GPX5在成年绵羊附睾中的表达与蛋白定位

【目的】研究谷胱甘肽过氧化物酶-5（glutathione peroxidase type-5, GPX5）在成年绵羊附睾的表达特征以及GPX5蛋白在附睾中的定位,为绵羊精子在附睾中抗氧化机制的研究提供理论依据。【方法】采取年龄相近的成年蒙古绵羊的附睾、睾丸和输精管。每一只公羊的附睾分别按照附睾头、附睾体和附睾尾进行分割。样品保存于-80 ℃冰箱,采用实时荧光定量PCR和Western blotting的方法,对成年绵羊的附睾、睾丸和输精管的GPX5 表达量进行分析。将新鲜的组织样品各部分切取适合大小浸泡于4%多聚甲醛溶液中24h,按照石蜡切片的方法制做组织切片。用GPX5特异性抗体孵育组织切片,利用DAB显色试剂盒对阳性信号进行标记。【结果】实时荧光定量PCR结果显示,成年绵羊附睾头GPX5基因的表达量极显著高于附睾体和附睾尾（P＜0.01）,而在输精管和睾丸几乎不表达。Western blotting的结果显示,GPX5蛋白在成年绵羊附睾头高表达,在附睾体和附睾尾有微量蛋白存在,睾丸和输精管中未发现GPX5蛋白。这表明GPX5主要在成年绵羊附睾头表达;经过免疫组化染色分析,GPX5蛋白主要位于附睾头上皮细胞质以及静纤毛,附睾体和附睾尾中的GPX5蛋白主要集中在静纤毛。在附睾头、附睾体和附睾尾中的精子上以及附睾腔都可以观察到GPX5蛋白,表明GPX5蛋白从附睾上皮分泌到附睾腔中,随着精子在附睾中的运输与精子结合。【结论】在成年绵羊附睾中,GPX5主要由附睾头上皮细胞合成和分泌,在附睾管腔中与精子结合,为精子功能的正常发挥提供保护。     

牛附睾和附睾液分析与牛附睾尾精子在模拟附睾液中存活试验

[目的]新鲜精液在离开生殖腺后存活时间很短.相关研究表明副睾液为精子的存活提供了特殊的环境.试验探讨和研究牛附睾精子在体外模拟附睾液中的存活试验的各因素的影响.[方法]试验对公牛附睾头部和尾部的摩尔渗透压和蛋白质浓度进行了分析,牛附睾尾部精子在不同蛋白浓度的CEP-2溶液中,在4℃条件下孵育120h.每24h做一次精子活力检测.[结果]5 d后精子活力仍然超过60;.附睾头、尾部的渗透压分别为(287.0±13.7)mOsm和(310.8±17.0)mOsm.蛋白浓度分别为(37.43±12.55)mg/mL和(50.58±11.08)mg/mL.[结论]附睾尾精子在蛋白浓度为40mg/mL,渗透压为345 mOsm时,精子存活率最高.     

GPx5在内蒙古绒山羊附睾中的表达

为研究GPx5在内蒙古绒山羊附睾中的表达模式,对初情期、体成熟期、老龄期3个生殖生理阶段绒山羊附睾及睾丸中的GPx5从mRNA和蛋白水平进行了检测。结果显示各生殖生理阶段绒山羊睾丸中均未见GPx5表达,附睾中均有GPx5表达。各生殖生理阶段附睾表达区域及表达量存在差异:初情期,GPx5 mRNA和蛋白主要表达于附睾头部;体成熟期,附睾各区域GPx5 mRNA和蛋白的表达量极显著高于其他阶段,附睾起始部和附睾头部为主要表达区;老龄期,GPx5 mRNA和蛋白主要表达于附睾头部,但较体成熟期明显减少。免疫组化定位显示GPx5蛋白主要分布于附睾上皮细胞,而且各年龄阶段绒山羊附睾腔内精子上都有明显的GPx5阳性信号。研究表明绒山羊附睾GPx5的表达区域及表达量变化与动物生殖生理阶段直接相关。     

