GPx5基因在绵羊附睾上的时空表达特性

【目的】研究谷胱甘肽过氧化酶5(GPx5)基因在绵羊附睾及附睾不同发育时期的表达特性。【方法】采用荧光定量PCR技术、免疫印迹技术及免疫荧光等方法,分别检测GPx5基因在绵羊附睾不同发育时期、不同部位上mRNA和蛋白的表达及分布情况。【结果】荧光定量PCR结果表明,青年羊附睾GPx5基因在头部的mRNA表达量显著高于体部和尾部(P0.05);青年羊附睾头部GPx5基因mRNA表达量显著高于羔羊和老年羊附睾头部(P0.05)。免疫印迹结果表明,羔羊附睾无GPx5蛋白表达;青年羊附睾各部位均有表达,而老年羊附睾头部和体部有表达、尾部无表达。灰度分析结果表明,青年羊附睾头部GPx5相对表达量显著高于其他部位(P0.05),且青年羊附睾头部GPx5蛋白相对表达量显著高于老年羊附睾头部(P0.05)。免疫荧光结果表明,在羔羊附睾未检测到GPx5蛋白表达信号;青年羊附睾各部位均有荧光信号表达,且附睾头部和体部荧光强度明显高于尾部,并在附睾管液体中也发现有荧光信号;老年羊附睾头部和体部有荧光信号,荧光遍布于附睾管假复层上皮细胞的细胞核及细胞质中。【结论】GPx5基因mRNA在绵羊附睾不同发育时期均有表达,但在不同部位具有表达差异性;GPx5蛋白于附睾管假复层上皮细胞表达,且在性成熟前羔羊附睾及老年羊附睾尾部未表达,因此推测GPx5蛋白的表达与绵羊性发育时期有密切关联。     

不同沙棘果渣添加水平对公绵羊睾丸和附睾抗氧化性的影响

[目的]研究饲喂不同沙棘果渣添加水平的日粮对公绵羊睾丸与附睾抗氧化性的影响。[方法]选用24只5月龄,体重(25.00±1.00)kg健康的杜泊×小尾寒羊杂交公羔,随机分为4组,按照分组依次饲喂添加不同水平沙棘果渣(0%、10%、20%、30%)的日粮,试验期65d。试验结束后采集公绵羊的睾丸和附睾组织,并对组织抗氧化相关基因mRNA和蛋白的表达进行研究。[结果]睾丸组织中,30%沙棘果渣添加组GPx4 mRNA的相对表达量相较于10%添加组以及对照组显著降低(P0.05)。附睾头组织中,30%沙棘果渣添加组Cu-ZnSOD mRNA的相对表达量显著低于10%和20%沙棘果渣添加组(P0.05);30%沙棘果渣添加组GPx4 mRNA的相对表达量相较于对照组显著降低(P0.05)。附睾体组织中,30%沙棘果渣添加组CAT mRNA的相对表达量相较于10%添加组显著降低(P0.05)。附睾尾组织中,20%沙棘果渣添加组Cu-ZnSOD mRNA的相对表达量相较于30%添加组与对照组显著升高(P0.05);30%沙棘果渣添加组Cu-ZnSOD mRNA的相对表达量相较于10%添加组显著降低(P0.05)。20%沙棘果渣添加组附睾头Nrf2与附睾尾Cu-ZnSOD蛋白表达量显著高于10%和30%沙棘果渣添加组。[结论]日粮中添加10%和20%沙棘果渣可以不同程度促进公绵羊睾丸和附睾抗氧化相关基因mRNA的表达,而添加30%沙棘果渣会降低睾丸GPx4、附睾头Cu-ZnSOD和GPx4、附睾体CAT、附睾尾Cu-ZnSOD mRNA以及附睾头Nrf2和附睾尾Cu-ZnSOD蛋白的表达量。因此,25kg杜泊×小尾寒羊杂交公羔日粮中添加30%沙棘果渣为过量添加水平。     

