单增李斯特菌InlB的原核表达与多克隆抗体制备

为了进一步研究单增李斯特菌分泌的细菌侵袭相关蛋白内化素B(InlB)的功能,试验通过原核表达载体pET-28a分别表达InlB的N36～321和C392～630,并通过Ni~(2+)亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,纯化的蛋白免疫Balb/c小鼠,制备多克隆抗体,通过Western-blot检测单增李斯特菌InlB的表达情况。结果表明:成功构建重组表达质粒及诱导表达重组蛋白,制备的针对InlB N端和C端的多克隆抗体均能特异性检测单增李斯特菌中的InlB,但不能通过免疫荧光检测该菌表面的InlB。说明本研究制备的多克隆抗体可进一步用于研究单增李斯特菌InlB的功能。     

单增李斯特氏菌溶血素基因的克隆及原核表达

参考GenBank收录的单增李斯特菌Hly基因序列,设计1对引物,采用PCR技术扩增出单增李斯特氏菌的溶血素基因Hly(不含有信号肽部分),得到一条1590bp的条带。将其连入pMD18-T载体,经酶切、PCR鉴定和序列测定法进行鉴定。测序正确后,将该基因插入到pET-28a中构建原核表达载体pET-28a-sHly,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,将诱导产物用SDS-PAGE和Western-blot鉴定。结果显示,Hly基因可以在大肠杆菌中获得表达,表达产物分子质量约为65kU,与预期蛋白质分子质量大小一致。经Western-blotting鉴定可知,诱导表达产物以可溶形式存在,可被兔抗LM阳性血清特异识别,具有较好的抗原活性,为进一步研制基于溶解素蛋白的诊断抗原和特异性单克隆抗体,开展LM的致病与免疫机理研究奠定基础。     

黄芩提取物对单增李斯特菌溶血素的作用

为了研究黄芩提取物对单增李斯特菌溶血素(LLO)溶血活性及单增李斯特菌致病力的影响,试验采用测定最小抑菌浓度(MIC)、绘制生长曲线、分析溶血活性、蛋白免疫印迹分析和细胞毒性试验的方法分析了黄芩提取物对单增李斯特菌增殖、单增李斯特菌溶血素溶血活性和单增李斯特菌对细胞的毒性作用。结果表明:黄芩提取物可通过直接中和单增李斯特菌溶血素活性而降低溶血活性,且这一作用与黄芩提取物的抗菌活性无关;在细菌与细胞共培养体系内加入黄芩提取物可有效抑制细菌对细胞介导的细胞毒性作用。说明黄芩提取物是一种潜在的抗单增李斯特菌感染的先导化合物。     

单增李斯特氏菌ActA的原核表达与纯化

PCR扩增单增李斯特氏菌ActA基因,纯化后克隆到pMD 18T simple vector 中,以BamHI和EcoRI双酶切克隆载体pMD-18T/ActA,再将其亚克隆到表达载体pGEX-3X中,获得重组质粒 pGEX-3X/ActA,转化E.coli BL21(DE3)细胞,IPTG诱导融合蛋白(GST-ActA)表达,Western blot分析表明该蛋白可与单增李斯特氏菌多克隆抗体发生特异性反应.试验采用Glutathione Sepharose 4B亲合层析纯化融合蛋白.对单增李斯特氏菌ActA的原垓表达与纯化的研究为单增李斯特氏菌诊断试剂的研制及Acth的免疫原性研究奠定了基础.     

柔嫩艾美耳球虫表面抗原SAG2基因的克隆与表达

根据生物信息学预测的基因序列设计引物,应用RT-PCR方法从柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子总RNA扩增获得了鸡柔嫩艾美耳球虫表面抗原2(surface antigen 2,SAG2)基因序列,将其与pGEM-T easy载体连接后转化E.coliDH5α,筛选阳性克隆,以带有限制酶切位点的特异性引物用PCR方法扩增不含SAG2 N端信号肽序列的ORF序列后克隆至表达载体pET-32 a(+),构建了重组表达质粒pET-32 a(+)-SAG2,并将其转化至E.coliBL21(DE3)。经IPTG诱导,获得了SAG2重组抗原在大肠杆菌的高效表达,重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的35%,融合蛋白的分子量约为47 ku。菌体经超声处理后进行SDS-PAGE分析表明,表达蛋白以包涵体的形式存在。     