GALNTL5基因在不同月龄湖羊附睾中的表达模式及其miRNA的预测

[目的]本文旨在探究不同发育阶段湖羊附睾(头、体、尾)中GALNTL5(polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase-like protein 5)的表达规律及其microRNA(miRNA)预测。[方法]选取3、9、24月龄(M)雄性湖羊各5只,屠宰后采集附睾(头、体、尾)组织。采用RT-qPCR和Western blot技术检测不同发育阶段湖羊附睾中GALNTL5 mRNA和蛋白表达水平;用免疫组化技术对其进行定位分析;用RNAhybrid和miRanda 2种软件分别预测GALNTL5对应的miRNA并取交集,同时检测候选miRNA在附睾尾中的表达规律。[结果]GALNTL5 mRNA和蛋白在附睾体、尾中表现为性成熟后(9 M和24 M)显著高于性成熟前(3 M)(P0.05);GALNTL5 mRNA在附睾头中表现为24 M显著高于3 M和9 M(P0.05),但3 M与9 M之间差异不显著(P0.05)。除了GALNTL5蛋白在9 M与24 M附睾尾中差异显著外,其余均差异不显著(P0.05);GALNTL5蛋白在附睾头、体中的表达规律一致;GALNTL5定位于附睾主细胞、基细胞及精子中。预测获得11个候选miRNA,按评分高低进行排序,选取miR-487a-5p、miR-485-5p、miR-329b-5p和miR-27a这4个miRNA进行验证,发现miR-487a-5p表达水平表现为性成熟后(9 M和24 M)显著高于性成熟前(3 M)(P0.05),而miR-485-5p和miR-27a呈现相反趋势。[结论]GALNTL5在精子成熟过程中扮演着重要的角色;miR-485-5p和miR-27a可能与GALNTL5存在靶向关系。     

GPx5基因在绵羊附睾上的时空表达特性

【目的】研究谷胱甘肽过氧化酶5(GPx5)基因在绵羊附睾及附睾不同发育时期的表达特性。【方法】采用荧光定量PCR技术、免疫印迹技术及免疫荧光等方法,分别检测GPx5基因在绵羊附睾不同发育时期、不同部位上mRNA和蛋白的表达及分布情况。【结果】荧光定量PCR结果表明,青年羊附睾GPx5基因在头部的mRNA表达量显著高于体部和尾部(P0.05);青年羊附睾头部GPx5基因mRNA表达量显著高于羔羊和老年羊附睾头部(P0.05)。免疫印迹结果表明,羔羊附睾无GPx5蛋白表达;青年羊附睾各部位均有表达,而老年羊附睾头部和体部有表达、尾部无表达。灰度分析结果表明,青年羊附睾头部GPx5相对表达量显著高于其他部位(P0.05),且青年羊附睾头部GPx5蛋白相对表达量显著高于老年羊附睾头部(P0.05)。免疫荧光结果表明,在羔羊附睾未检测到GPx5蛋白表达信号;青年羊附睾各部位均有荧光信号表达,且附睾头部和体部荧光强度明显高于尾部,并在附睾管液体中也发现有荧光信号;老年羊附睾头部和体部有荧光信号,荧光遍布于附睾管假复层上皮细胞的细胞核及细胞质中。【结论】GPx5基因mRNA在绵羊附睾不同发育时期均有表达,但在不同部位具有表达差异性;GPx5蛋白于附睾管假复层上皮细胞表达,且在性成熟前羔羊附睾及老年羊附睾尾部未表达,因此推测GPx5蛋白的表达与绵羊性发育时期有密切关联。     

