AJL,进一步将重组体转化至大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中,经诱导表达、分离纯化,获得了融合表达蛋白。本研究结果为进一步研究重组刺参C型凝集素在刺参健康养殖上的应用奠定了基础。     

粪肠球菌Ace抗原表位预测及重组表位 疫苗载体构建与表达

利用生物信息学软件预测抗原表位,然后将筛选出的6个抗原表位基因片段分别与铁蛋白H亚基基因片段连接,并克隆到p ET-32a表达载体中,构建能融合表达Ace抗原表位和铁蛋白H亚基的重组质粒p ET-32aace1、p ET-32a-ace2、p ET-32a-ace3、p ET-32a-ace4、p ET-32a-ace5、p ET-32a-ace6,并经测序验证;优化诱导条件获得原核表达的重组蛋白后,用SDS-PAGE和Western Blot验证其相对分子质量大小和免疫原性;将重组蛋白进行纯化超滤,然后进行透射电镜成像检查。结果显示,本研究成功构建了7种原核表达载体;在IPTG诱导下获得了5种可溶性表达的融合蛋白,且均有较强的免疫原性;重组融合蛋白Ace1-H、Ace3-H、Ace5-H和Ace6-H在透射电镜下观察到了具有与天然铁蛋白类似的特殊中空结构,且其直径与天然铁蛋白纳米笼类似;而带多表位的重组蛋白Ace-H虽然也能自组装成纳米级颗粒,但没有中空核心,其直径也比天然铁蛋白略大。     

绿色荧光蛋白基因原核表达质粒pET32a-AcGFP1的构建及其在大肠杆菌中的高效表达

 为了构建绿色荧光蛋白AcGFP1基因的原核表达载体pET32a AcGFP1,并诱导使其在大肠杆菌中高效表达,本研究以pIRES AcGFP1质粒为模板,采用PCR技术特异性扩增绿色荧光蛋白AcGFP1基因,通过酶切和连接使其与原核表达载体pET32a（+）构成重组子,经PCR、酶切和测序鉴定后,重组质粒转化大肠杆菌Rosetta（DE3）,用不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达绿色荧光蛋白,经15% SDS PAGE鉴定,结果显示：重组质粒pET32a AcGFP1中的AcGFP1序列与Clontech公司的pIRES AcGFP1质粒的AcGFP1序列完全一致,表明本实验已成功构建了含有绿色荧光蛋白基因AcGFP1的原核表达质粒。此外,pET32a AcGFP1转化Rosetta（DE3）,经不同浓度的IPTG诱导,SDS PAGE检测均获得高效表达,为今后构建pET32a(+) TAT AcGFP1融合表达载体以及深入研究TAT的细胞膜穿透作用的机制奠定基础。     

副猪嗜血杆菌hhdA克隆、抗原表位预测和表达

根据Gen Bank中的副猪嗜血杆菌hhd A的基因序列,设计并合成l对特异性引物,对从江西分离的HPS的hhd A基因进行扩增、克隆、测序、生物信息学分析和原核表达。测序结果表明,扩增的目的基因大小为1 797bp,共编码氨基酸599个氨基酸。与Gen Bank上公布的ZJ0906株(CP005384.1)中对应的核苷酸序列同源性为99.8%,氨基酸同源性99.6%。生物信息学分析表明,HPS hhd A蛋白是一种混合型结构蛋白,含有α-螺旋、β-折叠、β转角和无规则卷曲;综合柔性区域、亲水性位点、抗原指数和表面可能位点预测了hhd A蛋白可能的B细胞抗原表位的优势表位。将目的基因转入原核表达载体p ET-32a(+)构建重组原核表达质粒p ET-32a(+)-hhd A,将重组质粒转化到BL21(DE3)中,进行IPTG诱导表达,经过SDS-PAGE电泳结果显示表达的融合蛋白约80 k D。为进一步研究HPS hhd A生物学功能及抗体制备和开发hhd A基因工程产品奠定了基础。     

斑马鱼p53基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

利用原核表达系统克隆表达斑马鱼p53基因。RT-PCR法从斑马鱼胚胎中扩增获得p53基因编码区,并将其克隆至原核表达载体pET28a上,构建重组质粒pET28a/z-p53,将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)受体菌,IPTG诱导表达,表达产物经镍柱纯化、尿素透析复性,SDS-PAGE电泳分析,结果表明,p53基因在大肠杆菌中成功表达,表达的p53融合蛋白分子量大约为53kD,透析复性后获得了高纯度可溶性的p53蛋白。     

类人胶原蛋白基因COL6A2的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank上查到的人胶原蛋白序列COL6A2(NM058175.2),利用Primer 5设计特异性引物,以吉林农业大学生物物理实验室构建的重组质粒pCMV-Sport6-COL6A2为模板进行目的基因的克隆,获得目的基因COL6A2,然后用双酶切的方法连接目的基因COL6A2和表达载体pET32a,将连接产物转化到大肠杆菌中构建原核表达载体pET32a-COL6A2。再将鉴定成功的重组质粒pET32a-COL6A2分别转化到大肠杆菌BL21、BL21(DE3)、BL21(BE3)plysS及Rosetta(DE3)中,采用1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,经12%SDS-PAGE电泳分析并筛选出重组蛋白表达量最高的菌株。利用Ni Sepharose 6 FastFlow琼脂糖树脂亲和层析柱纯化重组蛋白。结果表明:获得了大小为570 bp的COL6A2片段,经测序鉴定序列正确;成功构建了pET32a-COL6A2原核表达载体并表达出约30 kD的目的蛋白;筛选出BL21(DE3)作为高效表达菌株,其重组蛋白表达量占菌体总蛋白的23.9%;经镍离子亲和层析纯化获得了纯度90%的目的蛋白。     