单核细胞增多性李斯特菌LMO1847基因在不同应激条件下的表达

根据GenBank登陆的单增李斯特菌标准株EGD序列设计引物,PCR扩增LM01847基因片段后插入表达载体pET-30 a,构建重组原核表达载体,并在E. coliBL21中成功表达。纯化目的蛋白制备多抗,ELISA结果显示:该蛋白多抗与单增李斯特菌全菌、全菌多抗与该蛋白均可发生反应。证明该蛋白在天然状态下存在于单增李斯特菌表面,且具有良好的免疫反应性。该蛋白在45℃、高盐、酸性环境中表达水平基本稳定,但在低pH值条件下反应活性消失;高盐或低温条件下,表达量随盐浓度的升高或温度的下降而降低。除4℃以外,该蛋白均能保持良好的免疫反应活性。本研究为建立针对该蛋白的李斯特菌免疫微球凝集、免疫磁珠分离等检测方法奠定基础。     

信号肽对溶血素在大肠杆菌中跨膜转运的影响

信号肽在引导外源蛋白的跨膜转运过程中具有重要作用。本试验通过PCR方法获得带有信号肽序列和不带有信号肽序列的溶血素基因,构建表达载体在大肠杆菌中进行诱导表达。经过溶血试验和免疫印迹试验证明缺失了信号肽的重组溶血素不能被跨膜转运至细胞外;带有信号肽的重组溶血素能够跨膜转运大肠杆菌细胞外。本试验为猪链球菌2型基因缺失弱毒疫苗的研究、细菌信号肽以及基因工程重组蛋白的可溶性表达进行了有益探索。     

单增李斯特菌lmo2193基因克隆与原核表达

为了对单增李斯特菌新疆绵羊脑炎临床分离株LM90SB2的lmo2193基因进行克隆及其原核表达,采用PCR方法扩增lmo2193基因,连接pMD19-T载体进行克隆,筛选阳性菌进行测序比对。将目的基因克隆至原核表达质粒p ET32a中,构建重组质粒pET32a-2193,并转化大肠杆菌感受态细胞,经诱导表达后,利用SDS-PAGE和Western blot鉴定重组蛋白。结果显示:扩增得到的lmo2193基因序列长度为1 077 bp,与预期一致;该基因在大肠杆菌中大量表达,经SDS-PAGE检测和Western blot鉴定分析表明该产物为1个60 ku左右的融合重组蛋白。本研究成功克隆lmo2193基因,并获得大量表达,为进一步研究lmo2193基因功能奠定基础。     

单核细胞增生李斯特菌溶血素hly基因缺失株和回补株的构建

单核细胞增生李斯特菌(简称单增李斯特菌)为革兰染色阳性菌,在人类与动物生活环境中均广泛分布,为人畜共患病原菌。李斯特菌溶血素O(LLO,由hly编码)作为李斯特菌重要毒力因子主要在细菌裂解并逃逸吞噬体中起作用,但其潜在的分子机制尚待深入解析。以单增李斯特菌EGD-e为参考菌株,通过PCR分别扩增hly基因的上、下游同源臂序列(各约500bp),选用SOE PCR方法将同源臂整合连接成融合片段。经BamHⅠ/SalⅠ酶切、连接后克隆至李斯特菌温敏型穿梭质粒pKSV7中得到重组质粒pSL081,测序验证后电转至EGD-e感受态细胞中,在温度变化及抗生素双重选择压力下筛选获得hly基因缺失株Δhly。同时,设计引物扩增含hly基因启动子和编码区序列的片段,克隆至李斯特菌整合型质粒pIMK2中得到重组质粒pSL251,测序验证后电转至缺失株Δhly感受态细胞中,经抗性筛选获得回补株CΔhly。测序结果显示,缺失株Δhly和回补株CΔhly均构建正确。利用Western blot方法检测突变株中LLO的表达情况,结果显示EGD-e和CΔhly中均能检测到LLO的正常表达,而Δhly中无法检测到,进一步证实成功构建了hly基因缺失株和回补株,为下一步深入探索LLO在李斯特菌感染过程中的生物学功能奠定了基础。     

