H5N1亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因的表达及纯化

利用PCR方法从含禽流感病毒HA基因的质粒T-HA上扩增HA基因,再将其克隆到原核表达载体pET28a中,用E.coliBL21(DE3)原核表达,SDS-PAGE和Western-blot对表达蛋白进行鉴定。Western-blot结果表明,表达产物具有免疫学活性,蛋白的分子量约为60kD,位于包涵体中。包涵体经变性、复性处理,表达蛋白能与H5亚型AIV阳性血清特异性反应,具有良好的抗原性。ELISA检测结果表明,用此纯化蛋白作为包被抗原检测H5N1亚型AIV血凝素抗体具有良好的灵敏性。     

H6N2亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆及其序列分析

设计特异引物,采用RT-PCR技术,成功从本实验室分离、保存的H6N2禽流感病毒毒株(HB 2002)中克隆到血凝素基因(HA)序列,该克隆基因全长1 714 bp,提交GenBank,获得登录号DQ 285546.同部分H6,H5,H7,H9亚型禽流感病毒HA基因序列分析表明,该基因核酸、氨基酸序列与A/duck/Hainan/4/2004(H6N2),A/duck/Hong Kong/3600/99(H6N2)毒株有99%的相似性;分子进化分析结果显示,该基因与此2毒株亲缘关系最近.由该克隆核酸序列推导的HA蛋白共566个氨基酸,该蛋白同其他H6亚型AIV的HA蛋白有相同裂解位点序列即PQIETR↓ G,无高致病性毒株典型的裂解位点特征,因此,初步判定毒株HB 2002为低致病性禽流感病毒.     

H9N2亚型禽流感病毒河南株NP基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

【目的】克隆H9N2亚型禽流感病毒(AIV)河南株核蛋白(NP)基因,并将NP主要抗原表位区在大肠杆菌中进行表达,为禽流感基因工程诊断抗原的制备和开发奠定基础。【方法】根据GenBank公布的禽流感病毒NP基因序列设计引物,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,从H9N2亚型AIV河南株感染的鸡胚尿囊液RNA中扩增AIV河南株NP全基因,将扩增的PCR产物克隆到pGEM-T easy载体并进行测序。通过PCR和酶切方法将NP主要抗原表位区亚克隆到原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28NP,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达重组蛋白。【结果】测序结果表明,克隆的H9N2亚型AIV河南株NP基因全长为1497bp,包含1个完整读码框,编码498个氨基酸,与GenBank中不同来源、不同亚型的其他7株禽流感病毒NP基因的核苷酸同源性达到95%以上,氨基酸同源性达到98%以上。SDS-PAGE可检测到相对分子质量约为42 ku的重组蛋白。经1.0 mmol/L IPTG诱导5 h时,重组蛋白的表达量最高。Western blot分析表明,重组蛋白能够与H9亚型AIV阳性血清发生特异反应。【结论】NP基因非常保守,建立的表达系统能够表达NP蛋白且表达蛋白具有良好的免疫原性。     

H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆及原核表达

据GenBank收录的H9N2亚型禽流感病毒血凝素（HA）基因序列设计并合成引物,以H9N2亚型禽流感病毒RNA为模板,用R1PCR方法扩增了预计约1700bp的HA基因,将此扩增产物克隆进pMD18-T载体,采用限制性酶切及序列测定鉴定阳性重组克隆子结果表明HA基因长为1683bp。基于HA信号肽在表达中的负作用,研究通过基因工程手段缺失HA蛋白位于起始的信号肽的编码户列,获得了缺失HA蛋白信号肽的HA基因,将其亚克隆到pGEX-KG中,与GST融合表达。SDS-PAGE显示：融合表达的蛋白分子量乡为90kDa。     

H5亚型AIV的HA1基因与鸡IL-18成熟蛋白基因的杆状病毒共表达载体的构建

参考GenBank上发表的H5亚型禽流感(AIV)血凝素(HA)基因序列及鸡白细胞介素18成熟蛋白(mChIL-18)的cDNA基因序列,分别设计了HA1和mChIL-18的cDNA的2对引物。然后以pMD18-T-HA质粒和pGEX-mChIL-18质粒为模板,扩增出了H5亚型AIV的HA1基因和mChIL-18的cDNA片段。再以杆状病毒pFastBacTM dual为载体,将H5亚型AIV HA中的HA1基因和mChIL-18基因分别插入到双表达载体pFastBacTM dual的p10启动子(PP10)和多角体蛋白启动子(PPH)的下游,构建携带HA1基因和mChIL-18基因的重组pFastBacTM dualH-A1-mChIL-18真核表达质粒。最后将构建的真核表达质粒转座入大肠杆菌DH10Bac,为下一步进行昆虫细胞的转染奠定了基础。这个重组载体的构建为考察mChIL-18作为免疫增强剂的作用及下一步AIV疫苗的研究奠定了坚实的基础。     