外源雄激素促进绵羊附睾GPx5基因的表达

为研究外源雄激素丙酸睾酮对绵羊附睾特异表达基因谷胱甘肽过氧化酶5(GPx5)的影响,应用酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清和附睾头部内睾酮(T)、二氢睾酮(DHT)的含量,及附睾头部雄激素受体(AR)蛋白表达量;应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测了附睾头部GPx5-mRNA和AR-mRNA相对表达量;并结合免疫印迹(WB)法检测了附睾头部GPx5蛋白相对表达量。结果表明:丙酸睾酮处理(TPT)组与对照组相比绵羊血清DHT含量,附睾头部T含量、DHT含量均显著提高,分别是对照组的0.5、6.0、0.8倍;GPx5-mRNA和ARmRNA相对表达量显著提高,分别是对照组的0.75和0.77倍(P0.05);AR及GPx5蛋白表达量显著提高,分别是对照组的0.63和0.58(P0.05)。因此,外源雄激素丙酸睾酮可大量提高绵羊附睾头部GPx5基因的表达,对绵羊附睾头部GPx5基因的表达具有促进作用。     

高低精子活力的鸡睾丸和附睾转录组系统分析

为探究精子活力与睾丸和附睾组织对种公鸡基因表达的影响,本研究选取精子活力存在显著差异的海兰褐种公鸡8只(高活力4只,低活力4只),屠宰后采集其睾丸和附睾组织进行转录组测序。利用DESeq2的双因素模块筛选不同精子活力组间和不同组织间的差异表达基因,并进行功能富集分析。结果表明：1)2个组织高精子活力和低精子活力组间的差异表达基因有112个;在高精子活力组高表达的基因有32个,低精子活力组高表达的基因有80个。高低精子活力间差异表达基因显著富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、产生IgA的肠道免疫网络和甘油磷脂代谢3条通路,其中CTRP3、TDRD5、KATNAL2、SOCS3和CSF3等差异表达基因可能是调控鸡精子活力的重要基因。2)睾丸和附睾组织间鉴定出9 212个差异表达基因,在睾丸组织高表达的基因有5 206个,在附睾组织中高表达的基因有4 006个。睾丸特异性高表达基因显著富集在细胞周期、细胞核质转运、减数分裂和甘油磷脂代谢等8条通路,其中YTHDC2、MEIG1、GTSF1、JAM3和SFMBT1等差异表达基因在精子发生过程中发挥着重要作用。在附睾组织高表达的基因参与了MAP...     

绵羊附睾尾部精液低温保存效果的研究

由成年绵羊离体睾丸上获得附睾尾部精液,进行3种浓度稀释液(葡萄糖、柠檬酸三钠、卵黄含量分别为:Ⅰ组1 5g,0 7g,10ml;Ⅱ组0 4g,1 4g,10ml;Ⅲ组1 5g,0 7g,4ml)低温保存(4℃)效果的观察,并对低温保存前精液的处理方法进行了比较。结果表明:Ⅲ组绵羊精液低温保存总存活时间和存活指数均好于Ⅰ、Ⅱ两组(P<0 01;P<0 05);Ⅲ组保存前经上游处理的精液在总存活时间、存活指数和体外受精效果均明显高于未经上游处理的精液。     