单核细胞增多性李斯特菌hlyA基因序列及溶血素活性测定

从3株不同来源的单核细胞增多性李斯特菌中PCR扩增溶血素编码基因hlyA,连接到T克隆载体转化到受体菌DH5α中,经菌落PCR和提取质粒酶切鉴定后测序,对测定的hlyA基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分析,结果表明,从3个菌株克隆的hlyA基因具有完整的开放阅读框,同源性在96.9%以上;其推导的LLO氨基酸序列同源性在97.9%以上,N端存在相同的PEST基序,C端存在相同的保守性11肽结构.建立和运用分光光度法对3个试验菌株的溶血素活性进行了检测,结果表明,在pH5.6时LLO溶血活性最高,在pH7.0时LLO溶血活性基本丧失.本试验单核细胞增多性李斯特菌的流行病学分析和基因工程疫苗载体研究提供了依据.     

癸氧喹酯干混悬剂含量测定的改进

采用高效液相色谱法测定癸氧喹酯干混悬剂的含量,在2-250μg/mL范围内,峰面积的常用对数与进样量浓度的常用对数呈良好的线性关系,R^2=1(n=5),平均回收率为99.24%~99.51%,RSD在0.05%~0.28%。此方法分析时间短,样品前处理简便、定量结果准确,重现性好,结果满意,为其质量控制提供了依据。     

商会自治的基石——商会自治规范研究

在现代法律秩序中,商会自治规范是制定法的基础和必要的补充,甚至在某些方面替代了制定法;商会自治规范主要包括商会组织规范、行为规范、惩罚规范以及争端解决规范等;其效力仅及于其内部成员;商会自治规范和制定法之间存在冲突,但也存在整合的基础。     

猪毛色遗传的研究进展

本文概述了猪的毛色类型、猪的毛色遗传模式,着重综述了猪毛色基因分子基础的研究进展,指出存在问题并就未来发展方向做了思考。     

中华人民共和国农业部公告 第267号

为贯彻落实《兽药生产质量管理规范》(简称《兽药GMP》),进一步推动兽药GMP实施进程,我部制定了《兽药生产质量管理规范检查验收办法》,现予公告。本公告自2003年6月1日起施行。附件:兽药生产质量管理规范检查验收办法二○○三年四月十日第一章 总则 第一条 为推动《兽药生产质量管理规范》(以下简称兽药GMP)的实施,规范兽药GMP检查验收工作,制定本办法。 第二条 农业部负责全国兽药GMP管理和检查验收工作;负责制修订兽药GMP检查验收管理规定;负责兽药GMP检查员队伍建设和监督管理工作,负责国际兽药贸易中GMP互认工作。 …     

鸡败血支原体垂直传播模式及其阻断方法

以国际标准强毒Ｒ株人工感染非免疫产蛋鸡,定时扑杀,分别从鼻窦、眶下孔、气管、肺、气囊、卵巢和输卵管分离ＭＧ,并收集感染鸡所产蛋分离ＭＧ。结果表明,人工感染４８小时后上、下呼吸道及肺已被全面感染,９６小时气囊已被感染,１２０小时输卵管已能分离到ＭＧ,卵巢始终分离不到ＭＧ。人工感染鸡自１４４小时便能在其所产蛋中分离出ＭＧ。药物治疗能在７２小时内消除感染,油乳剂苗则需２４天后逐渐降低蛋内ＭＧ分离率,药物卵内注射、种蛋药浴、高温处理均能杀死卵内ＭＧ,但以研制的种蛋浸泡剂药浴效果为最好。     

Comparison of 2 methods of centesis of the bursa of the biceps brachii tendon of horses