外源雄激素促进绵羊附睾GPx5基因的表达

为研究外源雄激素丙酸睾酮对绵羊附睾特异表达基因谷胱甘肽过氧化酶5(GPx5)的影响,应用酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清和附睾头部内睾酮(T)、二氢睾酮(DHT)的含量,及附睾头部雄激素受体(AR)蛋白表达量;应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测了附睾头部GPx5-mRNA和AR-mRNA相对表达量;并结合免疫印迹(WB)法检测了附睾头部GPx5蛋白相对表达量。结果表明:丙酸睾酮处理(TPT)组与对照组相比绵羊血清DHT含量,附睾头部T含量、DHT含量均显著提高,分别是对照组的0.5、6.0、0.8倍;GPx5-mRNA和ARmRNA相对表达量显著提高,分别是对照组的0.75和0.77倍(P0.05);AR及GPx5蛋白表达量显著提高,分别是对照组的0.63和0.58(P0.05)。因此,外源雄激素丙酸睾酮可大量提高绵羊附睾头部GPx5基因的表达,对绵羊附睾头部GPx5基因的表达具有促进作用。     

神经激肽B在犬生殖轴上的表达

【目的】研究神经激肽B(NKB)在犬生殖轴上的表达规律。【方法】以仔犬期、幼犬期、初情期母犬及成年公犬、母犬为研究对象,颈动脉放血处死后取其下丘脑、垂体、睾丸和卵巢,其中成年公、母犬的样本进行NKB免疫组化试验,观察NKB分布情况并拍照;仔犬期、幼犬期、初情期和成年期母犬样本进行RT-qPCR试验,以GAPDH为内参,测定样本中目的基因Tac3 mRNA的表达量。【结果】NKB主要分布于下丘脑外侧区和视上核、腺垂体、卵巢卵泡颗粒层细胞和卵母细胞及睾丸的间质组织和生精细胞,而神经垂体中未见分布。在母犬下丘脑、垂体和卵巢中,Tac3 mRNA表达量均表现为从仔犬期至初情期逐渐上升,于初情期达最高水平,至成年期又有所下降,且与其他各发育阶段差异显著(P0.05)。【结论】NKB可能参与母犬初情期的启动。     

GPX5在成年绵羊附睾中的表达与蛋白定位

【目的】研究谷胱甘肽过氧化物酶-5（glutathione peroxidase type-5, GPX5）在成年绵羊附睾的表达特征以及GPX5蛋白在附睾中的定位,为绵羊精子在附睾中抗氧化机制的研究提供理论依据。【方法】采取年龄相近的成年蒙古绵羊的附睾、睾丸和输精管。每一只公羊的附睾分别按照附睾头、附睾体和附睾尾进行分割。样品保存于-80 ℃冰箱,采用实时荧光定量PCR和Western blotting的方法,对成年绵羊的附睾、睾丸和输精管的GPX5 表达量进行分析。将新鲜的组织样品各部分切取适合大小浸泡于4%多聚甲醛溶液中24h,按照石蜡切片的方法制做组织切片。用GPX5特异性抗体孵育组织切片,利用DAB显色试剂盒对阳性信号进行标记。【结果】实时荧光定量PCR结果显示,成年绵羊附睾头GPX5基因的表达量极显著高于附睾体和附睾尾（P＜0.01）,而在输精管和睾丸几乎不表达。Western blotting的结果显示,GPX5蛋白在成年绵羊附睾头高表达,在附睾体和附睾尾有微量蛋白存在,睾丸和输精管中未发现GPX5蛋白。这表明GPX5主要在成年绵羊附睾头表达;经过免疫组化染色分析,GPX5蛋白主要位于附睾头上皮细胞质以及静纤毛,附睾体和附睾尾中的GPX5蛋白主要集中在静纤毛。在附睾头、附睾体和附睾尾中的精子上以及附睾腔都可以观察到GPX5蛋白,表明GPX5蛋白从附睾上皮分泌到附睾腔中,随着精子在附睾中的运输与精子结合。【结论】在成年绵羊附睾中,GPX5主要由附睾头上皮细胞合成和分泌,在附睾管腔中与精子结合,为精子功能的正常发挥提供保护。     