H1亚型猪流感病毒广东株HA基因的原核表达

为了研制猪流感检测试剂和流感亚型特异性单抗筛选所需的重组抗原,本研究克隆和原核表达了H1N1亚型猪流感病毒的血凝素(hemagglutinin,HA)基因.首先采用RT-PCR方法扩增了H1亚型猪流感病毒(SIV)广东株的HA基因.测序结果表明,扩增的SIV HA基因cDNA长度为 1 701 个核苷酸,共编码566个氨基酸.BLAST分析表明,H1N1亚型SIV广东株HA基因核苷酸序列与GenBank中已发表的中国香港特别行政区、中国大陆、美国分离的经典H1亚型毒株相近,核苷酸序列同源性在89%以上.然后将HA基因的cDNA片段亚克隆至pET32a( )表达载体中,构建重组质粒pET32a-H1,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达.SDS-PAGE和凝胶扫描分析表明,HA基因在大肠杆菌中获得了高效表达,重组融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的25.2%.经免疫印迹证实重组蛋白可以被SIV特异性抗体所识别.     

H6N2亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆及其序列分析

设计特异引物,采用RT—PCR技术,成功从本实验室分离、保存的H6N禽流感病毒毒株（HB2002）中克隆到血凝素基因（HA）序列,该克隆基因全长1714hp,提交GenBank,获得登录号DQ285546。同部分H6,H5,H7,H9亚型禽流感病毒HA基因序列分析表明,该基因核酸、氨基酸序列与A／duck／Hainan／4／2004（H6N2）,A／duck／HongKong／3600／99（H6N2）毒株有99％的相似性;分子进化分析结果显示,该基因与此2毒株亲缘关系最近。由该克隆核酸序列推导的HA蛋白共566个氨基酸,该蛋白同其他H6亚型AIV的HA蛋白有相同裂解位点序列即PQIETR↓G,无高致病性毒株典型的裂解位点特征,因此,初步判定毒株HB2002为低致病性禽流感病毒．     

禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因在昆虫细胞中的表达

[目的]研究禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因在昆虫细胞中的表达。[方法]将禽流感病毒H5N1亚型HA基因以BamHI和NotI双酶切插入pFastBacI载体构建pFast-H5HA转移载体质粒,然后将pFast-H5HA转入含有穿梭质粒的感受态DH10Bac中发生转座作用,在含有X-gal、IPTG、庆大霉素、卡那霉素和四环素的琼脂平板上筛选白色菌落,通过连续传代4次后获得稳定的重组质粒reBac-mid-H5HA。[结果]将重组质粒reBacmid-H5HA转染Sf9昆虫细胞,获得含有禽流感病毒H5N1亚型HA基因的重组杆状病毒,经间接免疫荧光和Western-blot证实HA基因在昆虫细胞中获得表达。重组杆状病毒表达产物能够凝集鸡红细胞,并能被抗H5N1 HA单抗所抑制。[结论]重组血凝素蛋白在杆状病毒中能获得正确表达,为研制AIVH5亚型检测抗原和亚单位疫苗奠定基础。     

表达禽流感病毒血凝素基因的重组禽痘病毒的构建

 为构建表达禽流感病毒 ( AIV)血凝素 ( HA)基因的重组禽痘病毒 ,将禽痘病毒启动子LP2 EP2驱动的 H7亚型 AIV HA基因 c DNA和大肠杆菌 Lac Z基因插入禽痘病毒疫苗株 F- 0 1 7的复制非必需区。经蓝斑筛选后 ,对重组病毒又进行了 3次蚀斑克隆。以不同代次重组禽痘病毒核酸为模板 ,利用 H7亚型 AIV HA基因特异的引物进行聚合酶链式反应 ,均扩增出 1条特异的1 .7kb DNA条带。收集不同代次的重组禽痘病毒细胞培养物进行免疫斑点试验 ,均检测到 HA蛋白 ,表明 H7AIV HA在重组禽痘病毒中获得了成功表达。该重组禽痘病毒的构建为 AIV病毒活载体疫苗的研制奠定了基础     

基于荧光熔解曲线模式RT-PCR快速检测H5N1亚型禽流感病毒

针对H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的HA、NA基因保守序列设计2对引物,建立了SYBR Green Ⅰ双重荧光RT-PCR(RRT-PCR)方法,实现了同一反应管内同时检测AIV的H5和N1亚型基因.熔解曲线分析显示,H5和N1扩增片段的熔解温度分别为(795±03)℃和(833±03)℃,无引物二聚体形成,扩增产物片段大小分别为150bp和474bp,与预期大小相符,测序结果证实为H5和N1亚型基因的靶序列.该方法能从H5N1样本中检出阳性扩增信号,熔解曲线可见H5和N1双特异峰;而H5N2样本有阳性扩增,熔解曲线仅见H5单特异峰.AIV的其他HA亚型和其他病毒的RNA、DNA 无扩增信号.本法最低可检测210拷贝·μL-1和195拷贝·μL-1 H5和N1重组质粒,敏感度分别是RT-PCR的100、1 000倍.本研究建立的基于荧光熔解曲线模式RT-PCR可用于H5N1亚型AIV的检测.     

