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为了表达牛环形泰勒虫（Theileria annulata）截短HSP70基因编码蛋白并研究该蛋白的结构与功能特性,本研究扩增牛环形泰勒虫HSP70目的基因并构建重组质粒pMD18-T-HSP70,选取其他种的同源HSP70蛋白序列构建系统进化树;利用生物信息学方法分析HSP70基因编码蛋白的氨基酸组成、基本理化性质、亲疏水性、跨膜区结构、信号肽、可能的磷酸化位点、亚细胞定位及蛋白的二级结构和三级结构;对重组蛋白HSP70进行蛋白互作网络分析;构建原核表达载体pET28a-HSP70,筛选诱导表达条件,镍柱纯化重组蛋白及检测反应原性。结果显示,牛环形泰勒虫HSP70蛋白序列与小泰勒虫的序列同源性较高,蛋白分子质量为42 ku,理论等电点（pI）为5.61,属于酸性亲水性蛋白,无跨膜区及信号肽;蛋白功能预测结果显示,HSP70包含32个可能的磷酸化位点,亚细胞定位分析显示该蛋白主要分布于细胞质。蛋白质二级结构中α-螺旋、β-转角、无规则卷曲、延伸链分别占39.18%、8.51%、30.41%和21.91%。蛋白互作网络构建结果显示,与HSP70相互作用的蛋白主要为HSP90家族成员,另外还有伴侣蛋白GrpE同系物,预示着HSP70可能在细胞内与HSP90形成复合体发挥作用。本试验成功构建原核表达载体,获得了大小约为48 ku的融合蛋白,以0.6 mmol/L IPTG于37 ℃诱导5 h,蛋白表达较好;点状印迹及Western blotting结果表明,表达产物可被自然感染的牛环形泰勒虫阳性血清识别,具有良好的反应原性。本试验结果为进一步探讨牛环形泰勒虫HSP70功能机制提供了理论依据。     

牛环形泰勒虫HSP70基因的克隆表达、特性分析及互作蛋白网络构建

为了表达牛环形泰勒虫(Theileria annulata)截短HSP70基因编码蛋白并研究该蛋白的结构与功能特性,本研究扩增牛环形泰勒虫HSP70目的基因并构建重组质粒pMD18-T-HSP70,选取其他种的同源HSP70蛋白序列构建系统进化树;利用生物信息学方法分析HSP70基因编码蛋白的氨基酸组成、基本理化性质、亲疏水性、跨膜区结构、信号肽、可能的磷酸化位点、亚细胞定位及蛋白的二级结构和三级结构;对重组蛋白HSP70进行蛋白互作网络分析;构建原核表达载体pET28a-HSP70,筛选诱导表达条件,镍柱纯化重组蛋白及检测反应原性。结果显示,牛环形泰勒虫HSP70蛋白序列与小泰勒虫的序列同源性较高,蛋白分子质量为42 ku,理论等电点(pI)为5.61,属于酸性亲水性蛋白,无跨膜区及信号肽;蛋白功能预测结果显示,HSP70包含32个可能的磷酸化位点,亚细胞定位分析显示该蛋白主要分布于细胞质。蛋白质二级结构中α-螺旋、β-转角、无规则卷曲、延伸链分别占39.18%、8.51%、30.41%和21.91%。蛋白互作网络构建结果显示,与HSP70相互作用的蛋白主要为HSP90家族成员,另外还有伴侣蛋白GrpE同系物,预示着HSP70可能在细胞内与HSP90形成复合体发挥作用。本试验成功构建原核表达载体,获得了大小约为48 ku的融合蛋白,以0.6 mmol/L IPTG于37℃诱导5 h,蛋白表达较好;点状印迹及Western blotting结果表明,表达产物可被自然感染的牛环形泰勒虫阳性血清识别,具有良好的反应原性。本试验结果为进一步探讨牛环形泰勒虫HSP70功能机制提供了理论依据。     