REASONS FOR PERFORMING STUDY: Centesis of the bicipital bursa using an 8.9 cm long spinal needle has been reported but the alternative of employing a 3.8 cm long hypodermic needle requires validation. OBJECTIVE: To compare the efficacy of 2 different methods of centesis of the bicipital bursa and to evaluate the usefulness of ultrasonographic imaging to determine the location of solution administered when centesis of the bursa is attempted. METHODS: For Trial 1, 6 clinicians, who had no previous experience of centesis of the bicipital bursa, attempted to inject a solution composed of an aqueous radiopaque contrast medium and physiological saline solution (PSS) into the bicipital bursae of 2/12 horses using the previously described distal approach to inject one bursa and a proximal approach to inject the contralateral bursa. The bicipital tendon and bursa were examined ultrasonographically before and after injection; and both shoulders were examined radiographically to identify the location of the medium. In Trial 2, another 6 clinicians, also with no previous experience of centesis, repeated Trial 1, using 6 horses, but the radiopaque contrast medium was mixed with air instead of PSS. RESULTS: Accuracy of centesis using the proximal approach was 39% and that of the distal approach 28%. Ultrasonographic examination of the shoulder allowed the location of solution and air to be accurately predicted in all 12 shoulders examined. CONCLUSIONS: Clinicians who have had no previous experience performing centesis of the bicipital bursa are unlikely to be successful in centesis using either approach. Radiographic examination after injecting a radiopaque contrast medium may be necessary to assess the success of centesis especially if bursal fluid is not obtained during centesis. Injecting air along with the radiopaque contrast medium provides more accurate ultrasonographic confirmation of centesis and better radiographic definition than does injection without air.     

不同样本商品蜂蜜中硒含量的测定

用硝酸和高氯酸消化蜂蜜,使硒游离出来,在微酸性环境下,硒和2,3-二氨基萘(DAN)生成有较强荧光的物质,用环己烷萃取,在激发波长378nm,荧光波长518nm处测定其荧光强度。蜂蜜中硒含量范围:0.10～0.82μg/g。表明:蜂蜜应视为天然富硒营养品。     

乳酸杆菌益生作用机制的研究进展

乳酸杆菌作为益生菌广泛用于人和动物。本文综述了乳酸杆菌改善宿主健康的机制。乳酸杆菌可通过产生抗菌物质如乳酸、过氧化氢、细菌素,或者通过竞争营养或肠道黏附位点来抑制致病菌;通过诱导黏附素的分泌或阻止细胞凋亡而增强肠道的屏障功能,从而保护肠道。文章重点讨论了乳酸杆菌表面成分（表面蛋白、脂磷壁酸和肽聚糖）与肠道受体（Ｃ型凝集素受体、Ｔｏｌｌ样受体和 Ｎｏｄ样受体）,阐述了他们结合后启动免疫调节信号,调控肠道免疫功能以发挥改善健康作用的机制。     

Effects of size of ingestively masticated fragments of plant tissues on kinetics of digestion of NDF

Ingestively masticated fragments were collected and sized via sieving. Different sizes of esophageal masticate and ruminal digesta fragments, and ground fragments of larger masticated pieces were incubated in vitro, and undigested NDF remaining at intervals of up to 168 h of incubation was determined. The ruminal age-dependent time delay (tau) for onset of digestion of NDF was positively correlated (P < 0.004) with the mean sieve aperture estimated to retain 50% of the fragments between successive sieve apertures (MRA). Degradation rate of potentially degradable NDF (PDF) and level of indigestible NDF were not related (P > 0.10) to MRA of masticated and ground fragments. Estimates of tau were positively related to MRA, with slopes of bermudagrass < corn silage < ruminal fragments of corn silage. It was concluded that fragment size-, and consequently, ruminal age-dependent onset of PDF degradation of a mixture of different fragment sizes results in an age-dependent rate of degradation of the more rapidly degrading of two subentities of PDF. Models are proposed that assume a tau before onset of simultaneous degradation of PDF from two pools characterized as having gamma-modeled age-dependency and age-constant rates. The ruminal age-dependent pool seems to be associated with the faster-degrading pool, and its rate parameter increases with range in MRA in the population of fragments. Conceptually, the ruminal age-dependent rate parameter for PDF degradation seems to represent a composite of several effects: 1) effects of the size-dependent tau; 2) range in MRA of the population of ingestively masticated fragments; and 3) subentities of PDF that degrade via more rapid age-dependent rates compared with subentities of PDF that degrade via age-constant rates. The estimated fractional rates of ruminative comminution of ingestively masticated fragments (0.060 to 0.075/h) were of a magnitude similar to the mean fractional rates of PDF digestion (0.030 to 0.085/h), which implies that ruminative comminution may be first-limiting to fractional rate of PDF digestion. The in vivo roles of ingestive and ruminative mastication of fragments on PDF degradation must be considered in any kinetic system for estimating PDF digestion in the rumen. These results and others in the literature suggest that the rate of surface area exposure rather than intrinsic chemical attributes of PDF may be first-limiting to degradation rate of PDF in vivo.