慢病毒载体介导的APP695过表达SH-SY5Y细胞系的构建和鉴定

目的通过构建pLVX-APP695-PGK-Puro慢病毒载体,用以建立可以稳定过表达APP695蛋白的SH-SY5YAPP695细胞株。方法利用PCR方法扩增目的基因片段APP695,并构建pLVX-APP695-PGK-Puro慢病毒载体,鉴定后将构建好的载体与慢病毒包装系统共转染293T细胞,并以最适感染复数感染神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,筛选稳转SH-SY5Y-APP695细胞株并用PCR和Western blot鉴定稳转株细胞APP695表达。结果对pLVX-APP695-PGK-Puro载体进行酶切鉴定及DNA测序证明构建过表达APP695的重组慢病毒载体成功,PCR和Western blot显示构建的SH-SY5Y细胞稳转株成功。结论成功构建APP695基因的慢病毒载体并成功构建了SH-SY5Y-APP695细胞株,该载体可在SH-SY5Y细胞株中高水平表达APP695。     

猪ACSM3基因过表达/敲减质粒的构建

脂肪主要由甘油和脂肪酸组成，酰基辅酶A合成酶中链家族成员3（Acyl-CoA medium-chain synthetase 3，ACSM3）是脂肪酸代谢第一步反应中的关键酶。为了深入研究ACSM3基因的生物学功能，采用克隆、测序、双酶切、连接等分子生物学技术，将ACSM3基因的完整编码区连入pcDNA3.1(+)载体内，构建该基因的过表达质粒；通过生物合成技术，构建该基因的敲减质粒。然后利用体外培养的猪前体脂肪细胞，检测ACSM3基因的过表达/敲减质粒的作用效果。结果表明，成功构建了ACSM3基因的过表达质粒，该质粒的过表达效果可一直持续到转染后的第8天。从3条特异性干扰序列中筛选出1条具有显著敲减效果的序列，敲减作用可持续到转染后的第2天。本研究所构建的过表达/敲减质粒，可为后续的ACSM3基因的功能研究提供有力的技术支持。     

表达含前S的乙肝病毒表面抗原重组CHO细胞株的建立和特性检测

为建立表达含前S基因乙肝病毒表面抗原的细胞株,将笔者所在实验室构建的表达含前S基因乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的真核表达质粒共转染CHO/dhfr 细胞,通过筛选,获得可表达含前S基因乙肝病毒表面抗原的重组CHO细胞,然后进行亚克隆,用氨甲喋呤(MTX)加压选择,以 ELISA 法检测目的蛋白表达量,筛选获得稳定表达目的蛋白的细胞株,并对其进行特性鉴定.最终获得了ClO和A10两株稳定高表达含前S基因乙肝病毒表面抗原的细胞株.     

细胞色素P4503A46基因的异源表达及药物代谢活性分析

为了克隆巴马小型猪细胞色素P4503A46基因,建立P4503A46稳定表达肝癌细胞株(Hep G2-P4503A46),并探究其药物代谢活性,通过RT-PCR从肝组织中钓取基因P4503A46,将基因与真核表达载体pc DNA3.1连接并转染Hep G2细胞,经G418筛选10代,获得稳定表达重组细胞株Hep G2-P4503A46,以P4503A特异性代谢底物硝苯地平(NF)探针药物,将探针药物与重组细胞在优化的细胞浓度、药物浓度、孵育时间等条件下进行体外孵育,通过高效液相色谱仪检测其药物代谢(抑制)动力学参数,并将对照组进行比较分析。结果表明,本研究成功从人Bama小型猪肝组织克隆了P4503A46基因,并通过G418筛选,成功建立了细胞稳定表达株,其硝苯地平代谢活性显著高于阴性对照组(P0.01);因此,成功克隆、并建立了小型猪P4503A46的稳定表达细胞株(Hep G2-P4503A46),该细胞株具有显著的硝苯地平代谢活性。     