H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白在原核系统中的表达

应用带有His6尾的pET原核表达系统对禽流感病毒血凝素蛋白进行表达,将禽流感A/Turkey/Wisconsin/66(HgN2)的HA基因克隆至原核表达载体pET-30a中,经酶切、PCR扩增和测序分析确证其插入,并且阅读框正确,获得重组质粒pET30a-H9.将此重组质粒转化到宿主菌BL21中,用诱导剂异丙基硫代...     

拟南芥转录因子CBF1基因的克隆与原核表达

CBF1转录激活因子与植物的抗逆密切相关,根据GenBank中拟南芥（Arabidopsis thaliana）CBF1（C-repeat/dre binding factor 1）基因的编码区设计1对特异引物,通过RT-PCR扩增出拟南芥CBF1基因,随后亚克隆到pMD18-T载体,测序、序列分析表明与拟南芥CBF1对应区域相似性为100%。将该片段亚克隆到原核表达载体pET22b（＋）中构建原核表达质粒,转化大肠杆菌ER2566,在IPTG诱导下产生CBF1蛋白,SDS-PAGE结果表明表达的蛋白约24ku,与预期一致。     

鸡γ-干扰素基因在大肠杆菌中的表达

构建鸡γ-干扰素基因(lFN-γ)的融合表达质粒,并在原核系统表达。根据GenBank发表的鸡γ-干扰素核苷酸序列,使用prim er5设计一对特异性引物,通过RT-PCR技术从ConA诱导培养的鸡脾脏淋巴细胞中克隆出鸡γ-干扰素基因并对其进行测序。测序结果表明,鸡γ-干扰素基因全长495bp,具有一个完整的开放阅读框,编码164个氨基酸,与国外发表的序列同源性为100%。将序列连接到原核表达载体pET28 a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳分析。结果表明鸡γ-干扰素表达蛋白大小为20.8KD,并以包涵体形式表达。为鸡γ-干扰素生物制剂或疫苗佐剂的开发奠定基础。     

鸡IL-2全基因和去信号肽基因的原核表达

根据已发表的鸡白介素-2(ChIL-2)cDNA编码基因序列设计3条引物,利用RT-PCR技术从经诱导的卢氏鸡胚脾淋巴细胞中扩增出429 bp的ChIL-2全长基因cDNA和363 bp去除信号肽的ChIL-2基因cDNA.将ChIL-2全长和去信号肽的基因cDNA分别克隆到原核表达载体pET28a(+),构建原核重组表达质粒pET28a-IL-2和pET28a-△SIL-2,并分别转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE检测,在22 ku和18 ku处有2条清晰的蛋白带,相同条件下pET28a-△SIL-2表达量较高.RNAstructure软件分析表明,pET28a-IL-2的mRNA5′端序列形成了复杂且较为稳定的二级结构,不利于翻译的起始,证明信号肽序列的存在对ChIL-2基因在原核细胞中的表达有一定的影响.     

犬瘟热病毒H基因5＇端的表达纯化及抗原性分析

为了获得高纯度的犬瘟热病毒5＇端H蛋白,本研究通过参考GenBank中发表的CDVH蛋白基因序列,用Oligo6．0软件设计一对特异性引物,从犬瘟热病毒疫苗毒株CDV3和野毒株CDVSD株提取总RNA,经FIT—PCR扩增得到388bp的基因片段,将目的基因与原核表达载体pET28a（＋）连接构建了pET28a—CDV3-H5和pET28a—CDVSD-H5重组质粒,转化到大肠杆菌BL21（DE3）中进行鉴定、测序、IPTG诱导表达。重组表达载体pET28a—CDVSD—H5在大肠杆菌中成功的表达,目的重组蛋白为22kD,而pET28a—CDV3-H5未能表达。经Ni—NTA洗脱纯化后,rCDVSD—H5蛋白被成功纯化。Western blot分析表叫,表达产物能够被犬抗CDV阳性血清所识别,具有良好的抗原性。为血清学诊断方法的建立和基因工程疫苗的研究奠定基础。