CYP19基因在牦牛睾丸及附睾组织中的表达定位

【目的】为了探讨CYP19基因在牦牛睾丸及附睾不同部位的表达差异性.【方法】应用免疫组织化学、qRT-PCR方法、Western-blot等检测方法,研究成年牦牛睾丸及附睾头、体、尾等4个组织中CYP19基因的表达和定位.【结果】免疫组化结果显示在睾丸支持细胞、间质细胞和生殖细胞中P450arom蛋白均有较强表达,在附睾头、体、尾的上皮细胞和平滑肌细胞均有较弱表达.蛋白印迹结果显示附睾头表达最高,附睾尾、附睾体、睾丸表达依次递减(P0.05).mRNA水平结果表明睾丸中表达量最高,附睾尾、附睾头、附睾体表达依次递减(P0.01).【结论】以上结果提示CYP19基因在睾丸及附睾头、体、尾中表达有差异,这一结果为进一步研究CYP19基因对牦牛睾丸及附睾发育作用奠定了基础.     

β防御素104a在不同日龄雄性山羊睾丸与附睾中的定位及表达特性

[目的]为了研究不同发育阶段晋兰绒山羊睾丸及附睾中β防御素104a(goat Beta-Defensins 104a,gBD104a)表达的特性。[方法]采用免疫组化法对绒山羊公羊睾丸和附睾中的gBD104a进行表达定位。[结果]免疫组化染色结果显示:在山羊睾丸的支持细胞、精母细胞、生精细胞、精子细胞中检测到的gBD104a阳性信号非常弱,且在120日龄以前,随着日龄的增加,山羊睾丸的gBD104a表达量逐渐增加,之后则随着日龄的增加而逐渐降低;在山羊附睾的柱状上皮细胞、附睾管腔游离端的纤毛细胞、管腔液中检测到的gBD104a阳性信号较强。对免疫组化结果进行光密度值分析显示不同发育阶段附睾不同片段表达量顺序均是:附睾体附睾头附睾尾,且差异显著(P0.05)。附睾体中gBD104a表达随着月龄的增加而增加,而附睾头中gBD104a表达则是在150日龄是达到高峰,随后日龄增加而降低;附睾尾gBD104a表达趋势与睾丸表达趋势的相似即:是在150日龄是达到高峰,随后日龄增加而降低。附睾精子免疫荧光结果显示,gBD104a定位在精子头部顶体、颈部和尾部主段。[结论]山羊睾丸和附睾中gBD104a表达具有时空特异性。附睾体可能是gBD104a与精子发生作用的部位。包裹在精子顶体部位的gBD104a可能与精子获能或顶体反应相关,其gBD104a功能需进一步深入研究。     

猪发育期NPY-Y1和GPR54受体基因的表达规律研究

[目的]研究猪发育期NPY-Y1和GPR54受体基因的发育性变化。[方法]分别选取初生、60、120、初情期、180日龄的苏姜猪母猪各3头,采集下丘脑、垂体、卵巢组织样品,提取组织RNA,采用荧光定量PCR分析NPY-Y1、GPR54受体基因的发育性变化。[结果]下丘脑、垂体与卵巢内NPY-Y1 mRNA从初生到初情期表达量逐渐下降,在初情期达到最低,初情期后呈上升趋势。在3种组织内,初情期与其他时期NPY-Y1 mRNA表达量均存在显著差异(P<0.05);GPR54 mRNA从初生到初情期表达量逐渐上升,在初情期达到最高,初情期后呈下降趋势。在3种组织内,初情期也与其他时期GPR54 mRNA表达量也均存在显著差异(P<0.05)。[结论]猪发育期NPY-Y1基因与GPR54基因表达存在负相关性。     