苜蓿花叶病毒复制酶(P2亚基)基因全长cDNA植物表达载体的构建

利用含有苜蓿花叶病毒中国分离株 (AIMV - Ch)复制酶 (P2 亚基 )基因编码区 5’端 c DNA (130 6 bp)的重组质粒 p AM5和编区 3’端及其非编码区 (12 34bp的重组质粒 p AM3构建了含有复制 (P2 亚基 )基因全长 c DNA及其 3’端非编码区的重组质粒 p AM35 ,并将其重组于植物表达载体 p GA6 43,构建其正链 RNA的表达载体 p GA35 ,为进一步开展转基因研究创造条件     

IPTG诱导剂对C型产气荚膜梭菌β_2毒素基因表达的影响

对已构建的含β2毒素基因重组质粒p ETXB2进行限制性核酸内切酶酶切鉴定,并用SDS-PAGE检测不同培养条件下β2毒素基因的表达情况。经酶切鉴定证实,p ETXB2重组质粒含有β2毒素基因而且阅读框架和基因序列正确。同时采用IPTG诱导剂在改变培养基的p H、培养温度、诱导剂的加入量及诱导时间4个方面对β2毒素基因表达进行调控,其最佳的表达条件是37℃,p H 7.0的培养基中,用终浓度为0.8 mmol/L IPTG诱导4 h,β2毒素蛋白的表达效果最好。     

木薯钙调蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

钙调蛋白(CaM)作为重要的抗逆信号转导蛋白,在调控木薯抗逆境和块根采后生理腐烂中起重要作用,为给快速检测木薯在不同生长环境中CaM蛋白的表达水平提供优良抗体,克隆木薯CaM基因并将目的基因插入原核表达载体,经Escherichia coli表达并纯化,用纯化的融合蛋白ACP-CaM免疫Balb/C小鼠,间接ELISA测定小鼠血清效价后,取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选能产生抗CaM单克隆抗体的杂交瘤细胞株,用Western blot、ELISA等方法对制备的单克隆抗体进行初步鉴定。Western blot分析结果显示原核表达重组质粒在E.coli中能高效表达CaM,免疫小鼠后取效价高的2#小鼠脾细胞和SP2/0细胞融合,共获得7株效价均达到106以上、能稳定分泌抗CaM抗体的细胞株,这7株单抗与淀粉磷酸化酶、His、BSA均无交叉反应,4D5株与标签蛋白ACP有交叉反应,表明其余6株均为CaM特异性抗体;抗体亚型鉴定结果显示7株单抗均为IgG型抗体。     

共刺激分子配体B7-H1基因真核表达载体和转基因细胞的构建

以PHA刺激的小鼠外周血单核细胞中抽提的总RNA为模板,通过RT-PCR技术,扩增出B7-H1基因。按常规方法克隆进pEF6V5His A载体,重组质粒经鉴定后采用脂质体法转染CHO细胞,48h后进行间接免疫荧光试验,72h后用Blasticidin进行筛选,挑选出能稳定表达B7-H1的细胞株。结果表明：成功地克隆小鼠B7-H1基因并构建了用于表达B7-H1基因的真核表达载体,经间接免疫荧光试验证明,该基因在CHO细胞中得到表达。经Western-blot检测表明筛选出的转基因细胞稳定表达了B7-H1基因。     

非洲猪瘟病毒O174L蛋白的真核表达载体构建及分子特征分析

为分析非洲猪瘟病毒O174L基因,通过同源重组方式将O174L基因连接至p RK5M-C-2×Strep载体,构建重组质粒,经PCR扩增和测序鉴定正确后,将重组质粒转染至猪小肠上皮细胞系（porcine intestinal columnar epithelial cells,IPEC-J2）中,通过免疫荧光和Western blot检测O174L蛋白的表达情况。PCR及测序结果显示,p RK5M-C-2×Strep-O174L重组质粒构建成功。免疫荧光和Western blot检测结果显示,O174L蛋白能够在IPEC-J2细胞中稳定表达。生物信息学分析结果显示,基于O174L基因和B646L(p72)基因序列构建各分离毒株的2个系统发育树间排列高度相似。来自中国的16株分离株中,O174L基因序列的相似性高达96.76%～100.00%。其中,与中国爆发的其他Ⅱ型分离株相比,China/2018/Anhui XCGQ在O174L蛋白的第67、75及110位氨基酸存在差异,GZ201801在第110位氨基酸存在差异。Ⅰ型分离株SD/DY-I/2021和HeN/ZZ-P1/2021的O...     

