传染性胃肠炎病毒陕西分离株S基因主要抗原位点基因的克隆与序列分析

根据GenBank公布的猪传染性胃肠炎病毒S基因的序列,设计合成1对特异性引物,通过RT-PCR从用细胞增殖的TGEV病毒液中扩增编码S基因B、C抗原位点的基因片段,然后将获得的片段克隆至pMD18-T载体上,构建重组质粒。通过PCR、酶切和测序鉴定重组质粒,将测序结果与GenBank公布的21个相关序列进行多序列比较并绘制进化树。所克隆的TGEV陕西分离株S基因B、C抗原位点基因片段长度为765 bp,与参考毒株的核苷酸同源性为96.1%~99.9%。进化树分析表明,分离株与中国的H株、HN2002株、TS株,美国的Miller M60株、Miller M6株及英国的FS772株亲缘关系较近,与H株的亲缘关系最近。     

猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白基因的修饰及原核表达的研究

猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白是诱导猪产生特异性中和抗体的主要结构蛋白,包括A,B,C,D4个抗原决定位。为进一步生产TGEV植物转基因疫苗提供可操作性强、具免疫活性的外源基因,以猪传染性胃肠炎华毒弱株(TGEVH)的S基因为基础,扩增并连接4个抗原决定位相应的碱基序列,构建pPROEX-HTa原核表达载体,转化大肠杆菌诱导表达。结果表明,修饰后的S蛋白的表达量为19.8%,仍能和相应的血清发生抗原抗体反应。     

猪传染性胃肠炎病毒spike蛋白亲和肽的原核表达

【目的】原核表达猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)spike蛋白亲和肽(SQHT),检测其病毒亲和性,为建立TGEV诊断方法奠定理论和物质基础。【方法】人工合成TGEV spike蛋白亲和肽基因,亚克隆后将该基因分别插入至原核表达载体pET-32a和pGEX-6p-1中,构建重组质粒pET-32a-SQHT和pGEX-6p-SQHT,对重组质粒进行BamHⅠ单酶切和BamHⅠ/XhoⅠ双酶切及测序鉴定。将重组质粒分别转化至大肠杆菌Rosetta(DE3),用IPTG进行诱导表达,对其表达产物的生物学活性进行检测。【结果】亚克隆获得了150 bp的TGEV spike蛋白亲和肽基因。成功构建了重组质粒pET-32a-SQHT和pGEX-6p-SQHT,并诱导表达出重组蛋白TRX-SQHT和GST-SQHT,其分子质量分别为25和31 ku。Western blot分析表明,2种重组蛋白与TGEV病毒粒子具有良好的亲和性;Dot-ELISA分析表明,2种重组蛋白与TGEV病毒粒子的最低结合滴度TCID_(50)为5×10~2 mL~(-1)。特异性试验表明,重组蛋白TRX-SQHT和GST-SQHT均可与TGEV产生特异性结合,而不与猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪轮状病毒(PoRV)结合。【结论】使用原核细胞成功表达了TGEV spike蛋白亲和肽,表达的重组蛋白具有很好的TGEV特异亲和性。     

猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株N基因的克隆及原核表达

通过PCR方法扩增猪传染性胃肠炎病毒SC-Y株核衣壳蛋白(N)基因,然后将重组到pMD18-T载体中的约1174 bp的基因片段亚克隆到PET-32a( )表达载体上,通过酶切及PCR鉴定阳性的重组质粒命名为PET-N,核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其他猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,将阳性重组质粒转化BL21(DE3),经IPTG诱导可表达分子量约66 kD的融合蛋白,N基因的表达可为传染性胃肠炎病毒的诊断提供良好的物质材料。     

猪淋巴结PKR基因的克隆与体外初步表达

【目的】克隆猪淋巴结双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)基因,并在体外初步表达,为研究流感病毒感染时猪PKR与P58IPK在体内外的相互作用奠定基础。【方法】用Trizol法从猪淋巴结中提取总RNA,RT-PCR法扩增猪PKR基因的完整编码区,将该片段连接到原核表达载体pGEX-4T-1和真核表达载体pDsRed1-N1中,采用SDS-PAGE检测原核表达载体pGEX-PKR在大肠杆菌BL21中的表达情况,用脂质体转染法将真核表达载体pD-sRed1-PKR转入猪脐静脉血管内皮细胞系(SUVECs),Western blot检测其在细胞中的表达。【结果】PCR扩增得到了1 754bp的DNA片段,与预期结果一致;原核表达载体pGEX-PKR和真核表达载体pDsRed1-PKR经双酶切和核酸测序分析,表明载体构建成功;SDS-PAGE检测结果表明,pGEX-PKR重组质粒在大肠杆菌中成功表达;Westernblot检测到pDsRed1-PKR重组质粒在SUVECs中成功表达。【结论】成功克隆了猪淋巴结PKR基因,并在体外初步表达成功。     