新疆牛环形泰勒虫Tams1基因的克隆与表达

采用PCR方法扩增环形泰勒虫Tams1基因,将扩增产物与pUcm-T载体连接,重组质粒经PCR和双酶切鉴定、测序确认后被亚克隆于pGEX-4T-2表达载体中.构建的表达重组质粒经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western blot分析.结果显示,克隆的Tams1基因片段长846 bp,为一个完整的开放阅读框,编码281个氨基酸,与GenBank中的Tams1基因核苷酸同源性在93.6%～99.8%之间;系统进化树分析表明新疆分离株与印度株、毛利塔尼亚株和北非共和国株进化途径一致,与苏丹株、巴林株进化途径相差较远;推测的蛋白质抗原决定簇预测表明,Tams1基因编码的氨基酸具有13个交叉的抗原决定簇;表达的融合蛋白为56 ku,能够被环形泰勒虫多克隆血清所识别,表明该融合蛋白具有较好的反应原性和免疫原性,为进一步开展牛环形泰勒虫的分子生物学诊断、亚单位疫苗和核酸疫苗的研究奠定了可靠的基础.     

牛环形泰勒虫enolase基因的原核表达及生物信息学分析

【目的】获得牛环形泰勒虫(Theileria annulata)新疆株enolase基因,并分析其生物学特性及反应原性。【方法】对牛环形泰勒虫enolase基因进行扩增和克隆,构建原核表达载体pGEX-4T-1-enolase,诱导表达enolase重组蛋白并进行蛋白纯化,通过Western blotting验证enolase重组蛋白反应原性。利用生物信息学方法对enolase基因编码蛋白的理化性质、亲疏水性、跨膜区、信号肽、磷酸化、亚细胞定位及蛋白互作网络进行预测分析。【结果】PCR扩增出大小为1 248 bp的牛环形泰勒虫enolase基因片段,enolase重组蛋白大小约70 ku;Western blotting结果表明,该重组蛋白与牛环形泰勒虫阳性血清发生反应。enolase基因编码416个氨基酸,理论等电点为5.91,有38个磷酸化位点;二级结构主要由α-螺旋(43.03%)和无规则卷曲(33.17%)组成;具有17个B细胞抗原表位,亚细胞定位主要位于细胞质中;enolase蛋白与磷酸甘油酸变位酶(PGAM)、二磷酸核苷激酶(NDK)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、热休克蛋白70(HSP70)存在相互作用。【结论】本试验成功克隆出新疆牛环形泰勒虫enolase基因,蛋白互作网络预测其与糖酵解和能量代谢相关的蛋白相互作用。研究结果为牛环形泰勒虫能量代谢途径基因的相关研究奠定基础。     

环形泰勒虫3-磷酸甘油醛脱氢酶的原核表达、多克隆抗体制备及亚细胞定位

为了研究环形泰勒虫3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的功能,本试验利用PCR技术从环形泰勒虫裂殖体cDNA中扩增环形泰勒虫GAPDH (TaGAPDH)基因,将扩增产物克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,并转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行融合蛋白诱导表达,融合蛋白纯化后免疫家兔,制备多克隆抗体,分别用间接ELISA和Western blotting检测抗体的效价和特异性;利用激光共聚焦荧光显微镜观察TaGAPDH蛋白在环形泰勒虫裂殖体中的亚细胞定位.结果显示,克隆得到了TaGAPDH全长基因,大小为1 020 bp;SDS-PAGE分析结果显示,融合蛋白大小约44 ku,且以包涵体形式存在.制备的多克隆抗体效价高达1:12 800,具有很高的特异性;亚细胞定位显示TaGAPDH蛋白主要分布于环形泰勒虫裂殖体细胞质内.以上结果表明本试验成功克隆表达了TaGAPDH基因,并制备了针对TaGAPDH蛋白的兔多克隆抗体,为筛选环形泰勒虫病疫苗、药物靶点及研究环形泰勒虫能量代谢奠定了基础.     