山羊PHGPx基因在不同组织中的表达特点及性腺中的定位

【目的】研究磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)在山羊各种组织中的表达特点及在性腺中的定位情况。【方法】提取各种组织总RNA,应用实时荧光定量PCR方法检测各种组织PHGPx mRNA表达规律,利用免疫组化技术对睾丸和附睾PHGPx进行定位分析。【结果】PHGPx mRNA在各种组织表达水平由高到低依次为:睾丸心脑附睾肾肝肺脾背最长肌,在性腺和附睾中:睾丸附睾尾附睾头附睾体;免疫组化结果显示睾丸间质组织、生精细胞均有阳性产物,附睾头部平滑肌纤维表达弱阳性,附睾尾部附睾管中的单层柱状上皮表达呈强阳性。【结论】PHGPx在不同组织广泛表达,发挥重要的生物学功能,免疫组化结果直观显示了睾丸及附睾表达差异的部位,需深入研究其作用机制。     

降钙素基因相关肽在牦牛附睾中的定位与表达

【目的】分析降钙素基因相关肽（calcitonin gene related peptide,CGRP）在牦牛附睾中的转录水平及蛋白分布特点,探究其对精子运输及成熟的功能。【方法】采集6头3~4岁健康成年牦牛的附睾,将其解剖为头、体、尾三部分,应用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）、Western blotting分别检测CGRP mRNA和蛋白在附睾的头、体、尾中的表达水平;采用H.E染色法分析附睾组织结构特点;采用免疫组化和免疫荧光技术分析附睾各部分CGRP的分布及表达情况。【结果】RT-qPCR结果表明,CGRP在牦牛附睾头的相对表达量显著高于附睾体和附睾尾（P＜0.05）,附睾尾表达量最低（P＜0.05）;Western blotting检测结果表明,CGRP蛋白水平在附睾尾中的表达水平显著高于附睾头和附睾体（P＜0.05）。显微镜下观察表明,牦牛附睾组织纤毛长度从头部至尾部逐渐降低,差异显著;附睾头间质组织的间质平滑肌层厚度显著低于附睾体和附睾尾（P＜0.05）;基细胞和晕细胞在附睾尾分布显著,上皮厚度亦在附睾尾显著降低。免疫组化及免疫荧光分析发现,CGRP主要分布于附睾上皮、基底膜及附睾间质小血管,附睾上皮晕细胞的表达强度最高。【结论】CGRP主要分布于牦牛附睾上皮和间质小血管,提示CGRP对牦牛附睾间质小血管的收缩发挥调节作用。牦牛附睾尾晕细胞数量最多,晕细胞中CGRP的高强度表达提示其可能参与附睾尾的免疫调节。     

LCN5蛋白在雄性绵羊生殖器官及精子中的表达定位

[目的]探究绵羊附睾视黄酸结合蛋白——载脂蛋白5(lipocalin5,LCN5)在睾丸、附睾不同区段及输精管组织表达特点及其精子中的定位,为LCN5在雄性生殖器官中的功能研究提供理论依据.[方法]选择体重相近((65.23±1.95)kg)、体况良好、健康无病的9月龄公绵羊6只,其中3只使用假阴道法采集精液,3只做无...     

