利用BSMV-VIGS技术快速分析小麦TNBL1基因的抗黄矮病功能

小麦黄矮病是由蚜虫介导的大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus, BYDV)侵染引起的小麦重要病害之一。利用cDNA-AFLP分析，筛选出在抗黄矮病小麦易位系YW642中特异表达的长度为292 bp的 cDNA片段，以此片段为启始序列，利用RACE和RT-PCR技术克隆出该基因的全长cDNA序列，推导该基因编码1个NBS-LRR蛋白，将其命名为TNBL1。本研究利用大麦条纹花叶病毒(BSMV)诱导的基因沉默(virus-inducing gene silencing, VIGS)技术，快速分析TNBL1是否参与小麦抗黄矮病反应。通过PCR添加酶切位点、定向酶切与连接，将TNBL1特异的292bp片段反向整合到BSMV-γ链的多克隆位点上，获得重组载体BSMV-γ: TNBL1as，体外转录BSMV-VIGS载体的3个组分(BSMV-TNBL1as、BSMV-α和BSMV-β)，等量混合、摩擦接种到抗黄矮病的小麦易位系YW642幼苗叶片上，使YW642中TNBL1基因沉默，然后接种BYDV病原进行黄矮病抗性鉴定。结果表明，TNBL1基因沉默后的YW642对BYDV敏感、显现感病症状，其体内BYDV含量较未发生基因沉默的YW642中的明显增加，证明TNBL1基因是正向调控小麦抗BYDV反应的1个重要基因。     

病原诱导的中间偃麦草ERF转录因子基因的克隆及其表达特性

应用RT-PCR、RACE技术，从病原诱导的中间偃麦草叶片cDNA中，分离出1个编码ERF基因的全长cDNA序列，该基因暂命名为TiERF1a，编码由292个氨基酸组成的蛋白质，具有ERF转录因子典型的结构，即保守的AP2/ERF DNA 结合域、核定位位点和酸性激活区。TiERF1a的氨基酸序列与一个水稻ERF蛋白OsBIERF3具有66%的同源性，与拟南芥AtERF1同源性仅39.7%，为植物ERF转录因子家族B3亚群的一个新成员。表达分析结果表明，纹枯病菌、赤霉病菌侵染可诱导TiERF1a基因的上调表达，与防卫相关的激素乙烯、茉莉酸也可诱导该基因上调表达，且TiERF1a对外源乙烯、茉莉酸的响应时期早于对纹枯病菌、赤霉病菌响应时期，说明TiERF1a可能通过乙烯、茉莉酸信号途径参与寄主调控对纹枯病菌、赤霉病菌的防御反应。     

用于PCR分析的小麦种子DNA微量快速提取

探索了不用液氮从小麦单粒、半粒有胚和半粒无胚中提取DNA的方法。结果表明，无论是单粒、半粒有胚和半粒无胚都能得到比较理想的DNA，DNA样品经SCAR-PCR特异标记检测，都能扩增出两条完全相同的特异务带。用无胚的半粒进行分子标记检测特别适合于对大批量早代材料目的基因的筛选。     

源于叙利亚小麦ICA31抗条锈病基因分析及分子标记研究

遗传分析表明,小麦材料ICA31携带一个显性抗条锈病基因,对流行的优势条锈菌小种条中30,31,32免疫;据等位性测定,ICA31抗条锈基因与已知抗锈基因Yr5、Yr10、Yr15不等位;从抗源的系谱分析,该基因来源于叙利亚普通小麦品系叙18;利用微卫星标记和分组分析(BSA)法,筛选到与该抗条锈病基因(Yr-Syria)紧密连锁的SSR标记WMS11-193;对F2分离群体142个单株分析结果表明,该抗条锈病基因(Yr-Syria)与WMS11-193间遗传距离为2.1cM;将Yr-Syria定位于小麦1BS上;为该基因进行抗条锈小麦分子辅助育种打下基础。     

分子标记选择小麦抗白粉病基因Pm4b、Pm13和Pm21聚合体

 培育多个抗病基因聚合的小麦品种是提高其抗病广谱性和持久性的有效途径之一。利用小麦抗白粉病基因Pm4、Pm13、Pm2 1的特异PCR标记 ,对含有Pm4b、Pm13、Pm2 1的小麦品系复合杂交F2 代 4 0个植株进行检测 ,从中选择到Pm4b +Pm13+Pm2 13个基因聚合的抗病植株 11个 ,检测、选择到Pm4b +Pm13、Pm4b +Pm2 1、Pm13+Pm2 12个基因聚合的抗病植株 19个 ,为持久、广谱抗病小麦育种奠定了基础。研究还表明 ,3个独立的显性抗病基因在F2 代分离群体中的分离比例基本符合孟德尔独立分配定律 ,在小麦背景下的遗传稳定性 ,与该基因供体和普通小麦的亲缘关系密切相关 ,亲缘关系越远 ,丢失的概率越大。因此 ,在育种过程中对外源基因鉴定和跟踪非常必要     