环形泰勒虫裂殖体表面蛋白基因高免疫原性区片段的克隆及其表达

根据环形泰勒虫TaA1272-1株裂殖体表面抗原(TaSP)基因的序列设计了1对引物，用PCR扩增出该基因长为393bp的高免疫原性区片段(SBxp)。将扩增产物连接到pGEM-T Easy载体上，转化入大肠埃希氏菌JM109中进行克隆。随后将重组质粒pGEM-SBxp和表达载体pGEX-4T-1分别以BamHⅠ、XhoⅠ酶切后，将酶切的目的片段SBxp亚克隆到原核表达载体中构建了重组表达载体pGEX-4T-1-SBxp，并将其转化到BL21宿主菌中。提取重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ酶切、PCR鉴定和测序确证后，阳性克隆用IPTG诱导表达。收集不同时间的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western blotting检测。结果，SBxp基因在大肠埃希氏菌中成功表达，其表达产物为分子质量43ku的融合蛋白，该产物能被牛环形泰勒虫阳性血清所识别。     

环形泰勒虫表面抗原重组蛋白Tasp-Tams1-Spag1生物信息学分析与原核表达

运用生物信息学软件对环形泰勒虫表面抗原串联基因Tasp-Tams1-Spag1进行分析,预测其编码蛋白的主要特性与抗原表位等,并对此串联基因进行克隆与原核表达。结果表明:串联重组蛋白Tasp-Tams1-Spag1属于不稳定非分泌型亲水性蛋白;编码346个氨基酸;有4个低复杂性的结构域,且含有Sorb与Btz、NL、NOT的同源区域;可能存在11个B细胞表位优势区段与17个T细胞表位优势区段,含有T、B细胞联合表位,表明Tasp-Tams1-Spag1重组蛋白可能具有良好的免疫原性。IPTG诱导重组蛋白原核表达,结果显示,该重组蛋白以包涵体形式存在;经Western blot检测,表明此串联蛋白反应原性良好,为后续深入研究免疫抗原奠定基础。     

牛瑟氏泰勒虫HSP70 cDNA片段的克隆与系统发育分析

从血液涂片检查为牛瑟氏泰勒虫阳性的病牛血液中提取总RNA,通过RT-PCR技术扩增出牛瑟氏泰勒虫HSP70基因,将其重组到pMD-18TSimple载体后进行克隆、序列测定及分析。结果表明该片段长1 966 bp,编码620个氨基酸残基,将该基因片段序列与GenBank中13种已知梨形虫的相应序列进行比较分析,牛瑟氏泰勒虫吉林分离株与已报道的牛瑟氏泰勒虫亲缘关系最近,其次是环形泰勒虫,与马巴贝斯虫亲缘关系较远。     

牛乳腺炎无乳链球菌Pgk基因抗原优势区原核表达产物的抗原性分析

为了探索牛乳腺炎无乳链球菌磷酸甘油酸激酶（Phosphoglycerate kinase,Pgk）基因编码蛋白的抗原性,根据GenBank公布的牛源无乳链球菌Pgk基因序列,设计并合成一对引物,通过PCR扩增出Pgk蛋白抗原优势区的编码序列,并对其进行克隆、测序、转化、诱导表达及抗原性鉴定。结果显示克隆的Pgk基因序列含有984 bp,编码328个氨基酸残基。临床分离株与GenBank上公布的B群无乳链球菌菌株Pgk基因（AE009948）核苷酸序列同源性为99.09%,氨基酸序列同源性为99.69%。将扩增的Pgk基因片段克隆至原核表达载体pET30a（＋）中,构建重组表达载体Pgk-pET30a（＋）,再将筛选的阳性重组质粒转化至BL21工程菌,经IPTG诱导获得部分可溶性表达Pgk重组蛋白。经Ni2＋亲和层析柱纯化得到纯度在90%以上的蛋白,经Western blot分析结果表明,重组蛋白具有良好的抗原性,为进一步探索其对奶牛的免疫原性研究奠定了良好的实验基础。     