Pokemon敲减对结肠癌Lovo细胞周期、迁移和侵袭能力的影响

目的观察Pokemon敲减对结肠癌Lovo细胞周期、迁移和侵袭能力的影响。方法转染shRNA质粒构建Pokemon敲减的稳定细胞株Lovo-KD和阴性对照细胞株Lovo-NC,用荧光定量PCR检测Pokemon基因敲减效率,流式细胞术检测细胞周期变化,Transwell实验观察细胞迁移和侵袭能力。结果与Lovo-NC细胞比较,Lovo-KD细胞Pokemon mRNA水平下降65.0%（P〈0.01）,G1期细胞比例升高[（56.7±0.8）%vs（26.7±1.6）%,P〈0.01],迁移细胞数[（8±4）vs（189±19）个/视野,P〈0.01]和侵袭细胞数[（6±3）vs（183±13）个/视野,P〈0.01]减少。结论 Pokemon基因敲减可将Lovo细胞阻滞于G1期,使细胞迁移和侵袭能力显著下降。     

慢病毒介导的CRISPR/Cas9敲除TGF-β1基因对鹿茸软骨细胞增殖的影响

为探究TGF-β1基因在鹿茸快速生长期的作用,利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术,设计并构建3条靶向梅花鹿TGF-β1基因第1外显子的gRNA寡核苷酸序列,在人胚肾细胞293T内进行慢病毒包装,通过neo抗性筛选稳转细胞株。提取稳转细胞株总蛋白,经BCA法测定总蛋白质量浓度,Western Blot检测TGF-β1蛋白的相对表达水平;MTT法检测TGF-β1基因敲除对鹿茸软骨细胞体外增殖的影响。结果表明:成功构建了靶向梅花鹿TGF-β1的CRISPR/Cas9基因敲除载体p BOBI-gRNA2。TGF-β1基因的缺失抑制了鹿茸软骨细胞的体外增殖。     

慢病毒介导稳定表达 Cas9 蛋白的鸡成纤维细胞系构建及其活性验证

【目的】筛选稳定表达 Cas9 蛋白的鸡成纤维细胞系（DF-1）,并基于单链退火修复机制（Single Strand Annealing, SSA）的报告载体系统,检测 DF-1 细胞系中的 Cas9 核酸酶活性。【方法】将携带 Cas9 蛋白的慢病毒载体质粒与辅助质粒一起转染 293T 细胞包装慢病毒,收集慢病毒 Cas9 上清液感染 DF-1 细胞,经抗生素筛选得到稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞,分别用 PCR 和 Western blot 验证阳性 DF-1 细胞表达 Cas9 蛋白的情况;选择鸡卵清白蛋白（OVA）基因的 sgRNA 序列,将 sgRNA 退火产物克隆至 pYP152 构建 sgRNA 表达载体,并在 sgRNA 靶位点两端设计引物扩增 OVA 基因靶片段,将靶片段克隆至报告载体 pCMV-SSA-mCherry-Hind Ⅲ,以破坏 mCherry 蛋白的表达,之后再将 sgRNA 表达载体与 SSA 报告载体共同转染稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞,最后在荧光显微镜下分析不同稳转株对 mCherry 蛋白表达的修复情况。【结果】经抗生素筛选得到 27 株稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞系,采用 PCR 扩增稳转细胞基因组,结果显示这些细胞具有 Cas9 蛋白基因序列,Western blots 试验结果显示上述稳转细胞株均表达 Cas9 蛋白;sgRNA 表达载体与 mCherry-SSA 报告载体共转后,通过荧光显微镜观察发现筛选到的稳转细胞株均可恢复报告载体中 mCherry 蛋白的表达。【结论】成功构建了具有切割活性的稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞系,可为后续在稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞系上开展鸡相关功能基因研究提供基础材料。     