不同沙棘果渣添加水平对公绵羊睾丸和附睾抗氧化性的影响

[目的]研究饲喂不同沙棘果渣添加水平的日粮对公绵羊睾丸与附睾抗氧化性的影响。[方法]选用24只5月龄,体重(25.00±1.00)kg健康的杜泊×小尾寒羊杂交公羔,随机分为4组,按照分组依次饲喂添加不同水平沙棘果渣(0%、10%、20%、30%)的日粮,试验期65d。试验结束后采集公绵羊的睾丸和附睾组织,并对组织抗氧化相关基因mRNA和蛋白的表达进行研究。[结果]睾丸组织中,30%沙棘果渣添加组GPx4 mRNA的相对表达量相较于10%添加组以及对照组显著降低(P0.05)。附睾头组织中,30%沙棘果渣添加组Cu-ZnSOD mRNA的相对表达量显著低于10%和20%沙棘果渣添加组(P0.05);30%沙棘果渣添加组GPx4 mRNA的相对表达量相较于对照组显著降低(P0.05)。附睾体组织中,30%沙棘果渣添加组CAT mRNA的相对表达量相较于10%添加组显著降低(P0.05)。附睾尾组织中,20%沙棘果渣添加组Cu-ZnSOD mRNA的相对表达量相较于30%添加组与对照组显著升高(P0.05);30%沙棘果渣添加组Cu-ZnSOD mRNA的相对表达量相较于10%添加组显著降低(P0.05)。20%沙棘果渣添加组附睾头Nrf2与附睾尾Cu-ZnSOD蛋白表达量显著高于10%和30%沙棘果渣添加组。[结论]日粮中添加10%和20%沙棘果渣可以不同程度促进公绵羊睾丸和附睾抗氧化相关基因mRNA的表达,而添加30%沙棘果渣会降低睾丸GPx4、附睾头Cu-ZnSOD和GPx4、附睾体CAT、附睾尾Cu-ZnSOD mRNA以及附睾头Nrf2和附睾尾Cu-ZnSOD蛋白的表达量。因此,25kg杜泊×小尾寒羊杂交公羔日粮中添加30%沙棘果渣为过量添加水平。     

RFRP-3对大鼠附睾生殖功能的影响

[目的]探究RFRP-3对大鼠附睾生殖功能的影响,为全面了解RFRP-3调控雄性动物的生殖生理功能提供理论依据.[方法]通过半定量RT-PCR检测不同发育阶段(20、40、60和80日龄)SD大鼠附睾中RFRP-3及其受体GPR147的表达情况;选取60日龄雄性SD大鼠,分别对其睾丸注射0(CK)、0.1、1.0和10.0μg/d的RFRP-3,连续注射7 d,然后通过组织石蜡切片、酶活性测定、Western blotting等分别检测不同剂量RFRP-3对SD大鼠附睾形态学、Caspase-3活性、凋亡相关蛋白(Caspase-3和Bcl-2)和自噬相关蛋白(Beclin-1、LC3和Atg5)表达的影响.[结果]RFRP-3和GPR147在不同发育阶段SD大鼠附睾中的表达水平呈波动性变化,均以60日龄的表达水平最高;不同剂量的RFRP-3均能导致SD大鼠附睾上皮细胞发生异常,使精子数量减少.与CK相比,不同剂量的RFRP-3均能极显著增加SD大鼠附睾Caspase-3活性(P<0.01,下同),还能显著(P<0.05,下同)或极显著提高附睾中活化Caspase-3与完整Caspase-3的比值,有效抑制Bcl-2的表达,且呈明显的剂量依赖关系.RFRP-3对SD大鼠附睾内自噬标志蛋白Beclin-1、LC3-II/LC3-I和Atg5的表达出现相互矛盾的结果.[结论]RFRP-3在雄性大鼠附睾中有表达,但对附睾活性有直接抑制作用,具体作用原理是RFRP-3能诱导附睾中总Caspase-3裂解为活性Caspase-3并下调Bcl-2表达以触发附睾细胞凋亡,而附睾细胞的凋亡促使附睾退化及精子数量减少.     

