猪瘟病毒E2基因在百脉根叶绿体基因组中定点整合载体的构建

 【目的】构建猪瘟病毒主要抗原E2基因在百脉根叶绿体基因组中定点转化载体，为百脉根叶绿体的转化及用叶绿体生产动物可直接食用疫苗奠定基础。【方法】通过用BLAST、DNAMAN等分子生物学分析软件对百脉根叶绿体基因组序列进行分析选定同源重组片段，采用PCR、分子克隆技术进行载体构建和鉴定。【结果】在百脉根叶绿体基因组中选择合适的外源基因整合位点，设计引物用PCR扩增叶绿体同源片段，将同源片段克隆后，构建百脉根特异的叶绿体转化载体；构建的百脉根叶绿体定点转化载体pAKE2以扩增的1.35 kb psbA 和1.5 kb trnK两段相邻叶绿体 DNA为定点整合外源基因的同源重组片段，包含以叶绿体基因特异强启动子Prrn和终止子TpsbA为调控序列的E2基因表达盒和aadA壮观霉素抗性基因表达盒。【结论】经PCR和酶切验证，所构建的转化载体符合预期设计。叶绿体转化及后续工作目前正在进行之中。     

水稻叶绿体表达体系的建立及抗PPT叶绿体转化植株的获得

 【目的】建立外源基因在水稻叶绿体中的表达体系。【方法】通过分析已公布的水稻叶绿体基因组全序列及其基因分布特点，选择ndhF与trnL的基因间序列作为除草剂PPT抗性基因bar定点整合的位点。以水稻叶绿体基因组DNA为模板，采用PCR方法克隆了两个适于水稻叶绿体基因组遗传转化的同源片段，构建了含水稻叶绿体16S高效表达启动子、外源基因bar、psbA基因的3′序列（终止子）以及两个同源片段的水稻叶绿体特异表达载体pRB。【结果】采用基因枪法转化水稻品种中花10号幼穗诱导的愈伤组织，并再生植株，获得转化体后代种子。对转化植株进行的分子检测结果表明，外源基因bar 可能被整合到水稻叶绿体基因组中。后代种子的遗传学分析显示，外源基因bar可正常表达并遗传。【结论】利用所建立的水稻叶绿体外源基因表达体系，外源基因bar既可在水稻叶绿体基因组中正常表达，还可作为转化体筛选时的除草剂抗性选择标记。     

水稻质体多顺反子表达载体的构建及其对烟草质体的转化

【目的】尝试水稻质体多顺反子定点整合表达载体转化到烟草质体中表达。【方法】根据已发表的相关序列，分别设计引物，通过PCR技术克隆了一系列构建水稻质体多顺反子定点整合表达载体所需的元件：质体核糖体(16S)RNA操纵元启动子（Prrn）、质体psbA基因3′端终止子（psbA3′）、氨基糖苷3′-腺苷酰基转移酶基因（aadA）、水稻质体基因组高频同源重组片段(psbC/trnG，大小3362 bp)，命名为crDNA、甘露聚糖酶基因（man）、绿荧光蛋白基因（gfp）。构建了水稻质体多顺反子定点整合表达载体pLM21(-psbC-Prrn-RBS -man-RBS-gfp-RBS-aadA-psbA3′- trnG-)。将该载体用基因枪轰击烟草叶片5枪，用添加了壮观霉素的选择分化培养基筛选。【结果】获得质体转基因烟草4株。用PCR、激光扫描和Western blot等方法检测都证实man、gfp、aadA三个基因且均得到表达，用RFLP证实表达盒整合到烟草质体基因组中。【结论】水稻质体多顺反子定点整合表达载体已整合到烟草质体基因组中，并得到表达。     

双价抗虫基因共转化烟草叶绿体的研究

 分别构建苏云金芽孢杆菌晶体毒蛋白基因 [BtCryIA(C) ]和水稻巯基蛋白酶基因 (Oryzacystatin ,OC)叶绿体转化载体 ,其中Bt基因叶绿体转化载体以烟草叶绿体基因trnH psbA trnK为同源片段 ,以水稻 (OryzasativaL .)叶绿体 psbA基因启动子和终止子为调控基因 ;OC基因叶绿体表达载体以烟草叶绿体基因片段 psbA ORF5 12为同源片段 ,以烟草叶绿体 16S启动子和终止子为调控基因 ;两载体均以壮观霉素抗性基因 (aadA)为筛选基因。利用基因枪方法 ,共转化烟草叶片 ,获得壮观霉素抗性植株。经Southern、Western检测、表达蛋白活性测定证明 ,双价抗虫基因己整合到烟草叶绿体中并得到表达。转基因植株抗棉铃虫试验表明 ,转基因植株具有显著杀虫活性     