TGEV与PEDV核衣壳蛋白双价基因原核质粒的构建与表达

运用DNA重组技术将猪传染性胃肠炎病毒核衣壳基因、猪流行性腹泻病毒核衣壳基因编码最大局部亲水性抗原决定簇基因片段进行串联,克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建预防仔猪冠状病毒性腹泻双价基因原核表达质粒.将该质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳结果显示,双价重组基因表达...     

猪传染性胃肠炎病毒S基因的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测

为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法,根据GenBank收录的TGEV-Miller毒株的S基因序列,设计合成1对特异性引物,用RT-PCR方法从疫苗株中扩增TGEV S基因的部分保守片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒作为荧光定量RT-PCR检测...     

传染性造血器官坏死病病毒CJ-13株糖蛋白的原核表达及免疫原性

【目的】克隆传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)CJ-13株糖蛋白(G蛋白)基因,构建原核表达载体,并检测其在大肠杆菌BL21中的表达情况,为IHNV诊断试剂盒和疫苗的研制奠定基础。【方法】设计1对G基因特异引物对G基因进行RT-PCR扩增,将扩增产物克隆到pGEM-T Easy载体上,构建重组质粒pGEM-T Easy-G,经双酶切鉴定、核苷酸序列分析后,将G基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体上,构建传染性造血器官坏死病病毒G基因原核表达质粒pET-32a-G,转化至宿主菌BL21中,诱导表达目的蛋白,采用SDS-PAGE、Western blot和ELISA等方法对表达产物进行分析。【结果】成功克隆了IHNV G蛋白基因,该基因长度为1 527bp。成功构建了原核表达质粒pET-32a-G,诱导表达出约76ku的产物,与预期分子质量大小相符。Western blot分析结果显示,所表达的G蛋白能够被小鼠抗IHNV血清识别。间接ELISA结果显示,小鼠抗G蛋白血清能够识别IHNV全病毒。【结论】成功构建了IHNV G蛋白原核表达系统,重组G蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。     

猪伪狂犬病毒gD蛋白抗原表位的克隆及表达

依据Gen Bank中猪伪狂犬病毒(PRV)BJ/YT株gD基因设计引物,扩增gD蛋白抗原表位,其设计扩增长度为702 bp,将扩增片段克隆到p MD19-T载体获得p MD19-T-gD。利用Bam HⅠ和HindⅢ限制性内切酶双酶切p MD19-T-gD质粒,进行琼脂糖凝胶电泳并回收酶切片段,将回收片段与原核表达载体p ET-28a连接,成功构建了p ET-28a-gD表达载体。将表达载体转化感受态细胞Rosetta,IPTG诱导表达后,进行SDS–PAGE电泳,结果显示,在25 ku处出现特异性蛋白质条带。Western blot分析结果表明,表达产物能够被PRV的阳性血清识别。综上,成功克隆并表达了gD蛋白抗原表位,且其表达产物具有较好的生物学活性。     

猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

【目的】建立一种能检测猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）含量的荧光定量RT-PCR方法,为猪传染性胃肠炎（TGE）的诊断和防治提供技术支持。【方法】根据TGEV TH98株的N基因序列设计1对特异性引物,扩增出目的片段,连接克隆载体后构建质粒标准品;对荧光定量的循环条件进行优化,建立猪传染性胃肠炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法,对其重复性、特异性进行检测,并与普通PCR检测方法进行比较,最后应用该方法对采自陕西杨凌周边的30份临床样品进行检测。【结果】成功构建了质粒标准品,建立了检测猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量RT-PCR方法,该方法特异性高、重复性好、敏感性比普通PCR检测方法高2个数量级,对质粒标准品的线性检测范围为1.0×10⁷～1.0×10¹拷贝/μL。用建立的检测方法对从陕西杨凌周边猪场采集的30份样品进行检测,检出4份阳性,与普通PCR检测方法符合率为100%。【结论】建立的TGEV荧光定量RT-PCR方法敏感性高、特异性好、省时省力,可以对猪传染性胃肠炎病毒进行快速检测。     