精子抗原基因在猪生殖道及成熟精子中的表达特性

【目的】揭示若干精子抗原基因(SPAG1、SPAG5、SPAG6、SPAG11C和SPAG11E)在梅山公母猪生殖道及成熟精子中的mRNA时空表达规律。【方法】利用RT-PCR技术分析各基因在生殖道和精子中组织表达谱,利用半定量RT-PCR分析其在初生至150d梅山公猪睾丸中的发育性表达特性。【结果】5个基因在梅山公母猪生殖道组织中呈现不同的表达特性。其中SPAG1在睾丸中表达丰度最高,在精囊腺、前列腺、附睾体、子宫角和输卵管呈现中等丰度表达,而在附睾尾、子宫颈和卵巢的表达信号较弱。SPAG5在睾丸中表达丰度最高,在前列腺、附睾体和子宫颈中表达信号较弱。而SPAG6在睾丸中高丰度表达,在输卵管中呈现中等丰度表达,在子宫角的表达信号很弱。SPAG11C在附睾体和睾丸中高水平表达,而SPAG11E则在附睾体和附睾尾中低水平表达。在成熟精子中只有SPAG11E有mRNA表达。SPAG1、SPAG5、SPAG6和SPAG11C基因在公猪睾丸中发育性表达分析表明,总体上所检测的4个精子抗原基因的表达水平都随着日龄增加而提高,但存在一些差异。其中SPAG1和SPAG11C呈现相似的表达规律,在初生和30日龄时表达相对较低,但在60、90、150日龄都有显著提高(P0.05)。而SPAG5在初生和30日龄时表达也相对较低,在60和90日龄时均有显著提高(P0.05),但150日龄时略有下降,但差异不显著。SPAG6在初生和30日龄时表达水平很低,至60日龄有显著提高(P0.05),90日龄时维持这一水平,而到150日龄时则有显著下降(P0.05)。【结论】SPAG1、SPAG5、SPAG6、SPAG11C和SPAG11E在梅山公母猪生殖道组织广泛表达,在睾丸组织中其mRNA表达水平变化与性发育相一致,SPAG11E在精子中存在低丰度mRNA表达。     

纳米锌水平对公羊精液品质、抗氧化酶活性及附睾Cu-ZnSOD表达的影响

【目的】微量元素锌是动物正常繁殖所必需的元素,研究旨在了解日粮纳米锌对公羊精液品质、抗氧化酶和附睾Cu-ZnSOD蛋白表达的影响,分析公羊精液品质参数与精浆抗氧化酶活性的相关性。【方法】将16只9月龄健康状况良好体重相近的晋中绵羊公羊,随机分成4组,分别喂给基础日粮（对照组）,基础日粮+50 mg·kg^-1、100 mg·kg^-1和150 mg·kg^-1 DM纳米锌。试验期90 d。在试验78 d和79 d连续两天采集精液,每次采集精液取出100 µL评价精液品质参数,剩余精液离心分离精浆,测定精浆Cu-ZnSOD、GPxs活性及总抗氧化能力;试验结束时,用手术去势法采集附睾头、附睾体和附睾尾组织,采用免疫组化技术对附睾头、附睾体和附睾尾中Cu-ZnSOD进行定位,并用Image Pro Plus 7.0软件分析的平均光密度值进行Cu-ZnSOD蛋白定量。【结果】日粮纳米锌对公羊射精量影响差异不显著（P＞0.05）。与对照组相比,添加50 mg·kg^-1或100 mg·kg^-1纳米锌组公羊的精子密度、精子活力和精子质膜完整性显著增加（P＜0.05）,精子畸形率显著降低（P＜0.05）;添加150 mg·kg^-1组精子质膜的完整度显著增加（P＜0.05）,其精子活力和精子密度与对照组的差异不显著（P＞0.05）。日粮添加50 mg·kg^-1或100 mg·kg^-1纳米锌组公羊精浆Cu-ZnSOD活性、GPxs活性和总抗氧化能力显著高于对照组（P＜0.05）,精浆MDA含量显著低于对照组（P＜0.05）;添加150 mg·kg^-1组公羊精浆总抗氧化能力显著高于对照组（P＜0.05）,其精浆Cu-ZnSOD活性、GPxs活性和MDA含量与对照组差异不显著（P＞0.05）。免疫组化定位结果显示Cu-ZnSOD在附睾头和附睾体假复层上皮、结缔组织和附睾尾的单层柱状上皮中均检测到阳性信号,试验处理组公羊附睾中Cu-ZnSOD表达量由高到低顺序是：附睾体＞附睾头＞附睾尾;然而对照组的顺序为：附睾头＞附睾体＞附睾尾。50 mg·kg^-1或100 mg·kg^-1纳米锌组公羊附睾头和附睾体阳性信号的平均光密度显著高于对照组和150 mg·kg^-1纳米锌（P＜0.05）。精浆Cu-ZnSOD活性与精子密度、精子活力和精子质膜完整性呈正相关,与精子畸形率呈负相关。【结论】日粮添加50 mg·kg^-1或100 mg·kg^-1纳米锌可改善精液品质,提高精浆抗氧化能力,增加附睾中Cu-ZnSOD蛋白表达量。精浆Cu-ZnSOD活性可以作为检测精液品质优劣的指标在羊生产中应用。微量元素锌对精液品质影响调控的分子机理还需进一步深入研究。     