油菜叶绿体多顺反子双交换表达载体的构建(英文)

[目的]构建甘蓝型油菜叶绿体多顺反子表达载体,以期为油菜叶绿体基因工程研究奠定基础。[方法]根据GenBank中已知的油菜叶绿体DNA序列AF267640和Z50868,设计两对引物,用PCR方法获得了两段甘蓝型油菜叶绿体DNA片段,分别命名为RbcL和ACCD。将这两段甘蓝型油菜叶绿体DNA同源片段克隆到质粒pMD18-T中得到质粒pHBM715,然后再将由壮观霉素抗性基因aadA、甘露聚糖酶基因man和绿色荧光蛋白基因gfp这3个基因串联的表达盒克隆到质粒pHBM715中,从而构建成甘蓝型油菜叶绿体多顺反子表达载体pHBM716,并将该载体在大肠杆菌中进行表达鉴定。[结果]通过平板定性分析对所构建的油菜叶绿体表达载体上的表达盒进行了功能鉴定,表明同一多顺反子的3个基因在大肠杆菌中均得到了表达。[结论]该研究成功构建了甘蓝型油菜叶绿体多顺反子表达载体,为油菜叶绿体基因工程研究奠定了基础。     

大豆BBi基因ihpRNA种子特异性表达载体的构建

【目的】构建具有大豆蛋白酶抑制剂BBi基因反向重复结构的ihpRNA种子特异性表达载体,并将其转入根癌农杆菌中,为大豆品质改良奠定基础。【方法】采用PCR技术克隆大豆蛋白酶抑制剂BBi基因的正义和反义片段、大豆种子特异性启动子7αP和作为内含子的GFP基因片段,分别连入克隆载体pMD18-T Vector中。然后根据植物中ihpRNA原理,以植物表达载体pCAMBIA1301为基础,将组成RNAi载体的4个目的片段分别连入其中,然后利用冻融法转化根癌农杆菌,并进行PCR鉴定。【结果】PCR扩增得到组成RNAi载体的4个目的片段,分别构建成重组克隆载体和ihpRNA种子特异性表达载体p7αP-GFP-BBiS,并转化得到含有p7αP-GFP-BBiS的农杆菌EHA101和EHA105。【结论】成功构建了具有BBi基因反向重复结构的ihpRNA种子特异性表达载体p7αP-GFP-BBiS,BBi基因的ihpRNA表达框架成功转入到农杆菌中。     

利用Cre/lox定位重组系统获得无选择标记GFP转基因烟草

【目的】利用Cre/lox系统具有的特异重组特性,以绿色荧光蛋白GFP为目的基因,获得无选择标记的GFP转基因烟草。【方法】将Bar基因表达盒置于两个同向lox位点之间并与GFP基因表达盒融合后获得相应植物表达载体,转化烟草后获得抗除草剂Basta的GFP转基因植株。GFP转基因植株叶盘二次转化导入重组酶Cre基因后,实现与GFP基因连锁的Bar基因表达盒剔除,剔除Bar基因的植株开花后自交使重组酶Cre基因分离,获得无选择标记的GFP转基因烟草。【结果】将含Bar基因表达盒以及GFP基因表达盒的植物表达载体转化烟草Wisconsin 38后获得了抗除草剂Basta以及GFP荧光表达的转基因植株。随机抽取5株转基因植株二次转化导入Cre基因,所获得的再生植株叶盘进行Basta的抗性检测,绝大多数单株对应叶盘在含8 mg•L-1 PPT（phosphinothricin）的筛选培养基上无法再生死亡,删除效率在76%～100%。对Bar基因删除后区域片段进行克隆测序分析显示,Bar基因表达盒已经被精确删除。Bar基因删除植株开花后自交,获得的自交后代进行NPTⅡ抗性检测,NPTⅡ敏感植株分子检测显示均只含有GFP基因。【结论】利用Cre/lox系统获得烟草无选择标记的转基因植物是稳定可行的,可广泛应用于其它无选择标记转基因植物的培育。     