马巴贝西虫EMA-1基因的克隆与表达

通过聚合酶链式反应扩增出体外培养的马巴西虫USDA株基因EMA-1，将该片段连接到克隆质粒载体pUC19的BamHI酶切位点上，并对其序列进行测定。结果表明该基因长度为836bp，编码的表面蛋白由272个氨基酸残基组成，与佛罗里达（Florida)株的EMA-1的氨基酸序列有95%左右的同源性，再将EMA-1基因片段插入到表达质粒载体pGE-MEX-2的BamHI位点上，并导入大肠杆菌JM109（DE3）中，经SDSPAGE分析和Western blot检测的结果表明，马巴贝西虫USDA株基因EMA-1，在大肠杆菌内获得表达，融合蛋白的分子量为65kDa。将其免疫给小鼠可产生特异性的抗马巴贝西虫抗体，且同驽巴贝西虫无交叉反应。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白在重组牛痘病毒中的表达与鉴定

为重组表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M蛋白,本研究将RT-PCR获得的PRRSV CH-1a株M蛋白基因,克隆于pMD18-T载体中,经测序鉴定正确后,亚克隆至牛痘病毒重组转移质粒pSC11中,构建了转移重组质粒pSC11-PRRSV-M。将pSC11-PRRSV-M在脂质体的介导下转染WR株牛痘病毒感染的TK-143细胞,在含有X-gal的琼脂培养基上通过蓝斑筛选含有PRRSV M基因的重组病毒rWR-PRRSV-M。Western blot与IFA检测表明,重组病毒成功表达了PRRSV M蛋白,而且所表达的蛋白保持了良好的免疫原性。动物实验表明,rWR-PRRSV-M所表达的PRRSV M蛋白在免疫小鼠体内诱生了抗PRRSV的抗体。rWR-PRRSV-M的构建,为进一步探讨PRRSV M蛋白免疫原性提供了基础数据,也为PRRS重组活载体疫苗的研究奠定了基础。     

环形泰勒虫TAMS1蛋白的生物学特性分析及多克隆抗体的制备

为了解环形泰勒虫(Ta)TAMS1蛋白(Ta-TAMS1)的生物学特性及其是否具有抗原性,本研究利用PCR技术扩增环形泰勒虫Tams1基因,得到768 bp的Tams1基因目的片段,并将其翻译成相应的蛋白,经各种生物信息学软件分析显示,Ta-TAMS1蛋白理论等电点为8.32,有30个磷酸化位点;二级结构主要由延伸链(33.59%)组成,无规则卷曲占29.69%;具有8个B细胞抗原表位,其疏水平均值为-0.75,为疏水性蛋白。构建原核表达质粒p ET-28a-Tams1并转至大肠杆菌BL21中,通过IPTG诱导获得大小约32 ku的重组融合蛋白Ta-TAMS1;western blot鉴定结果显示,该重组蛋白与环形泰勒虫阳性血清呈阳性反应,反应性较好。将纯化的融合蛋白免疫兔,制备兔多克隆抗体,经间接ELISA方法检测多抗的效价。结果显示获得了Ta-TASM1蛋白多克隆抗体,ELISA检测其效价为1.204 800。该研究为探究Ta-TAMS1蛋白的生物学功能及病原体的血清学快速检测方法奠定基础。     