分子标记辅助选育兼抗白粉病、条锈病、黄矮病小麦新种质

 选育和推广多抗、兼抗型小麦品种是今后小麦育种发展方向之一。本研究通过复合杂交、回交，将抗白粉病基因聚合体Pm4 +Pm13 +PmV、抗条锈病基因YrX（源自YW243）、抗黄矮病基因Bdv2向优异农艺亲本转育。利用抗病性鉴定和分子标记辅助选择，选育出聚合了3～5个抗病基因的兼抗白粉、条锈和黄矮病的冬性小麦新种质和春性小麦新种质，其中聚合Pm4 +Pm13 +PmV +YrX +Bdv2等5个抗病基因的冬性材料1株，聚合Pm4 +Pm13 +YrX +Bdv2d 的冬性、春性（BC2F3）材料分别为2株、3株，聚合Pm4 +PmV +YrX +Bdv2等4个抗病基因的冬性、春性（BC2F3）材料分别为6株和18株，聚合Pm13 +YrX +Bdv2、PmV +YrX +Bdv2等3个抗病基因的春性材料分别为7株和46株。本研究可为小麦多抗、兼抗育种提供遗传组成明确的丰富抗源和快捷的选择方法。     

植物防卫基因PvPGIP2和TaLTP4的克隆及其对小麦的转化

多聚半乳糖酸醛酶抑制蛋白和脂质转移酶蛋白是植物产生的防卫蛋白,对植物病原真菌具有防御作用。本研究利用同源基因克隆策略和RT-PCR技术,成功克隆了1个菜豆的多聚半乳糖酸醛酶抑制蛋白（PvPGIP2）编码基因和1个小麦的脂质转移蛋白（TaLTP4）编码基因;由于它们在功能上具有协同作用,我们以pAHC25为骨架构建了Pv...     

水稻几丁质酶的原核表达、复性及体外抑菌活性的研究

利用RT-PCR反应,从纹枯菌诱导的水稻叶片cDNA中克隆了1个水稻几丁质酶基因RC7的全长编码序列（ORF）。通过亚克隆方法,RC7与原核表达载体pGEX-4T-1上的GST融合,构建成GST-RC7重组蛋白的原核表达载体pGST-RC7,然后,将其转化到大肠杆菌细胞中。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导,获得了以包涵体形式高效表达的GST-RC7。经过洗涤、溶解（变性）、复性及纯化等处理,包涵体中GST-RC7得到溶解、复性和纯化。纯化的复性GST-RC7蛋白具有几丁质酶活性。对6种重要作物病原真菌进行体外抑菌活性分析的结果表明, RC7可显著抑制水稻纹枯病菌、小麦纹枯菌、小麦赤霉菌、棉花黄萎菌、烟草赤星菌的菌丝生长,说明RC7可作为上述植物病害抗性基因育种的重要基因。     

小麦幼叶DNA微量快速提取方法的改进

为满足对大批量材料进行分子标记检测的需要,以小麦幼叶为材料,探索了在液氮和无液氮条件下提取DNA方法的改进.结果表明,改进提取法Ⅰ(用液氮)中,水浴中加KCl抽提一次便可得到质量较好的DNA,且液氮用量是常规提取法的1/40～1/30;改进提取法Ⅱ(无液氮)中,水浴后加KCl比水浴前加KCl及不加KCl的RNA含量和杂质含量低,OD260/OD280比值大,DNA浓度和纯度有所提高.两种改进方法提取的DNA经琼脂糖凝胶电泳检测都能得到质量较高的DNA图谱,又经SCAR-PCR扩增均能得到2条片段大小相同的条带.     

人工合成小麦CI191抗条锈病基因的鉴定及分子标记定位

抗病性鉴定结果表明,硬粒小麦-粗山羊草人工合成小麦CI191(CPI/GEDIZ/3/GOO//JO69/CRA/4/AE.SQ629),对我国曾经或现在流行的小麦条锈菌生理小种CY28、CY29、CY30、CY31、CY32和水源11致病类型4表现免疫或近免疫。基因推导结果显示,CI191对条锈菌的反应型不同于24份已知抗条锈病基因品种(系),对21个条锈菌生理小种表现抗性,对条锈病菌生理小种86107表现感病反应型(IT3)。对CI191/铭贤169杂交组合的正交、反交的F1材料以及F2代群体进行抗病鉴定与遗传分析,结果表明,CI191对条锈菌小种CY31的抗性受细胞核内的显性单基因控制。利用集群分离分析法(BSA)和简单重复序列(SSR)分子标记分析,发现7个SSR标记与YrC191连锁。构建了包含YrC191的SSR标记遗传图谱,其中Xbarc240与YrC191共分离,Xcfd65、Xbarc187、Xgwm18、Xgwm11位于Xbarc8与YrC191的同侧,与YrC191间遗传距离3.2cM,Xbarc8与YrC191间遗传距离为1.6cM,Xwmc419位于YrC191另一侧、遗传距离为3.1cM。根据SSR分子标记的遗传图谱和在中国春的缺体-四体和双端体的定位结果,将YrC191定位到小麦染色体1BS上。YrC191基因的4个SSR标记和Yr26的1个STS标记可以明显地区分YrC191与染色体1BS上的其他抗条锈病基因,如Yr24、Yr26/YrCH42、Yr10、Yr15和YrC142等。