开花调控基因BpMADS4无抗性表达载体的构建

为了构建含有报告基因GFP基因和BpMADS4基因的无抗性双元表达载体pCAMBIA1302-GFP-Bp,参考已发表的欧洲白桦（Betula pendula）开花调控基因（BpMADS4）序列,利用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）从欧洲白桦的幼嫩花序中克隆得到促进开花的BpMADS4基因。将该基因替换pCAMBIA1302载体中的潮霉素抗性基因,构建含有报告基因GFP基因和BpMADS4基因的无抗性双元表达载体pCAM-BIA1302-GFP-Bp。结果表明：成功构建了无抗性双元表达载体pCAMBIA1302-GFP-Bp。该表达载体在苹果遗传转化中不使用抗生素筛选,可以解决抗生素抗性筛选降低苹果转基因转化效率的问题以及转基因苹果中选择标记基因造成的生物安全性问题,用该载体转化苹果可以缩短苹果童期,有效提高其育种效率。本研究为筛选对环境安全的、具有易成花特性的苹果新种质奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点的克隆及原核表达载体的构建

 【研究目的】对猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点进行克隆和原核表达载体的构建。【方法】参考GenBank上公布的TGEV S基因A抗原位点序列,应用Primer6.0设计一对含酶切位点的引物,用于RT-PCR扩增A抗原位点目的片段,将扩增产物连接于paesy-T克隆载体上构建克隆载体,用EcoR I和Xhol I对表达载体PET-32a（+）和重组质粒进行酶切,将酶切产物亚克隆至PET-32a（+）多克隆位点上,连接、转化至BL21(DE3),构建A位点的原核表达载体,并对阳性重组质粒进行酶切、PCR和测序鉴定。【结果】所扩增的目的片段的大小为534bp,与原核表达载体连接后,经核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其它猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,说明成功地构建了TGEV S 基因A抗原位点的原核表达载体。【结论】TGEV S 基因A抗原位点原核表达载体的成功构建,填补了中国国内单独针对此位点进行研究的空白,也为TGEV诊断方法的建立提供良好的技术基础。     

番茄质体转化载体pTom-GFPaadA的构建

采用PrimStar HS DNA聚合酶从番茄基因组DNA中扩增出了质体的trnI-trnA基因序列.序列分析结果表明,所克隆的基因与GenBank公布的序列完全相同,与烟草的trnI-trnA基因序列同源性高达94%.将该片段作为定点整合外源基因的同源重组片段,构建成包含Prrn::gfp-aadA::TpsbA表达盒的番茄质体定点转化载体pTom-GFPaadA,酶切鉴定表明,所构建的载体符合预期设计.     

高羊茅春化基因RNAi表达载体的构建

[目的]用RNAi干扰技术沉默高羊茅FaVRN1。[方法]将拟南芥内肌动蛋白含子（145bp）插入到表达载体pBI121已构建能形成发夹的中间载体。设计带有限制性内切酶位点的特异性引物,扩增高羊茅春化基因351bp长的外显子靶标序列,限制性酶切后以正向和反向插入到RNA干扰中间载体内含子两端,构建带发夹结构的RNA干扰表达载体。[结果]双酶切结果表明内含子（145bp）已成功连入表达载体。PCR和酶切验证证实目的基因（351bp）已连入中间表达载体。[结论]该研究为培育RNAi转基因开花抑制型高羊茅新品种奠定基础。     

水分对高羊茅草坪质量的影响

[目的]新疆地区不同水分处理对高羊茅草坪密度、色泽、质地、均一度的影响情况.[方法]通过线性梯度灌溉,控制草坪草的灌溉量,应用水量平衡原理,研究不同水分处理对高羊茅草坪质量的影响.[结果]高羊茅草坪在B3(60;～70;FC)水分处理下可以得到较好的色泽、均一性和密度,但其质地随水分的增加呈现下降趋势,在B4(70;～80;FC)水分处理下质地评分最低.[结论]对不同水分处理下的高羊茅草坪质量进行综合评分,经方差分析发现高羊茅草坪在B3(60;～70;FC)水分处理下可满足高羊茅草坪草生长需求,达到较好的外观质量.     