论从犯原因力的判断

从犯的原因力是指成立从犯所必需的因行为人的行为与其他人的犯罪行为之间产生的内在的必然联系。从犯是否成立,要经过一般性判断、具体性判断和排除性判断三个环节。一般性判断主要考虑是否具有成立从犯所要求的主观要件和客观要件,具体性判断涉及事前判断与事后判断、主观判断和客观判断、应然判断与实然判断,排除性判断主要考虑刑法分则的特殊规定和刑法总则中的但书。     

坚持依法治国与以德治国相结合的原因探析

依法治国与以德治国都是我国治国的基本方略,将二者结合运用是中国特色社会主义 法治道路鲜明的特征。法治与德治是治理国家的两个重要机制,二者相辅相成、相互渗透,德治 与法治不仅是对中国传统文化的继承发展,更是中国法治建设的必然要求。只有坚持二者有效 结合,国家才能走上良性循环发展的轨道。     

护国运动胜利因素探析

率先发生在云南的护国运动历尽艰难取得了胜利，这已是史学界公认的结论。但是护国运动胜利的因素有哪些？其历史作用怎样体现？观点不一。实际上护国运动是多种因素合力作用的结果。特别需要关注的是：在半殖民地半封建社会的中国，外国势力的客观作用应予充分重视。     

加强农业基础地位确保国家粮食安全

中国的粮食安全问题具有特殊的地位和作用.随着农业与农村经济的发展,主要农产品实现了供求基本平衡,丰年相对过剩.但是,必须清楚地认识到农业生产还将面临新的困难与新的挑战.因此,必须加强农业的基础地位,确保国家粮食安全.     

试卷标准评估体系构建研究

考试是教学工作中的一个极其重要的环节。为了加强对考试环节的监督,更好的发挥考试的指导作用、反馈作用,必须制定科学合理的试卷标准评估体系。通过对试卷标准评估体系的指标构建、实施过程进行分析,找出在考试过程中存在的问题及薄弱环节,使教师在教学过程中有针对性的进行改进,促进教学质量不断提高。     

从政治权力的合法性看执政能力建设

政治权力的合法性是执政的前提和基础,是执政能力建设的先决条件。而执政的合法性在新的时代背景下需要有新的证明。提高执政能力,增加执政绩效,增强人民的认同感,稳固合法性,其核心是保障人民根本利益的实现。     

教学学术型大学教师特征论

教学学术型大学教师的特征是指具有教学学术或教学学术水平高的大学教师区别于教学学术水平低或毫无教学学术的大学教师的独特差异或不同点,体现在教学行为和教学成就两方面,前者主要表现为富有教育知识、充满问题意识、展现教学机智和进行有效交往,后者主要表现为产生重要影响。     

论新闻自由与隐私权的平衡

新闻自由与隐私权都是宪法保护的基本权利，对现代法治社会有着极为重要的意义，但二者的冲突从来没有停止过而且也永远也不可能停止。为了对这两种基本权利进行保护，让他们能够在法律的范围内得到充分的行使，就要在二者之间达致平衡。首要的任务是确定新闻侵 犯隐私权的构成要件，其次是为新闻自由设立抗辩事由，包括新闻价值、公众人物、当事人同意、公开场合和使不可辨认。     

论虚假诉讼的刑法规制

近年来,在司法实践中出现了许多虚假诉讼的情况,行为人为了达到某些不正当的目 的,采取捏造的虚假事实和证据向法院提起诉讼,以骗取法院的裁判文书。虚假诉讼具有极大 的社会危害性,它不仅侵犯他人的合法权益,更严重的扰乱了司法秩序,长此以往,使得人们对 司法公正失去信心,从而极大的损害司法公信力。为了规制日益增多的虚假诉讼,2015 年《刑法 修正案（九）》中增设了虚假诉讼罪,并对该罪的犯罪构成、量刑幅度、单位犯罪以及同时构成他 罪和司法工作人员触犯该罪做了明确的规定。这是我国刑法首次对虚假诉讼行为进行明确的 刑法规制,使得惩处虚假诉讼行为有了确切的依据。     

民国时期农业税率辨析

长期以来,学界主流观点一直认为民国时期的农业税率极高,农民负担极重,但同时也存在与之相反的看法。各地赋税占土地收益和农户支出比例,有高有低,据之难以判断农业税率之轻重。在考察民国时期农业税率时,应注意名义赋税与实际赋税、不同阶层农民的不同赋税、不同地区的不同赋税、不同时段的不同赋税、不同考察者眼中的不同赋税等问题。总体看来,农业税率占土地收益比例因时段、地域、农户阶层不同而存在差异,它既不是低税率,也不是奇高无比,但是不可否认的是,赋税的确是农民生产和生活的一个沉重负担。