信号肽对溶血素在大肠杆菌中跨膜转运的影响

信号肽在引导外源蛋白的跨膜转运过程中具有重要作用。本试验通过PCR方法获得带有信号肽序列和不带有信号肽序列的溶血素基因,构建表达载体在大肠杆菌中进行诱导表达。经过溶血试验和免疫印迹试验证明缺失了信号肽的重组溶血素不能被跨膜转运至细胞外;带有信号肽的重组溶血素能够跨膜转运大肠杆菌细胞外。本试验为猪链球菌2型基因缺失弱毒疫苗的研究、细菌信号肽以及基因工程重组蛋白的可溶性表达进行了有益探索。     

双点突变对猪链球菌2型溶血素活性的影响

猪链球菌2型作为一种人兽共患病病原,日益受到关注。而溶血素是其分泌的外毒素,是公认的重要毒力因子之一,具有良好的免疫原性。本试验通过PCR方法获得猪链球菌2型野生型溶血素基因sly和463、464双点突变的溶血素突变体基因slym。将sly和slym克隆至表达载体,构建了2个重组载体并在大肠杆菌中表达了野生型溶血素rSLY和突变型溶血素rSLYm。经过蛋白杂交试验,证明表达的rSLY和rSLYm与提取的猪链球菌的天然野生型SLY分子量完全一致。以提取的野生型SLY为对照,通过溶血试验证明,突变型溶血素rSLYm失去了溶血活性;通过接种PK15、RK13、SUVEC细胞单层,证明突变型溶血素rSLYm失去细胞毒性;通过小鼠试验,证明突变型SLYm对小鼠没有毒力。本试验通过溶血试验、细胞接种和小鼠实验,证明双点突变灭活了野生型溶血素的溶血活性、细胞毒性和小鼠毒力。该溶血素突变体经免疫实验证实后,可作为猪链球菌2型亚单位疫苗的候选抗原。     

布鲁氏菌抗体检测试纸条的研制和初步比较

本试验利用胶体金免疫层析技术原理,研制了布鲁氏菌抗体检测试纸条,并以布鲁氏菌阳性血清国家标准品进行了敏感性试验,确定了最低检出量,同时与有可能存在交叉反应的血清和阴性血清进行了特异性试验;然后将保存不同时间的试纸条在进行了敏感性和特异性试验,证明其稳定期可以达到15个月。选择临床牛羊血清30份,利用该试纸条与布鲁氏菌病虎红平板试验抗原进行同步检测,发现两种试剂的检测符合率为98%。试验证明,所研制的布鲁氏菌抗体检测试纸条敏感性高、特异性强、稳定期长。     

丁达尔效应定位伪狂犬病病毒密度梯度离心区带

在病毒密度梯度离心纯化过程中,利用光对不同大小粒子发生散射的强弱,即丁达尔效应,定位超速离心后形成的离心区带;以伪狂犬病毒为研究对象,以不连续梯度蔗糖为介质,超速离心后,通过光束对离心区带生的丁达尔效应进行精确分层取样,并对处理后的离心区带样品分别进行透射电镜观察,发现区带3中存在大量符合伪狂犬病病毒形态学特征的病毒颗粒。本研究将光学物理现象与经典病毒纯化方法相结合,大大提高了病毒纯化成功率,对密度梯度离心法提纯各种病毒或者蛋白的实验操作均有指导意义。     

以4单位病毒为标准物质定量新城疫病毒RT-PCR检测试剂盒的最低检出量

本实验首次以4单位病毒为标准物质,定量新城疫病毒RT-PCR检测试剂盒的最低检出量,用新城疫病毒La Sota株接种SPF鸡胚,制备尿囊液,经血凝试验测定滴度为27;将尿囊液倍比稀释后,提取各稀释度样品核酸,用新城疫病毒RT-PCR检测试剂盒进行扩增,结果多数样品均可检出特定长度的核酸。用该尿囊液制备4单位病毒为标准物质,倍比稀释后,提取各稀释度病毒核酸,对新城疫病毒RT-PCR检测试剂盒的最低检出量进行定量,结果表明该试剂盒的最低检出量为4单位病毒的1:32倍。该方法对于新城疫病毒RT-PCR检测试剂盒等分子生物学诊断试剂的研发、生产、质量控制和比对具有参考意义。     

三种感染动物阳性血清与口蹄疫病毒重组非结构蛋白的反应原性

本试验通过生物信息学技术比对分析GenBank中口蹄疫病毒(A型、O型和亚洲1型)非结构蛋白的保守序列,根据大肠杆菌密码子偏好性,优化合成了非结构蛋白基因,经过测序和转化,筛选到能够表达重组非结构蛋白的阳性重组菌株。经过Western-blot试验,证明表达的重组非结构蛋白能分别与口蹄疫病毒感染的牛、羊和猪阳性血清发生特异性反应。该重组蛋白待进一步验证后,可用于口蹄疫病毒感染动物的鉴别检测试剂盒研究。