草坪草高羊茅高温诱导抑制差减杂交文库的构建及其表达

为了深入研究草坪草对抗高温逆境的分子遗传机制,构建高羊茅在高温胁迫下相关的基因文库。研究以冷季型草坪草高羊茅为研究对象,在长期生理试验的基础上,通过构建高羊茅在高温胁迫下的SSH文库,挑选部分阳性克隆进行测序,并对所获得的差异基因序列进行分析,研究了在38℃/30℃(昼/夜)培养箱中进行高温胁迫6 h的高羊茅叶片和对照组高羊茅叶片的RNA差异。结果表明:试验得到的差减文库中大量组成型表达的基因已经被有效去除,使某些特有的差异基因得到了富集;两个文库的基因片段的长度分布在200~900 bp,平均片段长度约500 bp左右;在构建的高羊茅耐热cDNA文库中随机挑选了123个大小约500 bp左右的EST测序,共得到100个有效序列,其中38个是未知序列,其余62个为已报道序列,但是序列功能全部未知,这些EST中有25个与叶绿体染色体有关,其中9个与已提交的羊茅属植物叶绿体内的基因同源。本试验最终得到了合格的差减文库并对部分基因进行了测序,可为高羊茅耐热基因的研究提供依据,同时也为提高草坪草水肥调控措施提供了理论基础。     

低温胁迫对甘蔗叶绿体蛋白质及其相关基因表达的影响

【目的】从蛋白质水平和mRNA水平揭示低温胁迫对甘蔗叶绿体的影响,为探讨甘蔗抗寒机制提供参考依据。【方法】以桂糖28号（GT28,抗寒性强）和新台糖22号（ROC22,抗寒性弱）为材料,对其进行9 d、15 d和24 d不同天数的低温胁迫,以及叶绿体蛋白质电泳分析,再通过实时荧光定量PCR技术分析相关基因受低温胁迫后的表达情况。【结果】电泳分析结果表明,低温胁迫后两个甘蔗品种的蛋白质条带都随着胁迫时间的延长减弱,且ROC22的降解幅度大于桂糖28号,其中分子量为39.92 kD、32.95 kD以及22.87 kD处的蛋白条带下降较为明显。质谱分析结果发现,它们分别是ATP合酶γ亚基、放氧蛋白1和光系统II 23 kD蛋白,分别由atpC、psbO和psbP基因编码。克隆出它们的基因片段长度分别为937、996和721 bp。其中psbO基因片段是个完整的开放阅读框（ORF）,GenBank登录号为JQ898540。实时荧光定量PCR分析结果表明,psbO基因和psbP基因受低温的诱导,在胁迫15 d时达到最大;而atpC 基因受低温抑制。【结论】低温胁迫促进了叶绿体蛋白质的降解,且ROC22的降解幅度大于GT28。低温抑制atpC 基因的表达,但却诱导了psbO基因和psbP基因的表达。     

盐穗木HcGKR基因亚细胞定位表达载体的构建及定位分析

[目的]以GFP基因为报告基因,构建HcGKR基因的亚细胞定位表达载体.[方法]采用PCR方法和基因枪法.[结果]用PCR法,以pGEM- T- HcGKR质粒为模板,获得HcGKR基因的目的片段.然后将其克隆到亚细胞定位表达载体35S:GFP中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的35S - GFP - HcGKR融合表达载体,使目的基因能够和GFP融合同时表达.采用基因枪法将35S - GFP - HcGKR转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24 h后,经共聚焦显微镜观察确定发出绿色荧光的位置,对HcGKR基因进行亚细胞定位.[结论]构建的亚细胞定位表达载体可在植物细胞中表达,通过洋葱细胞中绿色荧光的位置确定目的基因定位在细胞膜上,为进一步盐穗木HcGKR基因的功能奠定了理论基础.     