间接免疫荧光方法检测小鼠睾丸和附睾组织Hsp70的表达

采用间接免疫荧光方法对小鼠睾丸和附睾组织Hsp70的表达进行检测.结果表明,小鼠睾丸组织Hsp70呈极强的表达(+++),并且在各级生精细胞及支持细胞都呈极强表达;小鼠附睾头、附睾体、附睾尾的Hsp70呈现极强表达(+++),主要在附睾上皮细胞,而管腔内精子偶见阳性染色.说明间接免疫荧光方法能够特异性、原位地检测小鼠睾丸和附睾组织Hsp70的表达,而且操作简单,适用于研究Hsp70在精子发生和成熟过程的作用.     

拟黑多刺蚁内生殖系统的观察

首次对拟黑多刺蚁内生殖进行系统解剖观察。结果发现,拟黑多刺蚁的雌性生殖系统由卵巢、输卵管、中输卵管、受精囊、生殖腔和雌性附腺等结构组成,为典型的多滋式卵巢;雄性生殖系统由精巢、侧输精管、输精管、贮精囊、射精管、雄性附腺及阴茎等结构组成,雄性附腺发达,贮精囊不明显,婚飞前雄蚁的精巢及精巢小管已逐渐退化,精巢小管的数量与其他种类蚂蚁存在一定差别。     

公鸡生殖器官组织结构及其IL-1β和IL-6在生殖器官中的定位

【目的】IL-1β和IL-6在公鸡生殖器官免疫保护中发挥着重要的作用,研究拟揭示公鸡生殖器官的组织构造,以及定位IL-1β和IL-6在其生殖器官中的表达部位。【方法】通过苏木精-伊红染色方法,制作正常生理状态下公鸡生殖器官切片,观察公鸡生殖器官的组织构造以及生殖管道上皮细胞变化规律;同时采用免疫组化定位IL-1β和IL-6在生殖器官的部位。【结果】实验表明,附睾中的管道在公鸡生殖管道中占有很大比例,且生殖管道的上皮细胞的变化特征与其输送精液高度适应;IL-1β和IL-6主要定位于附睾近端输出管上,且IL-1β主要定位于短皱褶的近端输出管,IL-6主要定位于长皱褶的近端输出管上。【结论】结果表明附睾的输出管,尤其是近端可能是清除生殖道中的异常精子、脱落细胞等异物的主要部位。     

除精浆提高冷冻精液品质的实验研究

采用离心洗涤法去除精浆后,对精液进行冷冻处理。发现:1、除精浆精子冻后的活率、Ⅰ类顶体率和精子畸形率与未除精浆组存在显著差异(P<0．05);2、除精浆使稀释后精液精浆中GOT和LDH活性明显升高(P<0．05)。从平衡后到解冻后各组GOT和LDH活性都呈上升趋势。但除精浆试验组比未除精浆试验组上升缓慢;3、除精浆试验组精子的穿卵率、卵内平均精子数都显著高于未除精浆试验组(P<0．05);4除精浆离心洗涤液用生理盐水和脱脂乳-卵柠液．两者之间无显著差异(P>0．05)。