内蒙古绒山羊JAG1生物信息学及表达模式分析

为分析绒山羊JAG1蛋白结构特征,及其在不同毛囊生长期中的表达模式,从阿拉善种羊场选择2周岁、体重相近的3只内蒙古绒山羊母羊,利用生物信息学方法比对绒山羊JAG1氨基酸序列与其他物种的相似性,分析JAG1蛋白质理化性质和结构特征;利用免疫组化和实时荧光定量PCR检测其在内蒙古绒山羊皮肤中的表达部位和表达量。结果表明,绒山羊JAG1氨基酸序列与绵羊相似性可达99.5%,JAG1蛋白信号肽位于第1~29个氨基酸序列,含有一个剪切位点和一个跨膜结构,具有61个丝氨酸、26个苏氨酸、19个酪氨酸磷酸化位点,63个O-糖基化位点,6个N-糖基化位点,属于不稳定亲水蛋白。在毛囊退行期(1月份)和休止期(4月份)未检测到JAG1蛋白的表达;生长前期(7月份)和生长期(9月份)在毛乳头细胞中表达。JAG1 mRNA在内蒙古绒山羊皮肤毛囊的4个时期均有表达,随着毛囊进入生长期JAG1 mRNA表达量逐渐增加,生长期皮肤中的表达量显著高于其他阶段(P<0.05)。综上,绒山羊JAG1氨基酸序列在物种进化过程中比较保守,JAG1 mRNA在内蒙古绒山羊毛囊生长前期和生长期表达升高,为深入研究绒山羊JAG1基因对毛囊发育的调控提供理论依据。     

间接免疫荧光方法检测小鼠睾丸和附睾组织Hsp70的表达

采用间接免疫荧光方法对小鼠睾丸和附睾组织Hsp70的表达进行检测.结果表明,小鼠睾丸组织Hsp70呈极强的表达(+++),并且在各级生精细胞及支持细胞都呈极强表达;小鼠附睾头、附睾体、附睾尾的Hsp70呈现极强表达(+++),主要在附睾上皮细胞,而管腔内精子偶见阳性染色.说明间接免疫荧光方法能够特异性、原位地检测小鼠睾丸和附睾组织Hsp70的表达,而且操作简单,适用于研究Hsp70在精子发生和成熟过程的作用.     

GnRHR在不同日龄建昌黑山羊睾丸、附睾中的分布与表达

[目的]定位并比较不同日龄建昌黑山羊睾丸及附睾中GnRHR的分布及表达情况。[方法]分别收集55、104、300、1 140日龄建昌黑山羊的睾丸、附睾头和附睾尾组织,然后进行脱水、包埋、切片后,采用免疫组化定位GnRHR在各个组织中的分布。[结果]GnRHR在建昌黑山羊睾丸、附睾头和附睾尾组织细胞中均有分布,在上皮下层、基质层中分布较多,其表达量在300日龄的附睾尾和1 140日龄的睾丸中达到较高水平。[结论]GnRHR在睾丸、附睾中均有表达,而且不同日龄阶段表达存在组织细胞特异性。     

雄激素和氢化可的松对山羊附睾头上皮细胞增殖的影响

为研究雄激素和氢化可的松对山羊附睾上皮细胞生长的作用模式,本研究利用酶标仪检测附睾头部上皮细胞增殖情况,实时荧光定量PCR及ELISA检测雄激素受体(AR)的表达,检测睾酮与氢化可的松对山羊附睾上皮细胞体外增殖的作用以及对AR表达的影响。结果表明:100nmol/L睾酮对附睾头上皮细胞增殖的促进效应最高且与对照组差异极显著(P0.01),200nmol/L氢化可的松促进附睾头上皮细胞增殖效应最佳并与对照组差异显著(P0.05),前者的效应明显且可以被AR阻断剂阻断;睾酮和氢化可的松对附睾头上皮细胞增殖表现为协同作用;100nmol/L睾酮与200nmol/L氢化可的松均使附睾头上皮细胞的AR mRNA和蛋白表达量上调,与对照组差异显著(P0.05),且二者共存时附睾头上皮细胞的AR mRNA和蛋白表达量极显著高于对照组(P0.01)。本研究表明睾酮和氢化可的松对附睾头上皮细胞体外增殖均有促进作用,呈明显的浓度依赖性,且二者之间存在协同作用,这为进一步研究附睾上皮细胞增殖及功能的调节机理提供了基础。     

