粗茎鳞毛蕨萃取物的体外抑菌及抗氧化活性分析

为研究粗茎鳞毛蕨萃取物的体外抑菌及抗氧化活性,选用不同极性溶剂(石油醚,乙酸乙酯,正丁醇)对粗茎鳞毛蕨乙醇粗提物进行分级萃取,并测定各相萃取物中总酚、总黄酮含量。分别采用滤纸片法、微量肉汤稀释法测定其对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑菌活性,同时采用三种体外抗氧化体系即DPPH自由基清除能力、羟自由基清除能力以及还原能力对其体外抗氧化活性进行综合评价。实验结果表明,乙酸乙酯相萃取物的总酚、总黄酮含量最高,分别为(122.63±2.64)mg/g、(98.46±1.73)mg/g。粗茎鳞毛蕨不同溶剂萃取物均具有一定的抑菌活性,其中正丁醇相萃取物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑菌直径分别为(11.75±1.36)mm、(10.50±0.68)mm、(8.37±0.81)mm;最小抑菌浓度(MIC)分别为12.50 mg/mL、25.00 mg/mL、25.00 mg/mL。粗茎鳞毛蕨不同溶剂萃取物的抗氧化能力均随浓度的增加而增大,呈一定的量效关系,其中乙酸乙酯相抗氧化能力最强,对DPPH自由基、羟自由基清除率以及还原能力的IC50值分别0.14 mg/mL、0.33 mg/mL、0.05 mg/mL。综上所述,粗茎鳞毛蕨萃取物具有开发成为天然抑菌剂及抗氧化剂的潜力,本研究将为粗茎鳞毛蕨的进一步开发利用提供理论依据。     

慢病毒介导的CRISPR/Cas9敲除TGF-β1基因对鹿茸软骨细胞增殖的影响

为探究TGF-β1基因在鹿茸快速生长期的作用,利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术,设计并构建3条靶向梅花鹿TGF-β1基因第1外显子的gRNA寡核苷酸序列,在人胚肾细胞293T内进行慢病毒包装,通过neo抗性筛选稳转细胞株。提取稳转细胞株总蛋白,经BCA法测定总蛋白质量浓度,Western Blot检测TGF-β1蛋白的相对表达水平;MTT法检测TGF-β1基因敲除对鹿茸软骨细胞体外增殖的影响。结果表明:成功构建了靶向梅花鹿TGF-β1的CRISPR/Cas9基因敲除载体p BOBI-gRNA2。TGF-β1基因的缺失抑制了鹿茸软骨细胞的体外增殖。     

梅花鹿Smad2与Smad4基因的克隆及其在鹿茸顶端组织的表达

为了从梅花鹿鹿茸顶端组织中克隆Smad2与Smad4基因的编码区(CDS)序列,分析其分子特性及在鹿茸顶端不同组织中的表达情况,试验采用TRIzol法提取鹿茸顶端组织总RNA,以PCR方法获得Smad2与Smad4基因,并利用生物信息学软件对其进行生物信息学分析,免疫组化法检测Smad2与Smad4基因在鹿茸顶端不同组织中的表达水平。结果表明:Smad2基因完整的CDS序列长度为1 404 bp,编码467个氨基酸,与牛、人、马和猪的Smad2核苷酸序列同源性分别为98.29%、94.52%、95.30%和95.51%;Smad4基因完整的CDS序列长度为1 662 bp,编码553个氨基酸,与牛、人、马和猪的Smad4核苷酸序列同源性分别为98.26%、94.89%、95.85%和95.97%;Smad2与Smad4蛋白的分子质量分别为52.24 ku与60.50 ku,理论等电点分别为6.13与6.50,均具有较强的亲水性;梅花鹿Smad2与Smad4基因在茸皮层、间充质层和软骨层中均有表达,在软骨层中表达水平较高。说明梅花鹿Smad2与Smad4基因在鹿茸软骨层中表达水平较高,对鹿茸再生发育具有一定的调节作用。     

梅花鹿VEGF基因的克隆及其在鹿茸顶端组织的表达

为了得到VEGF成熟肽基因,利用Trizol试剂法提取鹿茸顶端组织总RNA,反转录形成c DNA。根据Gen Bank已发表的相关基因序列设计1对特异性引物,并克隆VEGF成熟肽基因,再利用免疫组化法检测VEGF基因在鹿茸顶端不同组织的表达水平。结果表明:成功获得梅花鹿VEGF成熟肽基因,该基因长495 bp,共编码164个氨基酸;经Blast同源性分析,结果显示与牛、羊、猪的核苷酸序列的同源性分别为98.79%、97.98%、96.36%;经DNAMAN软件比对,其氨基酸序列的同源性分别为98.78%、97.56%、96.95%。免疫组化法结果显示,VEGF在茸皮层、间充质层和软骨层中均有表达,其中在软骨层中表达水平较高。     

梅花鹿成熟型TGF-β1基因的克隆与结构分析及其在鹿茸顶端组织中的表达

为探究细胞因子对鹿茸再生的影响,提取鹿茸顶端组织总RNA(Trizol法),反转录获得cDNA模板,克隆TGF-β1成熟肽基因。利用生物信息学软件,对其基因序列及蛋白质结构进行分析。结果表明:成功获得梅花鹿TGF-β1成熟肽基因,序列长339 bp,共编码112个氨基酸,蛋白性质稳定,理论分子质量约为12.8 kD。同源性分析结果显示,TGF-β1在进化过程中具有高度保守性,梅花鹿与牛、羊、猪、人、鼠的核苷酸序列同源性均90%;除鼠外,梅花鹿与其他物种氨基酸序列并未发生变化。免疫组化结果显示,TGF-β1在鹿茸顶端不同组织中差异表达,软骨层中表达水平最高。由此推测,TGF-β1在鹿茸再生过程中可能发挥重要作用。