羊巴贝斯虫未定种trap基因的克隆表达及反应原性分析

通过克隆trap基因,在原核表达系统中进行表达并纯化,Western blot鉴定TRAP蛋白反应原性,应用生物信息学分析软件分析验证该基因/蛋白的结构。以羊巴贝斯虫未定种新疆株gDNA和cDNA为模板扩增trap基因全长;并构建pET-30a-trap原核表达载体。将构建成功的表达载体转入BL21(DE3)pLysS进行诱导表达;纯化可溶性的rBspTRAP,Western blot分析其反应原性,并应用生物信息学分析软件分析验证该基因/蛋白的结构。结果显示:获得的trap基因全长为2 338bp,开放阅读框大小为1 944bp,具有5个内含子和6个外显子。氨基酸序列分析显示1~26位氨基酸为信号肽序列,45~201位和240~288位氨基酸分别为TRAP蛋白家族的vWA和TSP1结构域。Western blot结果显示羊巴贝斯虫未定种新疆/敦煌株阳性血清可特异性识别rBspTRAP,该重组蛋白与莫氏巴贝斯虫(临潭株、天祝株、河北株、宁县株)阳性血清及尤氏泰勒虫阳性血清无交叉反应。本试验成功克隆trap基因并表达,该基因可以作为免疫学诊断用候选抗原,为以后建立鉴别诊断莫氏巴贝斯虫和羊巴贝斯虫感染的免疫学诊断方法奠定基础。     

鸡毒支原体p24蛋白的原核表达及膜定位研究

为研究p24蛋白在鸡毒支原体中的定位，对p24基因序列进行分析，PCR扩增p24基因并构建原核表达载体，表达p24蛋白，制备多克隆兔抗血清，ELISA测定其效价，提取鸡毒支原体总蛋白、膜蛋白、胞浆蛋白通过Western blot进行亚细胞定位。结果显示：p24基因高度保守，全长576 bp,编码192个氨基酸；成功构建表达载体pCold-p24,经转化、诱导表达后获得重组蛋白rp24,大小约为35 kDa; ELISA检测兔抗rp24血清效价为1∶12 800,说明rp24蛋白具有很好的免疫原性；Western blot显示rp24蛋白在膜蛋白免疫印迹条带较亮，在胞浆蛋白中条带弱，证明p24主要分布在膜表面，是鸡毒支原体的膜蛋白。试验结果为后续基因工程疫苗研制、诊断试剂盒研发、致病机理研究奠定基础。     

环形泰勒虫TRAP-A蛋白酵母双杂交诱饵质粒的构建与鉴定

为了筛选出环形泰勒虫TRAP蛋白在虫体入侵媒介蜱唾液腺过程中相互作用蜱源蛋白,构建了能够用于酵母双杂交筛选系统的重组诱饵质粒pGBKT7-TRAP-A。本研究以环形泰勒虫裂殖体为材料,根据环形泰勒虫TRAP-A结构域的基因序列设计引物,经过PCR扩增获得576 bp的基因片段,将其连接到线性化载体pGBKT7上。经双酶切鉴定和序列分析以及重组诱饵质粒在酵母双杂交系统中的自激活、细胞毒性及其表达情况检测,结果显示,本研究成功构建了酵母双杂交重组诱饵质粒pGBKT7-TRAP-A,构建的诱饵质粒对Y2HGold酵母菌无自激活活性和细胞毒性,且构建的诱饵质粒pGBKT7-TRAP-A可以在Y2HGold酵母菌内正确表达。表明所构建的诱饵质粒pGBKT7-TRAP-A可以用于筛选小亚璃眼蜱唾液腺酵母双杂交c DNA文库,获得可能与环形泰勒虫TRAP-A蛋白相互作用的蜱源蛋白。     

马腺疫链球菌 FNE 基因的克隆及原核表达

采用 PCR 方法从马腺疫链球菌新疆分离株中扩增 FNE 基因片段,克隆至 pMD19-T 载体。利用分子生物学软件分析测序结果,将 FNE 截短基因亚克隆至原核表达载体 pET-30a 中,转化到大肠埃希菌（E．coli）BL21（DE3）感受态细胞,以 IPTG 诱导 FNE 重组蛋白的表达,用 SDS-PAGE 和 Western blot 法分析蛋白表达及其反应原性。序列分析显示,其与 GenBank 收录的马腺疫链球菌4047（登录号YP002747216）核苷酸序列和氨基酸序列同源性均为99％。采用 PCR 法扩增到675 bp 的 FNE 截短基因片段构建重组表达载体获得重组蛋白,经 SDS-PAGE 分析在46 ku 处出现明显条带,Western blot 分析显示具有反应原性。成功克隆和表达了马腺疫链球菌的 FNE 截短基因,为重组 FNE 蛋白亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