表达PRRSV GP2a/GP2b、GP3、GP4、GP5和M蛋白重组腺病毒的构建

以PRRSV FJ-1a株为模板,采用RT-PCR法分别扩增出GP2a/GP2b-3、GP3、GP4、GP5和M蛋白基因片段,双酶切后插入穿梭质粒pDC316.利用AdMaxTM法,将5个重组穿梭质粒分别与腺病毒辅助质粒共转染293细胞,得到重组腺病毒Ad-GP2a/GP2b-3、Ad-GP3、Ad-GP4、Ad-GP5和Ad-M.重组腺病毒滴度为107.7～109.0TCID50·mL-1,而以Ad-GP5滴度最低,仅为107.7TCID50·mL-1.PCR检测第3、6、9代重组腺病毒稳定性,确证重组病毒均能稳定携带目的基因.对目的基因转录的RT-PCR鉴定结果显示,重组腺病毒分别感染293细胞后能转录产生目的基因mRNA.表达PRRSV主要囊膜蛋白基因重组腺病毒的获得,为进一步研制PRRSV基因工程疫苗,解析主要囊膜蛋白功能奠定基础.     

利用CRISPR/Cas9系统构建猪PFKM基因定点突变细胞株

肌型磷酸果糖激酶(PFKM)是作用于果糖-6-磷酸生成果糖-1,6-双磷酸的关键调节酶,在机体葡萄糖代谢、肌肉发育等多个生物过程中起关键作用。根据猪PFKM序列结构特点设计sgRNA序列并构建CRISPR/Cas9基因敲除质粒。敲除质粒转染猪PK15细胞并经嘌呤霉素筛选,极限稀释法筛选出单细胞克隆,提取各个细胞克隆DNA,利用PCR扩增敲除区域序列,通过序列测定确定是否敲除成功,利用实时荧光定量PCR及Western blot分别检测PFKM mRNA及蛋白质表达水平。结果表明:转染CRISPR/Cas9基因敲除质粒筛选到的单细胞克隆中,有2株细胞PFKM基因序列发生基因突变,其中1个克隆为碱基插入,另1个为碱基插入、替换及缺失; qRT-PCR定量检测结果表明,筛选到1株细胞PFKM mRNA表达量下降89.41%,差异极显著。Western blot检测结果表明,与正常细胞组相比, 2组敲除细胞株中PFKM蛋白表达量分别下降78.77%、81.63%,差异显著。这一研究显示利用CRISPR/Cas9系统成功获得了2株PFKM基因敲除细胞株,为后续研究PFKM基因在猪肌肉发育、能量代谢及线粒体功能等方面的作用奠定了基础。     

猪圆环病毒2型Cap基因的克隆与原核表达

利用PCV2鄂州株的基因序列设计特异性引物,分别在上、下游引物中加入Sac I和Hind III酶切位点,扩增出PCV2鄂州株的ORF2基因;将该片段克隆至p ET-28a原核表达载体,经PCR、酶切鉴定,成功构建了阳性重组表达质粒p ET-ORF2。将其转入大肠杆菌Rosetta中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析确定重组蛋白大小为34.5 k D,主要以包涵体的形式表达。优化后确定最佳诱导条件为:37℃,至OD值0.4⁰.6时加入终浓度为1 mmol/L的IPTG,诱导5 h。表达产物经His-tag镍柱纯化后进行Western-blot分析,结果表明表达的重组蛋白能够与PCV2标准阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应原性。     