玉米pTAC2影响苗期叶片叶绿素合成的转录组分析

【目的】叶绿素是参与光合途径最为重要的光合色素。叶绿体的发育及叶绿素的合成在很大程度上依赖于质体基因组与核基因组之间的双向信号传导来精确协调基因表达。通过对白化表型的CRISPR/Cas9-ZmpTAC2转基因阳性纯合突变材料进行RNA-seq研究,筛选和鉴定参与叶绿素合成的相关基因,为明确叶绿素的合成途径奠定基础。【方法】以CRISPR/Cas9-ZmpTAC2玉米转基因编辑纯合突变株系为研究材料,使用透射电镜观察叶绿体超微结构和分光光度法测定叶片叶绿素含量,确定叶绿体发育状态及叶绿素合成情况。对转基因阴性材料（CK）和CRISPR/Cas9-ZmpTAC2转基因纯合编辑材料（zmptac2）苗期叶片取样进行转录组测序。通过生物信息学分析,寻找CK与zmptac2间差异表达的基因;qRT-PCR对差异表达基因进行验证。通过酵母双杂交筛选与玉米pTAC2互作的蛋白质。【结果】共获得15株T₀转基因植株,包括绿色植株（7株）和白色植株（8株）。绿色幼苗中3株为转基因阴性材料,4株为转基因阳性（2株为未编辑,2株为杂合编辑突变）,白色植株(8株)均为转基因阳性纯合编辑。与CK相比,突变体（zmptac2）叶绿体发异常,叶绿素含量显著降低。RNA-seq的结果显示,CK与zmptac2之间共检测到1 367个基因差异表达,其中618个基因上调表达（zmptac2/CK）,749个基因下调表达（zmptac2/CK）。GO富集分析显示,下调基因显著富集到叶绿体和质体中。KEGG分析表明下调表达基因显著富集在苯丙氨酸代谢、酪氨酸代谢和异喹啉生物碱生物合成等途径。选取的15个差异基因表达模式均与测序数据相一致,表明测序结果是可靠的。与CK相比,zmptac2中依赖PEP（plastid-encoded RNA polymerase）转录的基因表达量显著降低,而依赖NEP（nuclear gene-encoded RNA polymerase）转录的基因表达量则显著上升。通过对玉米cDNA文库筛选和互作验证,鉴定出ZmpTAC3与ZmpTAC2存在互作。【结论】ZmpTAC2突变会导致叶绿体早期生物合成受阻,该基因参与叶绿体发育及叶绿素合成,且该种作用是由ZmpTAC2调控PEP相关基因表达而实现的。     

牛妊娠相关糖蛋白9(bPAG9)的真核表达及纯化

【目的】构建proEM-bPAG9重组表达载体,并在HEK293细胞中转染表达。为进一步抗体的制备和奶牛早孕诊断技术的研究奠定基础。【方法】通过基因优化和PCR法扩增得到bPAG9全基因序列,经双酶切法将bPAG9基因插入到表达载体proEM中,构建proEM-bPAG9重组载体后转到DH5α感受态细胞中,重组质粒转染至哺乳动物细胞HEK293中进行瞬时表达,再通过亲和层析纯化bPAG9重组蛋白(rbPAG9),经SDS-PAGE 和 Western Blot 检测rbPAG的表达效果。【结果】通过全基因合成法得到1 182 bp的bPAG9基因片段,构建的重组质粒proEM-bPAG9经双酶切获得约4 369 bp和1 176 bp的两条片段,与预期值相符;对重组载体测序,与优化后的基因序列完全一致,氨基酸未发生突变;SDS-PAGE 和 Western Blot 鉴定显示,获得相对分子质量约为68 kDa 的bPAG9重组蛋白,通过Ni2+亲和层析纯化后,rbPAG9纯度可达90%。【结论】通过基因优化及真核表达获得分子质量为68 kDa 的rbPAG9重组蛋白。     

草莓AP1同源基因的克隆、表达及启动子分析

【目的】从草莓（Fragaria×ananassa）中克隆APETALA1(AP1)同源基因,并分析其在不同组织、器官及不同花发育阶段的表达水平,探讨其在草莓植株成花进程中的作用。【方法】根据其它物种AP1同源基因的保守序列设计简并引物,以草莓幼叶和花芽为试材,克隆得到AP1的基因片段,在此基础上利用RACE的方法分离获得其cDNA全长。利用实时定量RT-PCR分析草莓不同组织、器官及不同花发育阶段中AP1同源基因的表达水平。利用染色体步移的方法分离启动子序列。【结果】从草莓品种‘花姬’中克隆出AP1同源基因的cDNA全长序列,命名为FaAP1;其CDS长度为735 bp,编码245个氨基酸,与玫瑰AP1-1的氨基酸序列同源性最高,达到92%,与拟南芥AtAP1的氨基酸序列同源性为64.00%。FaAP1编码的氨基酸全长序列符合MADS-box基因家族特征,包含MADS-box、I-间插域、K-box域和C-末端几个结构域,是MIKC类型的MADS-box基因家族的成员。实时定量RT-PCR结果表明,在不同组织、不同花器官及不同花发育阶段中FaAP1的表达量存在差异。其启动子除了具有TATA/CAAT-box外还包含一些特异作用元件。【结论】从草莓中分离出的FaAP1基因,在花分生组织形成和花器官发育中有一定的调控作用。