精子抗原基因在猪生殖道及成熟精子中的表达特性

【目的】揭示若干精子抗原基因(SPAG1、SPAG5、SPAG6、SPAG11C和SPAG11E)在梅山公母猪生殖道及成熟精子中的mRNA时空表达规律。【方法】利用RT-PCR技术分析各基因在生殖道和精子中组织表达谱,利用半定量RT-PCR分析其在初生至150d梅山公猪睾丸中的发育性表达特性。【结果】5个基因在梅山公母猪生殖道组织中呈现不同的表达特性。其中SPAG1在睾丸中表达丰度最高,在精囊腺、前列腺、附睾体、子宫角和输卵管呈现中等丰度表达,而在附睾尾、子宫颈和卵巢的表达信号较弱。SPAG5在睾丸中表达丰度最高,在前列腺、附睾体和子宫颈中表达信号较弱。而SPAG6在睾丸中高丰度表达,在输卵管中呈现中等丰度表达,在子宫角的表达信号很弱。SPAG11C在附睾体和睾丸中高水平表达,而SPAG11E则在附睾体和附睾尾中低水平表达。在成熟精子中只有SPAG11E有mRNA表达。SPAG1、SPAG5、SPAG6和SPAG11C基因在公猪睾丸中发育性表达分析表明,总体上所检测的4个精子抗原基因的表达水平都随着日龄增加而提高,但存在一些差异。其中SPAG1和SPAG11C呈现相似的表达规律,在初生和30日龄时表达相对较低,但在60、90、150日龄都有显著提高(P0.05)。而SPAG5在初生和30日龄时表达也相对较低,在60和90日龄时均有显著提高(P0.05),但150日龄时略有下降,但差异不显著。SPAG6在初生和30日龄时表达水平很低,至60日龄有显著提高(P0.05),90日龄时维持这一水平,而到150日龄时则有显著下降(P0.05)。【结论】SPAG1、SPAG5、SPAG6、SPAG11C和SPAG11E在梅山公母猪生殖道组织广泛表达,在睾丸组织中其mRNA表达水平变化与性发育相一致,SPAG11E在精子中存在低丰度mRNA表达。     

牛附睾和附睾液分析与牛附睾尾精子在模拟附睾液中存活试验

[目的]新鲜精液在离开生殖腺后存活时间很短.相关研究表明副睾液为精子的存活提供了特殊的环境.试验探讨和研究牛附睾精子在体外模拟附睾液中的存活试验的各因素的影响.[方法]试验对公牛附睾头部和尾部的摩尔渗透压和蛋白质浓度进行了分析,牛附睾尾部精子在不同蛋白浓度的CEP-2溶液中,在4℃条件下孵育120h.每24h做一次精子活力检测.[结果]5 d后精子活力仍然超过60;.附睾头、尾部的渗透压分别为(287.0±13.7)mOsm和(310.8±17.0)mOsm.蛋白浓度分别为(37.43±12.55)mg/mL和(50.58±11.08)mg/mL.[结论]附睾尾精子在蛋白浓度为40mg/mL,渗透压为345 mOsm时,精子存活率最高.     

公鸡生殖器官组织结构及其IL-1β和IL-6在生殖器官中的定位

【目的】IL-1β和IL-6在公鸡生殖器官免疫保护中发挥着重要的作用,研究拟揭示公鸡生殖器官的组织构造,以及定位IL-1β和IL-6在其生殖器官中的表达部位。【方法】通过苏木精-伊红染色方法,制作正常生理状态下公鸡生殖器官切片,观察公鸡生殖器官的组织构造以及生殖管道上皮细胞变化规律;同时采用免疫组化定位IL-1β和IL-6在生殖器官的部位。【结果】实验表明,附睾中的管道在公鸡生殖管道中占有很大比例,且生殖管道的上皮细胞的变化特征与其输送精液高度适应;IL-1β和IL-6主要定位于附睾近端输出管上,且IL-1β主要定位于短皱褶的近端输出管,IL-6主要定位于长皱褶的近端输出管上。【结论】结果表明附睾的输出管,尤其是近端可能是清除生殖道中的异常精子、脱落细胞等异物的主要部位。