捻转血矛线虫HSP60原核表达及特性分析

根据Gen Bank公布的捻转血矛线虫热休克蛋白60(HSP60)基因序列,设计一对特异性引物,以捻转血矛线虫总RNA为模板,通过RTPCR技术扩增出一条约为1 700 bp的DNA片段,将该片段克隆到p MD19-T载体上进行序列分析,结果显示该片段长1 710 bp,编码569个氨基酸。将该基因片段亚克隆到p ET32a(+)载体上,转化大肠杆菌BL21,用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE显示,该基因成功表达,其融合蛋白分子量为80.7 ku,主要分布于菌体上清中。Western blot结果显示该重组蛋白可被人工感染捻转血矛线虫山羊血清所识别。Real-time PCR分析显示,HSP60基因在第三期幼虫和活化第三期幼虫中的相对表达量分别为1.0和0.88。本文探讨捻转血矛线虫HSP60功能奠定了基础。     

传染性法氏囊病病毒HB株VP2蛋白的表达及免疫原性测定

为了研究传染性法氏囊病病毒河北分离株(HB株)VP2蛋白的免疫原性,对VP2基因进行了表达及免疫原性测定。将传染性法氏囊病病毒HB株VP2基因亚克隆到原核表达载体pET-32a-c(+)中并对其进行了诱导表达。SDS-PAGE电泳和Western blot分析表明,表达的重组蛋白约55ku,以包涵体形式存在。重组蛋白纯化后,免疫接种6周龄Balb/c小鼠,制备的血清ELISA效价在1∶6 400以上,说明所表达的HB株VP2蛋白免疫原性良好。     

绵羊肺炎支原体内蒙古分离株DnaJ基因克隆表达及其免疫原性研究

[目的] 克隆表达绵羊肺炎支原体DnaJ基因,研究其表达产物的免疫原性。[方法] 以绵羊肺炎支原体内蒙古分离株NM03-MO株基因组DNA为模板,克隆其DnaJ基因序列,对蛋白质序列进行分析比对及三维结构预测;将该基因片段连接至pColdⅠ表达载体,构建pColdⅠ-DnaJ原核表达载体表达重组DnaJ蛋白并纯化,通过Western blot技术检测其与支原体抗体阳性血清的结合活性。[结果] NM03-MO株DnaJ蛋白序列与绵羊肺炎支原体序列同源性最高,但三维结构存在一定差异,重组DnaJ蛋白与绵羊肺炎支原体阳性血清有较好的结合活性,初步证明该蛋白具有免疫原性。[结论] 绵羊肺炎支原体DnaJ蛋白被首次成功克隆表达,且具有较好的免疫原性,为后续分子致病机制研究及新型疫苗研制奠定基础。     

环形泰勒虫表面抗原Tasp-Spag1基因串联表达及其蛋白生物信息学分析

研究环形泰勒虫表面抗原特性,以原核表达系统串联表达其表面抗原Tasp-Spag1,并对其蛋白进行生物信息学分析。通过PCR技术扩增Tasp-Spag1基因片段后构建重组质粒pET-28a-Tasp-Spag1,IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE、Western blot检测;运用生物信息学软件对Tasp-Spag1基因片段进行分析,并预测其编码蛋白的主要特性与抗原表位。结果显示,扩增得到Tasp-Spag1基因长度为729bp,原核表达后通过SDS-PAGE与Western blot检测显示,得到大小与预期分子质量相当的目的蛋白;生物信息学分析发现,此串联重组蛋白Tasp-Spag1具有236个氨基酸,属于不稳定的非分泌型、非跨膜亲水蛋白,分别具有33个与21个可能的糖基化与磷酸化位点,有三段低复杂性的结构域,并且含有Sorb、NL的同源区域,可能有10个B细胞表位优势区段与7个T细胞表位优势区段,具有两段交叉反应性表位肽。