抗全蚀病的转PvPGIP2-TaLTP5双价基因小麦的创制及鉴定

【目的】全蚀病是小麦的毁灭性病害。创制转PvPGIP2和TaLTP5双价基因小麦,分析外源PvPGIP2和TaLTP5在转基因小麦中的遗传与表达情况,选育抗全蚀病的转基因小麦新种质。【方法】采用基因重组技术构建了PvPGIP2和TaLTP5双价表达转基因载体pA25-PvPGIP2-TaLTP5,利用基因枪介导法将该载体转入小麦品种扬麦18,采用PCR、RT-PCR与qRT-PCR方法分析转基因小麦T0—T4植株中目的基因及其表达量,并对T3和T4逐株进行全蚀病接种与抗性鉴定。【结果】创制并选育出稳定的抗全蚀病转PvPGIP2和TaLTP5小麦株系6个。PvPGIP2和TaLTP5能够在这6个转基因小麦株系中稳定遗传,并高水平表达。对转PvPGIP2和TaLTP5小麦的全蚀病抗性鉴定结果表明,与受体扬麦18相比,转PvPGIP2和TaLTP5小麦对全蚀病抗性明显提高。【结论】创制了转PvPGIP2和TaLTP5抗全蚀病的小麦新种质,其对全蚀病具有一定的抗性。     

鸭源新城疫病毒HN蛋白单克隆抗体的制备及与不同分离株的反应性

为了制备鸭源新城疫病毒基因Ⅶ型毒株HN蛋白的单克隆抗体,将构建的原核表达载体p ET28(a)-HN转化BL21(DE3)进行原核表达,纯化HN重组蛋白,并免疫6周龄BALB/c小鼠,分离脾淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合,克隆培养并筛选杂交瘤细胞株,制备单克隆抗体,并对其生物学特性进行了鉴定。结果显示,表达纯化的重组HN蛋白分子质量约为49 ku,用ELISA方法成功筛选出4株针对新城疫Ⅶ型毒株HN蛋白的单克隆抗体,其中2H7抗体抗原谱较广,具有中和活性,为进一步研究HN蛋白功能和临床诊断奠定了基础。     

生长抑素基因疫苗pES/2SS的构建与表达

为了获得安全性较好的生长抑素(SS)基因疫苗,采用PCR扩增pcS/SS中的SS基因,将其融合到pUSS/S质粒S基因后,构建pUS/2SS质粒;然后将S/2SS融合基因亚克隆到pEGFP-N_1中,得到S/2SS融合表达质粒pES/2SS。酶切和测序鉴定表明:重组质粒pES/2SS构建成功。将pES/2SS转染HeLa细胞,用ELISA检测表达的融合蛋白可与SS抗体特异性结合;将pES/2SS免疫10只大鼠(每只100μg)后,5只大鼠产生抗SS抗体,而对照组未检出SS抗体。结果证明,所构建的质粒pES/2SS可在真核细胞中表达生长抑素,用于免疫可产生抗SS特异性抗体。     

单核细胞增生性李斯特菌iap基因的原核表达

该研究利用自行设计的引物通过PCR方法扩增出单核细胞增生性李斯特菌 Listeria monocytogenes C5305 株的iap基因,在iap基因的5'端和3'端分别引入EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ 2 个酶切位点并将其克隆到pET-28a表达载体上,经PCR鉴定、酶切鉴定和核苷酸序列测定后获得重组质粒 pET-28a-iap,将该重组质粒转化人大肠杆菌BL21 (DE3)pLysS,经1 mmol/LIPTG诱导4～6 h后,通过SDS-PAGE及Western-blotting鉴定,证明该基因得到表达,表达产物相对分子质量约为60 000,以可溶形式存在.     

鸡新城疫病毒(NDV)HN蛋白基因核酸疫苗的构建与血凝活性测定

将NDV弱毒株长春株表面糖蛋白HNcc基因和强毒株四平株HNsp分别插入到核酸疫苗质粒pIRES1中 ,置于CMV启动子的调控之下 ,构建成核酸疫苗表达质粒pIRHNC 及pIRHNS。经酶切鉴定插入正确后 ,用脂质体法转染BHK细胞 ,并于转染后 2 4h、4 8h、72h和 96h收获细胞 ,同时用G4 18进行筛选 ,待筛选细胞长成单层后收获一次细胞。取细胞裂解液检测其血凝活性。通过血凝试验表明两核酸疫苗质粒中的HN蛋白基因均获得表达并具有类似与天然蛋白的蛋白活性 ,且G4 18筛选后表达量高于筛选前的表达量 ,HNC活性略高于HNS。