番鸭细小病毒VP3基因的原核表达及鉴定

[目的]使番鸭细小病毒(DPV)VP3在原核表达系统中正确表达.[方法]根据番鸭细小病毒VP3基因序列,设计一对特异性引物,利用PCR技术扩增出VP3基因;将其克隆至原核表达载体p ET-32a,获得重组表达载体p ET-32a-VP3.将重组质粒转化感受态细胞BL21(DE3),经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测重组蛋白.[结果]成功表达出与预期大小相符的重组蛋白,约89 k Da;且当IPTG浓度为1.2 mmol/L,诱导时间为6 h时蛋白表达量最大.[结论]该研究通过原核表达系统成功表达了DPV、VP3蛋白,并摸索了蛋白最佳表达条件.     

番茄黄化曲叶病毒CP基因的原核表达载体构建选择

[目的]筛选出目的蛋白能够高效表达的重组质粒。[方法]利用原核表达载体pET-32a(+)和pET-28a(+)成功构建了番茄黄化曲叶病毒(Tomato Yellow Leaf Curl Virus,TYLCV)外壳蛋白(Coat Protein,CP)基因的重组质粒p32a-CP和p28a-CP,并通过PCR和双酶切鉴定了序列连接的正确性;再分别将2个载体转化至BL21(DE3)中,采用不同浓度的IPTG对其进行诱导表达,并进行SDS-PAGE电泳检测。[结果]测序结果显示TYLCV-CP基因已定向插入p32a-CP和p28a-CP中;SDS-PAGE电泳结果显示分子量约为50 kD的目的蛋白在重组载体p32a-CP中得到了高效表达,而在重组载体p28a-CP中未表达。[结论]为下一步的抗体制备及TYLCV的免疫学检测奠定了基础。     

H5亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及在原核细胞中的表达

以RT-PCR方法从H5N1亚型禽流感病毒A/DKZJ/12/00(H5N1)中获得禽流感病毒NS1的部分基因,将目的基因定向克隆到原核表达载体pET-32a,将测序和酶切验证正确的阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,蛋白质电泳表明该蛋白得到了可溶性的表达,表达蛋白的分子量27 kD;Western-blot分析表明,该蛋白可以与禽流感H5阳性血清反应,具有良好的免疫原性.     

红鳍东方鲀去乙酰化酶SIRT3基因的克隆及原核表达

从红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)肝脏组织中提取总RNA,通过RT–PCR扩增,获得SIRT3基因的编码阅读框(ORF),用原核表达载体p ET32a(+)构建p ET32a/SIRT3重组质粒,用异丙基–β–D–硫代半乳糖苷(IPTG)将重组质粒p ET32a/STRT3在大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达,并用镍柱纯化融合表达蛋白。结果显示,红鳍东方鲀SIRT3基因(tr SIRT3)ORF区大小为1 263 bp大小,编码420个氨基酸。经IPTG诱导表达后,获得1个带组氨酸(His)标签的融合蛋白,目的蛋白主要存在于上清溶液中,为可溶性表达。用镍离子亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,获得了相对分子质量约66 000的重组蛋白。     

二斑叶螨几丁质酶基因的原核表达及多克隆抗体制备

以制备的二斑叶螨c DNA为模板,克隆二斑叶螨几丁质酶Se Chi基因功能结构域催化区片段,大小为786 bp。将该序列片段克隆到表达载体p ET-32a(+)中,获得多克隆原核表达载体p ET-32a-Tu Chi。重组质粒经酶切测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),经0.6 mmol·L-1IPTG诱导4 h后高效表达约45 ku可溶性重组蛋白;经His亲和层析洗脱和浓缩获得高纯度的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备Tu Chi多克隆抗体。制备的多克隆抗体经Western Blot证实能特异性地识别几丁质酶而不与非特异性蛋白结合。ELISA分析表明制备的抗体效价达1??80 000,效价较高,为进一步研究二斑叶螨几丁质酶相关功能奠定基础。     

山羊痘病毒结构蛋白P32基因的表达

将山羊痘病毒结构蛋白P32基因从重组质粒pMD-P32中亚克隆至pGEX-4T-1原核表达载体上,用构建的重组表达质粒pGEX-P32转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,1 mmol/L IPTG诱导表达,细菌裂解物经SDS-PAGE检测到分子量约为58 ku的目的蛋白,与预期的产物大小一致.Western-blotting表明该重组蛋白可被山羊痘阳性血清所识别.     

鸭瘟病毒UL6基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为制备鼠抗鸭瘟病毒(DPV)UL6基因的多克隆抗体,采用PCR方法扩增出UL6基因,连接原核表达载体p ET-32a(+),构建表达质粒p ET-UL6,并将其转化大肠杆菌BL21(DE3),于37℃经1.0 mmol/L的IPTG诱导4 h,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达情况,将目的蛋白免疫Balb/c小鼠,利用ELISA方法检测特异性抗体效价。结果显示,构建的原核表达质粒经IPTG诱导能正确表达,且表达的重组蛋白能与DPV阳性血清反应,制备的多克隆抗体效价可达1∶16 000。表明,制备的多克隆抗体具有良好的免疫原性,可以用于UL6基因的表达检测。